Gli endocannabinoidi sono mediatori lipidici conservati che regolano molteplici processi biologici in una varietà di organismi. I primi endocannabinoidi scoperti sono anandamide e 2-aracidonoilglicerolo, 2-AG. Il nematode C.elegans è un potente modello animale per studiare una grande varietà di processi biologici.
Recentemente, abbiamo scoperto che 2-AG svolge un ruolo fondamentale nella regolazione del traffico di colesterolo nei C.elegans. Per questo motivo è diventato imperativo progettare e ottimizzare un metodo per studiare l'endogeno 2-AG rilevando e quantificando in C.elegans. I metodi analitici precedentemente riportati per quantificare la 2-AG nei campioni biologici di solito comportano l'uso di standard deuterati acquisiti commercialmente sono tenuti a averli disponibili per l'acquisto.
Tuttavia, sono costosi e, a causa della presenza di più doppi legami, sono sensibili per ossidarsi nel tempo. La versione più comune degli standard si basa sul fatto che l'acido arachidonico ottauterato è adatto per la quantificazione per diluizione isotopica, per cromatografia liquida e spettroscopia di massa posteriore. Per superare le difficoltà associate al costo e alla stabilità degli standard deuterati per quantificare 2-AG, abbiamo utilizzato un metodo comodo e semplice per preparare uno standard analitico basato sul deuterio-5-glicerolo.
La sequenza per preparare lo standard pendeuterated richiede una procedura in tre passaggi. Essere in grado di essere conservati in forma protetta fino a quando non è necessario. L'obiettivo principale di questo lavoro è quello di mostrare un metodo completo per studiare la 2-AG in C.elegans dalla sintesi dello standard analitico deuterato alla preparazione e all'estrazione dei campioni di nematodi e, infine, l'analisi mediante cromatografia liquida e spettroscopia di massa.
Per ottenere 1-AG deuterato come standard interno deuterato per i test di quantificazione seguire un protocollo in tre gradi. Per proteggere solo gli alcoli primari, aggiungere prima 38 milligrammi di glicerolo deuterato in un tubo di reazione da 10 millilitri utilizzando una pipetta Pasteur e aggiungere un agitatore magnetico. Successivamente, aggiungere cinque millilitri di DCM anidro utilizzando una siringa Hamilton da cinque millilitri e riempire il tubo con azoto secco per dare un'atmosfera inerte.
Preparare un bagno utilizzando un pallone Dewar poco profondo riempito con acetato di etile distillato. Riempire il tubo di reazione ermeticamente chiuso all'interno del bagno e raffreddarlo lentamente aggiungendo azoto liquido all'acetato di etile fino a quando il solvente non viene congelato. Attenzione, il liquido bolle violentemente a temperatura ambiente e potrebbe causare gravi ustioni se a contatto con occhi e pelle.
Quindi, aggiungere 54 milligrammi di collidina anidra usando una siringa Hamilton. Attenzione, la collidina è volatile e ha un odore molto forte e sgradevole. A 70 milligrammi di terbutile-dimetil-cetilcloruro e mescolare tutto per tre ore a meno 78 gradi su un agitatore magnetico.
Aggiungere due millilitri di salamoia per placare la reazione. Estrarre la soluzione con due millilitri di diclorometano distillato tre volte utilizzando un imbuto separato mantenendo gli estratti organici ogni volta. Quindi, unire i tre estratti organici e asciugare sul solfito di sodio.
Purificare la miscela grezza mediante cromatografia a colonna utilizzando il gel di silice come fase stazionaria e un gradiente di acetato di esano etilico del 10% a partire dal 100% di esano e terminando con acetato di etile al 100%. Per questa fase di esterificazione, aggiungere 10 milligrammi del prodotto precedentemente dichiarato a un tubo di reazione da 10 millilitri utilizzando una pippette Pasteur e aggiungere un agitatore magnetico. Aggiungere due millilitri di DCM anidro utilizzando una siringa Hamilton da cinque millilitri e riempire il tubo con azoto secco per dare un'atmosfera inerte.
