Questo metodo consente di manipolare e quantificare il modo in cui le celle si organizzano collettivamente. Questo è importante perché possiamo modellare il modello in vitro e districare i segnali strettamente accoppiati in vivo. La tecnica richiede attrezzature specialistiche minime, che consentono di stabilirla in un laboratorio di biologia standard, ed è quantitativa, rendendo possibile la scoperta di eventi di patterning sub-visivo.
Questo metodo può essere facilmente applicato a qualsiasi sistema cellulare in cui potrebbe emergere la creazione di modelli e per scoprire modelli non casuali di differenziazione, proliferazione e competizione da cellula a cellula. Il principale con questo metodo è l'ottimizzazione sistematica dei parametri di micropatterning per nuovi tipi di cellule. Ad esempio, dimensione e forma del motivo, tipo di matrice e tempo di adesione delle celle.
Indossando guanti, posizionare un pezzo di pellicola da laboratorio nella parte inferiore di una piastra di Petri quadrata di 10 centimetri. Utilizzare un perforatore di 12 millimetri per tagliare gli scivoli di plastica idrofobica per creare scivolamenti di copertura da 12 millimetri e posizionare i coperchi in una nuova piastra di Petri. Utilizzare una pinzetta per rimuovere con cura la pellicola protettiva dalle scivolate di copertura.
Posizionare la maschera fotografica su una superficie pulita e stabile, il lato cromato verso l'alto e aggiungere una goccia a due microliter di acqua a doppia distillazione nella posizione del design del chip desiderato. Premere delicatamente un coperchio scivolare sulla goccia e posizionare il supporto sopra gli scivoli di plastica. Fissare con cura questo sandwich con morsetti per mantenere i pezzi di plastica a contatto con la maschera fotografica.
Posizionare l'assieme in una lampada all'ozono ultravioletto a circa due centimetri dalla sorgente luminosa per un'illuminazione di 10 minuti. Alla fine del periodo di illuminazione, afferrare il panino con la maschera fotografica nella parte inferiore e rimuovere con cura i morsetti mantenendo la pressione con una mano per evitare che le diapositive si muovano mentre smontano il panino. Quando tutti i morsetti sono stati rimossi, rimuovere il supporto, facendo attenzione che tutti i pezzi di plastica siano ancora sulla maschera e non attaccati al supporto, e aggiungere acqua doppia distillata ai trucioli per staccare delicatamente i trucioli dalla maschera fotografica.
Posizionare i trucioli con motivi fotografici all'interno della camera di deposizione della matrice, il lato illuminato verso l'alto e aggiungere 200 microlitri di soluzione di rivestimento su ciascun chip. Quindi, aggiungi una piastra di Petri di tre centimetri piena di acqua doppia distillata alla camera per limitare l'evaporazione a quattro gradi Celsius durante la notte. Per la semina di cellule embrionali sui trucioli, lavare i trucioli con due lavaggi di almeno cinque minuti in PBS fresco e sterile per lavaggio, prima di erogare una volta dieci alla quinta cella in 200 microlitri del mezzo di coltura cellulare appropriato su ciascun chip.
Quindi chiudere la camera di semina. Incubare per un'ora per consentire alle cellule di aderire ai trucioli. Quando le cellule si sono attaccate, riempire i pozzi di una piastra multiwell con 500 microlitri di mezzo caldo per pozzo e utilizzare pinzette sterili per trasferire i trucioli in singoli pozzi di piastra.
Agitare vigorosamente la piastra per staccare eventuali cellule non aderenti e sostituire immediatamente il supernatante con un mezzo fresco e caldo. Quindi controllare al microscopio per osservare se la creazione di modelli è visibile. 48 ore dopo la loro placcatura, le cellule dovrebbero formare colonie dense che seguono rigorosamente la forma dei modelli.
Lasciando i trucioli nella piastra, rimuovere tutto ma abbastanza mezzo per evitare che i trucioli si asciughi e aggiungere almeno 500 microlitri di paraformaldeide o soluzione di fissaggio a base di PFA per pozzo. Dopo dieci minuti, lavare brevemente i pozzi tre volte con soluzione di lavaggio, seguita da un lavaggio con cloruro di ammonio da 50 millimolare diluito in soluzione di lavaggio per spegnere l'attività di retiatura residua della PFA. Dopo l'ultimo lavaggio, trattare i campioni con soluzione di blocco per almeno 30 minuti.
