Il nostro protocollo è significativo perché consente l'efficiente produzione su larga scala di sferoidi tissutali omogenei, che sono fondamentali per le nostre applicazioni avanzate di ingegneria tissutale, sviluppo di farmaci e modellazione delle malattie. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua capacità di produrre grandi quantità di sferoidi di tessuto uniformi in modo rapido ed economico, garantisce l'elevata vitalità cellulare e la qualità degli sferoidi consistenti, che è fondamentale per le nostre varie applicazioni biomediche. Producendo steroidi specifici per il paziente, questa tecnica offre un modello fisiologicamente accurato, consentendo una modellazione precisa della malattia e la comprensione dei meccanismi molecolari e comportamentali, compreso il cancro. Questo metodo può fornire informazioni sulla ricerca sul cancro, sulle malattie neurodegenerative e sull'ingegneria tissutale e può essere applicato allo sviluppo di farmaci e alla medicina personalizzata, migliorando la nostra comprensione di vari sistemi biologici.
La nostra dimostrazione della visione è fondamentale in quanto illustra chiaramente passaggi intricati, come l'inserimento del dispositivo e la semina cellulare, aiutando a prevenire gli errori comuni e garantendo che la tecnica corretta sia un cuscinetto per risultati coerenti. Inizia aggiungendo la polvere di agarosio in un x PBS per preparare il gel di agarosio al 2% in un contenitore di vetro. Omogeneizzare la sospensione con movimenti circolari.
Metti il contenitore di vetro in un forno a microonde e imposta il tempo su 30 secondi. Arrestare il microonde ogni cinque secondi, rimuovere la bottiglia di vetro e omogeneizzare manualmente la soluzione con movimenti circolari. Eseguire il processo di riscaldamento, fino a quando la soluzione raggiunge uno stato liquido limpido.
Quindi, aggiungi sei millilitri di soluzione di agarosio a ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti e attendi 15 minuti o fino a quando l'agarosio non si solidifica. Quindi inserire delicatamente il dispositivo bio stampato in 3D sopra l'agarosio liquido e attendere 30 minuti o fino a quando l'agarosio non si solidifica. Quindi rimuovere delicatamente il dispositivo dall'agarosio e aggiungere due millilitri di terreno DMEM.
Attendere 10 minuti prima di eliminare il supporto e sostituirlo con un nuovo DMEM. Ripetere il lavaggio tre volte. Una volta fatto, aggiungere due millilitri di DMEM e posizionare la piastra a sei pozzetti per la semina cellulare a 37 gradi Celsius in un incubatore con il 5% di anidride carbonica e l'80% di umidità.
Far crescere le cellule di fibroblasti di topo in fiasche di coltura cellulare e mantenerle a 37 gradi Celsius in un incubatore con il 5% di anidride carbonica, fino a raggiungere l'80% di confluenza. Quindi lavare le cellule con un x PBS e aggiungere l'enzima di dissociazione. Incubare le cellule per due-cinque minuti a 37 gradi Celsius in 5% di anidride carbonica e 80% di umidità.
Una volta che le cellule sono state staccate dal pallone di coltura cellulare, aggiungere un terreno di coltura per neutralizzare l'enzima di dissociazione cellulare. Centrifugare la sospensione cellulare a 400 G per cinque minuti a temperatura ambiente e contare le cellule. A 50 volte 10 alla potenza di cinque cellule prese in una provetta, aggiungere cinque millilitri di un x PBS.
Quindi, centrifugare la sospensione cellulare a 400 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante utilizzando una pipetta prima di aggiungere un millilitro del terreno di coltura cellulare e omogeneizzare la soluzione. Dalla piastra a sei pozzetti preparata in precedenza, rimuovere due millilitri di terreno e aggiungere un millilitro della sospensione cellulare al centro dello stampo di agarosio formato dal dispositivo bio stampato in 3D.
Attendere da 20 a 30 minuti affinché le cellule sedimentino nelle micro resezioni prima di aggiungere un millilitro di terreno di coltura cellulare nel pozzetto. Posizionare la piastra a sei pozzetti nell'incubatore a 37 gradi Celsius per circa 24-48 ore per la formazione di sferoidi tissutali. Il dispositivo simile a un timbro stampato in 3D composto da micro pin cilindrici è stato prodotto con successo con il metodo della stereolitografia utilizzando una resina fotopolimerizzabile.
Il dispositivo era semplice, facile da sterilizzare, riutilizzabile e adattabile a piastre a pozzetti di diverse dimensioni e piastre di Petri. Ha generato 750 pozzetti di microresezione omogenei o 4.716 per piastre a sei pozzetti. Il ritiro anticipato del dispositivo dalla piastra ha interrotto lo stampo non aderente e ha deformato la geometria di micro resezione.
Le cellule seminate sulle muffe di agarosio non aderenti si sono sedimentate e hanno formato gli sferoidi tissutali circa dopo 24 ore. Questa metodologia ha dimostrato con successo la produzione su larga scala degli sferoidi mantenendo la loro forma, dimensione e vitalità e ha supportato la coltura di steroidi per mesi. La cosa più importante da ricordare quando penso a questa procedura è inserire con cura il dispositivo per evitare bolle d'aria e aggiungere delicatamente il terreno di coltura per evitare di disturbare le cellule.
A seguito di questa procedura, è possibile eseguire test antidroga e analisi dell'espressione genica. Rispondere a domande sull'efficacia dei farmaci, sulla risposta sapida e genetica ai trattamenti. Questa tecnica consentirà nuove ricerche nell'ingegneria tissutale e nella medicina rigenerativa, consentendo la produzione di sferoidi su larga scala e di alta qualità, fondamentali per la bio-stampa 3D, e migliorerà la qualità e la quantità delle cellule per i test di tossicità farmaceutica e cosmetica.