Raffreddare la soluzione a zero gradi utilizzando un bagno di ghiaccio. Ad 36 milligrammi di acido arachidonico utilizzando una micropipetta regolabile multi-volume e mescolare. Quindi, aggiungere 15 milligrammi di 40-metil-amminopiridina e mescolare.
Aggiungere 15 milligrammi di diacilpropilcarbodiimid utilizzando una micropipetta regolabile multi-volume e mescolare. Aggiungere due millilitri di acqua per spegnere la reazione e quindi estrarre la soluzione con due millilitri di DCM distillato tre volte utilizzando un imbuto di separazione. Unire i tre estratti organici e asciugare sul solfito di sodio, purificare la miscela grezza mediante cromatografia a colonna utilizzando gel di silice come fase stazionaria e quindi gradiente di acetato di esano etilico che aumenta del 100% a partire dal 100% di esano e terminando con il 50 50% di acetato di etile esano.
Infine, per la fase di deprotezione, aggiungere 15 milligrammi del prodotto precedentemente sintetizzato a un tubo di reazione da 10 millilitri utilizzando una pipetta Pasteur e aggiungere un agitatore magnetico. Aggiungere due millilitri di tetraidrofurano anidrofurano usando una siringa Hamilton da cinque millilitri e riempire il tubo con azoto secco per dare un'atmosfera inerte. Quindi raffreddare la soluzione a zero gradi utilizzando un bagno di ghiaccio.
Aggiungere 150 microlitri per quanto riguarda una soluzione molare di fluoruro di tetrabutilammonio in THF utilizzando una siringa Hamilton. Dopo un'ora, aggiungere due millilitri di acqua per placare la reazione. Estrarre la soluzione con due millilitri distillati DCM tre volte utilizzando un imbuto di separazione.
Unire i tre estratti organici e asciugare sul solfito di sodio. Per la procedura di sbiancamento, ruotare i vermi su piastre NGM di sei centimetri seminati. Lascia che il verme cresca da due a tre giorni in modo che ci siano molte uova e adulti gravidi sul piatto.
Una volta che hai molte uova e adulti, versa cinque millilitri di M9 sul piatto. Utilizzando una pipetta di vetro, trasferire i vermi in un tubo di falco da 15 millilitri. Centrifugare il tubo per due minuti a 2.000 G e pelletare i vermi.
Aspirare la maggior parte dell'M9 senza disturbare il pellet di verme. Aggiungere tre millilitri di soluzione di sbiancamento e mescolare delicatamente la soluzione invertendo per circa cinque minuti o fino a quando non si vede una diminuzione del numero di vermi adulti intatti. Una volta che la maggior parte dei corpi si è sciolta, centrifuga a 2.000 G per un minuto.
Aspirare la maggior parte della soluzione di sbiancamento senza disturbare il pellet di verme. Aggiungere 15 millilitri di M9 al tubo e mescolare bene. Centrifuga di nuovo a 2.000 G per un minuto.
Aspirare la maggior parte dell'M9 senza disturbare il pellet di verme. Per la preparazione del campione di verme, lasciare che gli embrioni N2 ottenuti con procedura di sbiancamento avessero nella notte nel tampone M9 a 20 gradi. Quindi, raccogliere L1 sincronizzati centrifugando il tubo due minuti a 2.000 G.Lavare i vermi con il buffer M9 ancora una volta e quantificare il numero di L1 vivi. Seminare circa 10.000 vermi in piastre NGM con un millilitro di OP 50 Escherichia coli precedentemente essiccato.
Incubare le piastre almeno per 48 ore a 20 gradi fino a quando i vermi raggiungono lo stadio L4. Raccogliere i vermi usando il tampone M9 freddo in un tubo di falco da 50 millilitri. Lavarli ancora una volta e trasferirli in un tubo da 1,5 millilitri.
