Questo protocollo fornisce due metodi per mobilitare i C.Elegans per eseguire l'imaging in vivo del calcio dei muscoli delle pareti del corpo. Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande relative all'omeostasi del calcio e alla manipolazione del calcio e a una sinapsi accessibile nell'organismo geneticamente trattabile. Questa tecnica può fornire una migliore comprensione dei meccanismi che regolano l'omeostasi del calcio muscolare e può, quindi, essere importante nell'identificazione di condizioni o percorsi molecolari che hanno un impatto sull'accoppiamento della contrazione dell'eccitazione attraverso l'errata regolamentazione del ciclo del calcio.
Questi metodi possono fornire informazioni sulle aree di ricerca tra cui, ma non solo, la neurobiologia, la biologia dello sviluppo e la biologia cellulare. Queste tecniche potrebbero essere adattate per studiare una varietà di tipi di cellule e C.elegans, altri nematodi correlati e larve di filsafat. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in modo che lo sperimentatore possa comprendere la tecnica di dissezione ed essere in grado di valutare con precisione i transitori di calcio da animali correttamente immobilizzati.
Inizia impostando il microscopio per l'imaging fluorescente. Utilizzare una telecamera CMOS scientifica in grado di eseguire l'imaging full frame a 100 hertz per tenere traccia dei rapidi cambiamenti nei livelli di calcio. Controlla l'acquisizione della telecamera e l'eccitazione fluorescente a LED con un software micromanager in esecuzione in ImageJ.
Utilizzare un plug-in di piattaforma elettronica opensource che si collega a una scheda microcontroller opensource esterna per gestire gli impulsi di temporizzazione esterni che controllano le eccitazioni fluorescenti. Per controllare la logica di temporizzazione, attivare il protocollo di acquisizione del micromanager nel software secondo le istruzioni dei produttori. Utilizzare due LED per stimolare la rodopsina del canale con luce blu e registrare i cambiamenti RCaMP.
Attivare la rodopsina del canale con LED am con la lunghezza d'onda di ammissione di picco di 470 nanometri e un filtro passa banda, ed eccitare RCaMP con un LED con una lunghezza d'onda di ammissione di picco di 594 nanometri e un filtro passa banda. Co-illuminare entrambi i LED e trasmettere la luce allo stesso percorso ottico utilizzando un combinatore di fascio dicroico. Controllare la temporizzazione dell'illuminazione a LED con interruttori a stato solido controllati da segnali TTL in base alle direzioni del manoscritto e impostare l'intensità del LED con gli alimentatori lineari a rumore di carico controllato di corrente, quindi programmare il protocollo di simulazione della luce blu in un simulatore.
In questo esperimento attivare la simulazione della luce blu dopo due secondi di acquisizione della sola fluorescenza RCaMP e utilizzare un treno di cinque impulsi di luce blu di due millisecondi con intervalli di 50 millisecondi per attivare la rodopsina del canale. Se si utilizza la preparazione della dissezione, eseguire la dissezione C.elegans in condizioni di scarsa illuminazione. Mettere gli animali nella piastra di dissezione con la base di coverlip rivestita in silicone che viene riempita con un millimolo di soluzione extracellulare di calcio preparato secondo le indicazioni manoscritte.
Incollare gli animali utilizzando l'adesivo liquido per la pelle topica con colorazione blu lungo il lato dorsale del verme. E fare un'incisione della cuticola laterale lungo l'interfaccia colla e verme usando aghi di vetro. Utilizzare una pipetta per la bocca per cancellare i visceri interni dalla cavità del verme, quindi incollare il lembo della cuticola dell'animale per esporre i muscoli della parete corporea mediale ventrale per l'imaging.
