Il supporto stampato in 3D utilizzato in questo protocollo ci consente di monitorare la segnalazione cellulare a breve termine e gli eventi di migrazione cellulare a lungo termine nelle cornee ferite in tempo reale. Mantenendo il globo intatto, vitale e immobile, questo protocollo produce immagini live di alta qualità delle cellule corneali, inclusi l'epitelio e i nervi. Il supporto stampato in 3D potrebbe essere facilmente modificato per globi di varie dimensioni e specie.
Possiamo anche orientare gli occhi in modo diverso per visualizzare altre regioni o eseguire esperimenti di nano indentazione. Per iniziare, dopo aver rimosso la testa di un topo eutanasiato, posizionarlo immediatamente sul ghiaccio per preservare la vitalità del tessuto. Quindi enucleare i globi appiandolo, usando una pinzetta.
E tagliare il nervo ottico usando le forbici da dissezione appena sotto dove è tenuto dalle pinzette. Incubare i globi in due millilitri del mezzo in un piatto di coltura cellulare P-35, incluso un indicatore di calcio e / o una macchia di membrana cellulare per un'ora in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica in condizioni di scarsa illuminazione, assicurando che i globi siano immersi nel mezzo di colorazione per una colorazione uniforme. Per far aderire i supporti a una linguetta di copertura inferiore in vetro pulito, lavare il supporto in etanolo al 70% e posizionare la colla sul supporto.
Quindi, far aderire il supporto alla linguetta del coperchio inferiore in vetro, assicurandosi che non ci sia colla all'interno dell'area interna del supporto, poiché la colla può fluoresce, complicando l'imaging. Dopo che la colla si è solidificata, verificare che il supporto sia saldamente contro il vetrino di copertura. Rimuovere i globi dalla soluzione colorante utilizzando i contagocce sterili, avendo cura di prevenire danni tissutali alla regione di interesse.
Lavare i globi per cinque minuti a temperatura ambiente, utilizzando soluzione salina tamponata con fosfato sterile per rimuovere la macchia in eccesso e posizionare i globi nel mezzo per il trasporto al microscopio. Per avvolgere i globi usando un ago sterile di calibro 25 nella regione di interesse, raccogliere e tenere il globo dalla parte posteriore dell'occhio, usando un contagocce sterile per mantenere stabile il globo e impedirgli di rotolare. Per una ferita da graffio, spostare delicatamente un ago sterile da 25 gauge attraverso la cornea esposta o premere delicatamente l'ago direttamente nella cornea centrale per una ferita da puntura, assicurandosi che la ferita non penetri la membrana basale corneale.
Posizionare la cornea o la regione limbare sul vetrino nella zona interna del supporto, confermando che il globo sia posizionato correttamente e che il sito di interesse sia in contatto con il vetrino di copertura. Stabilizzare utilizzando la copertina stampata in 3D aderente al supporto, utilizzando la colla. E non cercare di rimuovere il globo, in quanto ciò potrebbe causare danni ai tessuti.
Accendere il microscopio e impostare la camera ambientale a 35 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica e verificare la camera umidificata. Posizionare il portavetrino e il globo stabilizzato sul palco del microscopio all'interno della camera ambientale e dell'immagine, utilizzando tecniche di imaging cellulare dal vivo. Mediante vet, ulteriori mezzi di crescita sul vetrino di copertura per prevenire la disidratazione e mantenere la vitalità dei tessuti, assicurando che ci sia abbastanza terreno nel pozzo per coprire il globo nel supporto.
Iniziare gli esperimenti utilizzando tecniche di imaging di cellule vive, utilizzando impostazioni laser a bassa potenza per preservare il tessuto e prevenire danni ai tessuti e obiettivi appropriati per esperimenti di lunga durata. Registra e salva i dati nel formato di file preferito dei file CZI per la registrazione dei dati. Dati di imaging di alta qualità della struttura multistrato sono stati ottenuti per la cornea X vivo, stabilizzata con un supporto stampato in 3D, dimostrando eventi di segnalazione del calcio negli strati apicale, basale e stromale della cornea.
Sono state ottenute immagini Z-stack di una cornea, immobilizzata nel supporto stampato in 3D, in una ferita da graffio per visualizzare le membrane cellulari e la segnalazione del calcio attraverso gli strati della cornea e la mobilizzazione del calcio in diversi piani Z. È stato eseguito un esperimento di serie temporali di una cornea per studiare la migrazione cellulare nel letto della ferita durante la risposta di guarigione, rivelando poco movimento del globo nelle direzioni X, Y o Z. È stato osservato che posizionando il globo nel supporto, è possibile visualizzare diverse regioni della cornea, sia nella regione limbare centrale che in quella corneale.
Questo protocollo ci consente di visualizzare gli occhi da modelli di malattia che mostrano differenze nella guarigione delle ferite. Possiamo caratterizzare le aberrazioni nella segnalazione cellulare e la motilità nei tessuti vivi.