Per l'immunostaining delle colture di chip, trasferire i trucioli in un lato della cella della camera di colorazione verso l'alto e aggiungere immediatamente 100 microlitri della soluzione anticorpale primaria di interesse per ogni chip. Dopo un'ora su una piattaforma rotante a temperatura ambiente, lavare i trucioli tre volte con la soluzione di lavaggio come dimostrato e incubare i trucioli con gli anticorpi secondari appropriati per un'ora sulla piattaforma rotante. Al termine dell'incubazione secondaria degli anticorpi, lavare i trucioli tre volte in soluzione di lavaggio e montare il chip su uno scivolo di microscopia con 20 microlitri di qualsiasi mezzo di montaggio standard.
Per immaginare i chip, regola prima la velocità di scansione, la risoluzione dell'immagine, la media dei fotogrammi e i guadagni del rilevatore per identificare un ottimale tra la qualità dell'immagine e il tempo di imaging. Quindi acquisire immagini di ogni chip. Una volta acquisite tutte le immagini, installare ed eseguire PickCells seguendo la documentazione disponibile online, creare un nuovo esperimento e importare le immagini nel programma.
Usa il modulo Nessys per segmentare i nuclei in base al segnale dell'involucro nucleare. Utilizzare il modulo di segmentazione di base per identificare il segnale di autofluorescenza del modello. Quindi fare clic su Fine" e attendere l'elaborazione di tutte le immagini.
Per creare oggetti nuclei e calcolare le feature di base degli oggetti, avviare il modulo Caratteristiche intrinseche dalla barra delle applicazioni e chiudere i pannelli Ellipsoid Fitter ed Surface Extractor per mantenere aperto solo il pannello Feature di base. Selezionate nucleus" come tipo di oggetto e selezionate il prefisso fornito per le immagini segmentate. Quindi fare clic su Calcola"e attendere l'elaborazione di tutte le immagini.
In questa fase, è necessario scrivere funzionalità aggiuntive nei nuclei prima di esportare i dati per la nostra analisi. Ad esempio, per memorizzare il nome dell'immagine a cui appartiene ogni nucleo come attributo Nucleus, fare clic su Dati"e Nuovo attributo"e selezionare nucleo"nel dialogo popup. Fare clic su OK"selezionare Raccogli dati da altri oggetti connessi al nodo"e fare clic su Avanti"Nel pannello sinistro selezionare Immagine"e fare doppio clic sul segno di interrogazione per impostare il nodo immagine come destinazione del percorso.
Espandere il riquadro Operazione di riduzione e selezionare Ottieni uno"Espandere il riquadro Attributo disponibile e selezionare l'attributo Nome. Quindi fare clic su Cambia"e avanti"Immettere il nome dell'immagine, premere TAB e fare clic su Fine"Quindi esportare i dati in un file di valori separato da tabulazioni. Per la nostra analisi, eseguire il ciclo dei dati esportati nella cartella dati della cartella R-Script.
Apri il nostro studio"e apri il modello di mappa cestinato R-Script"Quindi imposta la directory di lavoro sul percorso del file di origine ed esegui lo script per generare mappe di densità. Un'ora dopo la semina cellulare, i singoli patten di coltura cellulare potrebbero non essere completamente confluenti poiché le cellule proliferano nel tempo. Tuttavia, i modelli diventeranno completamente colonizzati con solo pochissime cellule al di fuori delle superfici adesive.
La creazione di modelli non chiari fino a due ore dopo il seeding indica un errore della procedura. Il confinamento spaziale delle cellule staminali embrionali del topo su grandi dischi o micropattern ad anello guida la creazione di una sotto-popolazione di cellule che esprimono il marcatore di brachiuria mesodermica. Ad esempio, quando le cellule staminali embrionali del topo vengono coltivate su micropattern a disco grande, le cellule positive alla brachiury sono preferenzialmente limitate alla periferia del modello in cui la densità cellulare locale è la più bassa.
Questo modello è confermato dalla mappa dell'intensità cervello-brachiury. Questi dati dimostrano che il metodo può rivelare informazioni sub-visive in quanto l'ispezione di una colonia non è sufficiente per identificare qualsiasi forma di organizzazione spaziale nel marcatore di espressione di interesse. Ciò è spiegato in particolare dall'importante variabilità colonia-colonia.
La tecnica dimostra anche che non esiste un patterning rilevabile per l'inibitore di quello che lega il DNA che può indicare che il modello T non è guidato dalla segnalazione di proteine morfogenetiche ossee in questo contesto. Ricorda sempre quale lato dello scivolo di copertura ha eliminato e rivestito e assicurati anche che le cellule abbiano aderito correttamente prima di lavare le celle in eccesso. Questo metodo consente lo studio degli spunti ambientali importanti per guidare l'auto-organizzazione delle cellule e può anche informare modelli matematici che ci aiutano meglio sotto il patterning rudimentale.