Se si utilizza la preparazione di nano-perline, fare una soluzione fusa 5%Agra utilizzando acqua distillata ad un volume finale di 100 millilitri. Utilizzare una pipetta Pasteur per posizionare una goccia di soluzione fusa-Agra su uno scivolo di vetro e posizionare immediatamente un secondo scivolo di vetro sopra la parte superiore utilizzando delicatamente la pressione per creare un tampone Agra uniforme. Rimuovere lo scivolo superiore e a circa quattro microlitri di nano-perline di polistirolo al centro del pad.
In condizioni di scarsa illuminazione aggiungere da quattro a sei C.elegans nella soluzione di nano-perline, assicurandosi che gli animali non giacevano uno sopra l'altro, e posizionare con cura un coverslip sopra. Quando sei pronto per l'immagine, posiziona la diapositiva preparata o la piastra di dissezione al microscopio e trova e concentrati su un verme usando l'ingrandimento 10 volte e l'illuminazione del campo luminoso fioca. Passare a 60 volte l'ingrandimento nell'eccitazione fluorescente RCaMP per identificare un muscolo ventrum mediale della parete corporea anteriore alla vulva e nel piano vocale corretto.
Quindi modificare il percorso dell'immagine dall'oculare alla fotocamera estraendo l'interruttore e facendo clic dal vivo all'interno del software di acquisizione dati. Fare clic sul pulsante ORI nel software di acquisizione dati e creare una casella intorno al muscolo su cui si sta concentrando. Sullo stimolatore, attivare il percorso di stimolazione della luce blu precedentemente programmato, quindi fare clic su Acquisisci sul software di imaging per acquisire l'immagine.
Quando i C.elegans vengono coltivati su retina completamente trans, incorporando con successo la retina e attivando la rodopsina del canale, può essere evocato un transitorio di calcio. Se gli animali non sono esposti alla retina tutta trans, non viene attivato alcun transitorio muscolare di calcio. Questo protocollo è stato utilizzato per studiare la perdita di mutanti sca-1 funzione, che hanno un impatto sulla pompa di calcio del reticolo sarcoplasmatico codificata dal gene sca-1.
Ma, la preparazione della dissezione aumenta nei livelli di base della fluorescenza RCaMP sono stati osservati nel mutante rispetto al controllo, suggerendo che la mutazione ha bisogno degli elevati livelli di calcio citoplasmatico a riposo. C'è stata una significativa diminuzione dei livelli massimi di calcio nei mutanti sca-1 rispetto al controllo. Tuttavia, non si è visto alcun cambiamento nel tempo di picco ascesa o nel tempo di mezzo decadimento.
È importante sottolineare che risultati simili possono essere osservati utilizzando la preparazione meno tecnicamente impegnativa delle nano-perline. La perdita di slo-mutanti a funzione, che interrompono i grandi canali di potassio attivati dal calcio, è stata valutata al fine di indagare i mutanti che hanno un impatto indiretto sulla manipolazione del calcio nei C.elegans. Quando sono stati misurati i livelli di base di RCaMP, i mutanti hanno mostrato una maggiore fluorescenza rispetto ai controlli.
Quando si valuta la cinetica del transitorio di calcio non sono stati osservati cambiamenti nei livelli di picco del calcio. I mutanti slo-1(ad esempio142), tuttavia, mostrarono un aumento significativamente aumentato del tempo di picco. Il passo più importante da ricordare quando si completa la procedura è quello di preparare animali da esperimento in retina tutta trans.
Senza questo passaggio la rodopsina del canale sarà inattiva, impedendo l'attivazione di transitori di calcio indotti dalla luce. Seguendo questa procedura, l'elettrofisiologia e l'analisi comportamentale possono essere fatte per valutare l'impatto funzionale di eventuali cambiamenti osservati nell'omeostasi del calcio. Utilizzando i metodi di immobilizzazione qui delineati, apre la strada a ulteriori esplorazioni della dinamica del calcio e dimostra che risultati comparabili possono essere osservati in risposta alla stimolazione neuronale optogenetica e alla cattura di transitori di calcio muscolare utilizzando la tecnica di immobilizzazione delle perline molto meno impegnativa.
