I meccanismi di aggregazione proteica sono stati finora studiati principalmente in vitro. Con il nostro protocollo possiamo fare studi quantitativi simili nell'organismo modello C.elegans. Il vantaggio principale del nostro metodo è la quantificazione imparziale dei numeri di inclusione.
E adattando questi dati di alta qualità a modelli matematici, possiamo ottenere informazioni sul meccanismo di aggregazione. L'aggregazione proteica si verifica in molte malattie, tra cui l'Alzheimer e l'Huntington. Comprendere il meccanismo molecolare dell'aggregazione proteica in vivo è fondamentale per sviluppare nuove terapie.
Inizia posizionando 10 nematodi adulti su una piastra NGM seminata di 6 cm con un plettro di verme di platino per eseguire una deposizione sincronizzata delle uova. Lasciare gli adulti a deporre le uova per circa due ore a 20 ° C prima di rimuoverle dal piatto. Posizionare le piastre con le uova nell'incubatrice a 20 C.Monitorare lo sviluppo degli animali fino a quando non raggiungono l'età adulta all'incirca il terzo giorno dopo la deposizione delle uova.
Preparare la piastra da 384 pozzetti riempiendo il numero richiesto di pozzetti con 100 L di tampone M9 integrato con 25 mM di azide di sodio come anestetico. Riempi un pozzetto per ceppo da fotografare. Per ogni ceppo, trasferire 20 animali in un pozzo utilizzando un plettro di verme di platino.
Coprire la piastra con il coperchio per evaporazione preventiva e visualizzare la piastra entro un'ora dalla preparazione. Accendere lo strumento e aprire il software. Fare clic sul pulsante Riproduci accanto a Scarica piastre di pozzo e posizionare la piastra a 384 pozzetti nel microscopio.
In Elenco azioni e Acquisizione fluorescenza 3D fare clic su Test e selezionare i worm contenenti il pozzo. Impostare Elaborazione immagini su Nessuno. E fai clic sul pulsante Riproduci per determinare la distanza di spostamento ottimale alla quale i worm sono centrati correttamente.
Impostare Distanza ascendente a 50 m, Distanza discendente a 50 m e Intervallo di taglio a 2 m per catturare l'intero spessore degli animali nella pila z. Impostare Elaborazione immagini su Massimo. Selezionare i pozzetti da visualizzare in Impostazione scansione piastra pozzo.
Quindi seleziona Affianca e acquisisci tutto bene. Salvare l'impostazione di misurazione. E fai clic su Avvia misurazione per avviare l'esperimento.
Aprire CellProfiler e trascinare la pipeline nella finestra Rilascia un file di pipeline qui. Fare clic su Sì per caricare il progetto. Quindi, trascina le immagini cucite nella finestra Rilascia file e cartella qui.
Fare clic sul modulo di input dei metadati. Regolare l'espressione regolare per estrarre dal nome del file in base ai nomi delle immagini cucite. Fare clic sul modulo di input NamesAndTypes e regolare Seleziona i criteri della regola in modo che corrispondano ai canali nei nomi dei file.
Quindi, fare clic su Impostazioni di output per selezionare una cartella in cui salvare l'output da CellProfiler. Fare clic su Avvia modalità test per verificare le impostazioni della pipeline utilizzando il primo set di dati di imaging. Fare clic su Step per eseguire la pipeline, un modulo alla volta.
Per regolare i contorni del worm, fare clic su Mostra guida nel modulo ModificaOggettimanualmente per visualizzare le istruzioni. Correggere i contorni. E quindi fare clic su Fine per continuare a eseguire la pipeline.
Fare clic su Esci dalla modalità test e analizza immagini. Aprire la cartella di output per visualizzare i file di output. E apri le immagini con il nome del file originale seguito da contorni per verificare se i worm e le inclusioni sono stati correttamente sovrapposti.
Per iniziare a utilizzare AmyloFit, assegna un nome al progetto e fai clic su Crea progetto. Fare clic su Apri per aprirlo. E crea una sessione dandogli un nome e facendo clic su Crea e carica sessione.
Clicca su Aggiungi dati e carica il file contenente il numero medio di inclusioni per animale, seguendo i requisiti di formato dei dati mostrati nel pannello di sinistra. Quindi, fai clic su Carica nuovi dati. Impostare Numero di punti su medio per offset di punto zero su 0 e Impostare Numero di punti in media su per plateau su 0 per saltare i passaggi di pre-elaborazione, che non sono necessari per i dati di conteggio dell'inclusione.
Quindi, fai clic su Invia. Ripetere questo passaggio per ogni concentrazione proteica. Selezionate Personalizzato nel pannello Modello.
Immettere l'equazione per la nucleazione indipendente nella casella Equazione. E fai clic su Carica modello. Per Ncells, impostare il tipo di parametro su Costante globale e impostare Valore su 95, corrispondente al numero di cellule muscolari della parete corporea.
Impostate i tipi di parametro su Global fit per Kcell e n. E a Costante per m. Immettete i valori di m per i diversi ceppi nel pannello di sinistra.
Lasciate invariato il numero di luppoli del bacino e fate clic su Adatta (Fit) nel pannello Raccordo (Fitting). Infine, estrai l'adattamento facendo clic su Scarica dati e Adatta. I numeri di inclusione sono stati monitorati in quattro ceppi di C.elegans che esprimono diverse concentrazioni di Q40.
Il modello di nucleazione indipendente descrive bene la cinetica di aggregazione. L'adattamento ha prodotto un ordine di reazione di 2,1 e una velocità di nucleazione di 0,38 molecole al giorno per cellula ad una concentrazione proteica intracellulare di 1 mM. Due repliche biologiche indipendenti in uno studio precedente hanno mostrato valori strettamente corrispondenti per l'ordine di reazione e la velocità di nucleazione.
Una cosa che dovrebbe essere tenuta a mente è che hai bisogno di set di dati di alta qualità per più concentrazioni di proteine per ottenere adattamenti affidabili. Questo metodo può essere utilizzato per trovare modi per interferire con l'aggregazione proteica in un organismo vivente, come abbattimenti genetici o trattamenti a piccole molecole.
