ADH e FAD sono molecole endogene che mostrano autofluorescenza a diverse lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione. A causa del loro uso come coenzimi delle reazioni metaboliche, la microscopia a autofluorescenza può valutare il metabolismo cellulare. L'imaging a autofluorescenza di NADH e FAD non richiede etichette esogene ed è un metodo non distruttivo con risoluzione subcellulare.
La microscopia a autofluorescenza può essere utilizzata su campioni vivi e per studi di corsi temporali. L'imaging autofluorescente può essere ampiamente applicato a qualsiasi cellula o tessuto vivente. L'imaging autofluorescente è stato utilizzato su neuroni, cellule tumorali, tumori, in vivo, cellule staminali e cellule immunitarie.
A dimostrare la procedura sarà Linghao Hu, uno studente laureato del Quantitative Optical Imaging Laboratory della Texas A & M University. Inizia l'esperimento accendendo tutti i componenti del microscopio a vita a fluorescenza multifotone, compresa la sorgente laser e i rivelatori. Prima del posizionamento del campione, accendere la lampada a campo luminoso e assicurarsi che la luce entri nell'oculare.
Quindi, scegli un obiettivo per l'imaging cellulare. Se non si utilizza un obiettivo aereo, applicare una goccia del mezzo di immersione appropriato sopra l'obiettivo. Posizionare la parabola con fondo di vetro sul portacampioni sul palco del microscopio.
Quindi, centrare il campione con l'obiettivo utilizzando il controllo dello stadio X/Y Assicurarsi che il campione sia fissato e non si muova durante l'imaging. Una volta fatto, guarda nell'oculare e sposta l'obiettivo verso l'alto per mettere a fuoco le cellule. Se il microscopio si trova all'interno di un involucro, chiudere lo sportello della scatola luminosa.
Quindi, aprire il software di acquisizione delle immagini e fare clic sulla scheda Imaging multi-fotone per impostare i parametri di imaging multi-fotone come descritto nel manoscritto. Regolare il guadagno del rilevatore al valore ottimale per l'imaging a fluorescenza o FILM. Quindi, modificare il tempo di permanenza della spesa laser a ciascun pixel del campione al valore desiderato.
Per la nicotinamide adenina fosfato dinucleotide, o NADPH, impostare il laser multi-fotone a 750 nanometri. Quindi, verificare che il controllo di potenza per il laser sia impostato su zero in modo che le celle non vengano danneggiate all'apertura dell'otturatore sul laser. Impostare un filtro di emissione a 400-500 nanometri.
Quando i parametri sono impostati, iniziare a visualizzare le immagini in modo da mettere a fuoco o live-view per ottimizzare le impostazioni dell'immagine. Aumentare lentamente la potenza del laser da tre a otto milliwatt assicurandosi che le celle siano a fuoco. Una volta regolato, registra la potenza massima utilizzata.
Utilizzare l'impostazione di potenza massima registrata per l'imaging su altri segmenti della capsula di Petri. Raccogli un'immagine NADPH-FILM con un tempo di integrazione dell'immagine di 60 secondi e controlla che l'immagine abbia un numero sufficiente di fotoni, come un picco di 100 fotoni per un pixel del citoplasma all'interno della curva di decadimento della durata della fluorescenza. Se il numero di fotoni è troppo basso, aumentare la potenza del laser o la durata dell'acquisizione dell'immagine.
Per l'imaging flavin adenina dinucleotide, o FAD, impostare il laser multi-fotone su 890 nanometri e attendere che il laser si blocchi in modalità alla nuova lunghezza d'onda. Assicurarsi che il controllo di potenza per il laser sia inizialmente impostato su zero. Impostare un filtro di emissione a 500-600 nanometri.
Per ottimizzare le impostazioni dell'immagine, iniziare a visualizzare le immagini in modo focalizzato o live-view aumentando la potenza del laser da 5 a 10 milliwatt e registrando la potenza massima utilizzata. Utilizzare la stessa impostazione di alimentazione per l'imaging FAD dei campi visivi successivi. Raccogli l'immagine FAD-FILM con un tempo di integrazione dell'immagine di 60 secondi e controlla che l'immagine abbia fotoni sufficienti all'interno della curva di decadimento della durata della fluorescenza.
Se il numero di fotoni è troppo basso, aumentare la potenza del laser o la durata dell'acquisizione dell'immagine e ripetere l'imaging per altri quattro o cinque campi visivi, o FOV, con ogni immagine distanziata a due FOV di distanza. Per produrre una soluzione di cianuro di sodio 80 millimolare, sciogliere 130,24 milligrammi di cianuro di sodio in 25 millilitri di PBS. Dal piatto di coltura, aspirare 100 microlitri di terreno di coltura da sostituire con 100 microlitri di soluzione di cianuro di sodio per ottenere una concentrazione di quattro millimolari di cianuro nel piatto.
Mettere le cellule in un'incubatrice per cinque minuti per consentire alle cellule di reagire con la soluzione di cianuro. Dopo l'esposizione al cianuro, acquisire immagini NADPH e FAD delle cellule come descritto in precedenza. Lo studio ha calcolato i parametri di durata della fluorescenza utilizzando la funzione di risposta dello strumento misurato, o IRF, dall'urea.
I parametri sono stati mediati attraverso i pixel del citoplasma di ciascuna cellula utilizzata per la segmentazione. Le singole cellule sono state identificate e mascherate per eliminare il rumore di fondo. Quindi, il nucleo è stato identificato e proiettato sulla maschera cellulare.
Inoltre, le cellule sono state filtrate per rimuovere le aree mascherate che non si adattano alle dimensioni delle cellule tipiche. L'imaging a vita a fluorescenza multi-fotone di NADPH e FAD ha permesso la visualizzazione della morfologia cellulare e del metabolismo prima e dopo il trattamento con cianuro. È stato osservato che la durata del NADPH diminuisce con il trattamento con cianuro, mentre la durata della FAD aumenta dopo il trattamento con cianuro.
Il box plot rappresentativo ha indicato che il rapporto redox ottico delle cellule MCF7 è diminuito dopo il trattamento con cianuro. L'esposizione al cianuro ha ridotto la durata di vita NADPH ponderata in ampiezza delle cellule MCF7. La vita breve e lunga è diminuita per NADPH, ma è aumentata per NADPH alfa uno.
Per fad, la durata ponderata in ampiezza delle cellule MCF7 è aumentata dopo l'esposizione al cianuro. Sia la breve che la lunga durata sono aumentate per FAD, ma sono diminuite per FAD alfa uno. È importante avere abbastanza potenza laser che va ai campioni, ma ricorda, troppa potenza può causare danni alle cellule.
Poiché l'imaging ad autofluorescenza non è dannoso per le cellule, i successivi saggi biochimici possono essere utilizzati sugli stessi campioni.
