Questo protocollo consente l'etichettatura delle singole cellule ependimogliali nel telencefalo zebrafish per consentire il loro monitoraggio a lungo termine, nonché la manipolazione di percorsi specifici in modo autonomo dalle cellule. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'etichettatura a singola cellula in modo rapido ed efficiente, così come l'editing genico e la manipolazione del percorso di segnalazione in modo autonomo alle cellule. Questo metodo consente lo studio delle domande di biologia cellulare di base, ad esempio, sulla delaminazione cellulare, sul mantenimento dell'omeostasi epiteliale e sulla simmetria della divisione cellulare.
Iniziare utilizzando un apparato di trazione dell'ago per preparare capillari di vetro. Utilizzare le punte del microloader per riempire un capillare di vetro preparato con dieci microlitri di soluzione plasmide. Quindi premere il menu cambia capillare"sul dispositivo di iniezione per consentire il caricamento dell'ago nel supporto dell'ago.
Quindi passare dal dispositivo di iniezione dal cambio capillare alla modalità di iniezione. Quindi, usando uno stereomicroscopio con un ingrandimento quattro volte superiore e le forcep Finden, tagliano solo la punta del capillare. Quindi applicare pressione sul pedale del piede per confermare che le soluzioni plasmide escono facilmente dall'ago senza impedimenti.
Quando l'ago è pronto, trasferire un zebrafish dal serbatoio di allevamento a un contenitore di soluzione anestetica. E attendere qualche minuto fino a quando il movimento delle branchie si attenua. Premere il lato dorsale del pesce sedato su una spugna pre-bagnata sotto lo stereomicroscopio, e utilizzare un microknife sezionante in acciaio inossidabile con un tagliente di 40 millimetri e uno spessore di 0,5 millimetri per creare con cura un piccolo foro nel cranio del pesce sul lato posteriore del telencefalo, proprio accanto al bordo del tectum ottico.
Inclinare il pesce se necessario e orientare la punta del capillare di vetro verso il cranio nell'angolo corretto per facilitare la penetrazione della punta capillare attraverso il foro. Quindi, inserire con molta attenzione la punta del capillare nel foro attraverso lo strato cellulare ependimale dorsale, fino a raggiungere il ventricolo telencefalico, e applicare pressione sul pedale per circa 10 secondi per fornire circa 1 microlitro della soluzione plasmide. Il successo della consegna può essere confermato osservando la diffusione del liquido verde in tutto il ventricolo.
Coprire il telencefalo di pesce con una piccola quantità di gel ad ultrasuoni. Per l'elettroporazione dell'animale plasmide iniettato, rimuovere la spugna dall'insieme di iniezione e immergere il lato interno degli elettrotipi nel gel ad ultrasuoni. Posizionare la testa del pesce tra gli elettrodi, con l'elettrodo positivo sul lato ventrale della testa e l'elettrodo negativo sul lato dorsale.
Quindi, pur tenendo ancora il corpo del pesce nella spugna, premere gli elettrodi delicatamente e precisamente contro il telencefalo e somministrare la corrente con il pedale del piede, tenendo gli elettrodi in posizione fino al termine di tutti e cinque gli impulsi. Se l'elettroporazione ha successo, le singole cellule ependimogliali etichettate con plasmide possono essere osservate tra le cellule ependimogliali etichettate non plasmide. A seconda dell'efficienza del processo di elettroporazione, può essere etichettato un numero maggiore o inferiore di cellule ependimogliali.
Tuttavia, il protocollo dimostrato produce un numero maggiore di celle etichettate rispetto ai protocolli pubblicati in precedenza. Si noti che la più alta densità di cellule etichettate tende ad emergere principalmente sul lato ventricolare interno di entrambi gli emisferi a causa del modo in cui il liquido plasmide iniettato distribuisce tra gli emisferi. In questo video, un emisfero del telencefalo zebrafish è presentato in 3D, dove le cellule ependimogliali con processi radio, sono in magenta quando osservate di lato.
Attraverso la co-elettroporazione con un altro plasmide che etichetta i nuclei, si può osservare la divisione cellulare delle cellule ependimogliali. L'elettroporazione non riuscita si traduce in un numero molto basso o in nessuna cella ependimogliale etichettata. Le cellule ependimali dorsali, tuttavia, hanno maggiori probabilità di essere etichettate.
Il loro soma è più grande in cuboide e non possiedono processi radio-allungati come evidente da una vista laterale dello strato cellulare ependimogliale. le cellule etichettate tdTomato-mem sono molto probabilmente cellule ependimali, che si trovano sopra lo strato di ependimoglia. Al contrario, l'introduzione di un tdTomato-mem che esprime plasmide alle singole cellule ependmiogliali si traduce in espressione tdTomato-mem oltre all'etichettatura iniziale delle cellule.
Le cose più importanti da ricordare sono tagliare solo la punta del capillare e penetrare nello strato ependimale durante l'iniezione in modo che il liquido si diffonda in tutto il ventricolo. Questa tecnica consente il monitoraggio a lungo termine di singole cellule ependimogliali attraverso l'imaging in vivo, e quindi stabilendo il loro ruolo nella rigenerazione cerebrale e il loro vasto legame genetico in vivo.