Pellet i vermi per centrifugazione a 2.000 G per un minuto. Elimina la maggior parte del supernatante. Quindi, immergere il tubo in azoto liquido e mescolare a meno 80 gradi.
Scongelare circa 100 microlitri di pellet di vermi congelati appartenenti a N2 e quindi aggiungere 1,3 millilitri di metanolo. Dopodi tempo, sonicare il campione per quattro minuti. Dopo la sonicazione, aggiungere 1.000 ppb dello standard interno deuterato, 2,6 millilitri di cloroformio e 1,3 millilitri di 0,5 molare di cloruro di potassio, 0,08 molare di acido fosforico ad un rapporto finale di uno a uno.
Vortice i campioni per un minuto e poi sonicarli in un bagno d'acqua ad ultrasuoni per 15 minuti sul ghiaccio. Vortice i campioni di nuovo due volte per un minuto e centrifugarli per 10 minuti a 2.000 G per indurre la separazione di fase. Raccogliere la fase inferiore in un tubo di vetro pulito, asciugarla sotto azoto e rimotivarla in 100 microlitri di acetonitrile.
Per ottenere una quantificazione di successo dell'endogeno 2-AG, è stato necessario sintetizzare il suo analogo saturo usando un metodo in tre fase. Successivamente, è stato aggiunto a campioni di vermi, estratto e analizzato da cromatografia liquida ad alte prestazioni, accoppiata alla spettrometria di massa. Utilizzato come standard interno, il sintetico deuterato 1-AG era lo strumento per quantificare il metabolita endogeno.
Il metodo è stato ottimizzato utilizzando le transizioni per 2-AG e per 1-AG deuterato dove si perdono molecole di glicerolo. L'endogeno 2-AG dei campioni di C.elegans è stato rilevato e quantificato con successo mediante diluizione isotopica con la 1-AG deuterizzata chimicamente sintetizzata utilizzando cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiata alla spettrometria di massa. Il campione uno è stato preparato con lo standard deuterato 1-AG, mentre il campione due senza lo standard.
Poiché la concentrazione originale della norma deutrata nel campione uno e tre era di 1.000 ppb ciascuna, dal rapporto area di picco è possibile calcolare la concentrazione endogena di 2-AG nel campione di 340 ppb per il campione uno e 360 ppb per il terzo campione, dando una media di 350 ppb. I rapporti sono stati calcolati come qualità tra le aree di picco di 2-AG e 1-AG deuterate, rispettivamente, per due campioni isolati. Entrambi con lo standard deuterato aggiunto prima all'estrazione.
Data l'importanza recentemente scoperta di 2-AG nel miglioramento del traffico di colesterolo e la mancanza di informazioni su come i lipidi influenzano quel processo, era necessario un metodo di rilevamento affidabile per questo endocannabinoide. Il successo dello sviluppo di un metodo sintetico semplice e robusto riportato qui per ottenere 2-AG analogico deuterato è stato un passo chiave di questo protocollo. La maggior parte dei metodi segnalati per quantificare i monoacilglyceroli comportano l'uso di standard analitici disponibili in commercio, che di solito sono costosi e instabili in condizioni di conservazione regolari, rendendoli irraggiungibili per i laboratori a basso budget.
Tuttavia, questo metodo risolve questo problema proponendo una sintesi dello standard utilizzando materie prime più accessibili. Il metodo sintetico è semplice senza bisogno di condizioni sofisticate, rendendolo ideale per essere eseguito in qualsiasi laboratorio con attrezzature minime e accesso ai reagenti, anche con un budget ridotto. In sintesi, questa nuova procedura descrive un modo semplice e riproducibile di rilevare e quantificare 2-AG che aiuterà a rispondere ad alcune delle domande sollevate dopo la descrizione del ruolo di questi endocannabinoidi nel traffico di colesterolo in C.elegans.
