Produzione di nanoparticelle lipidiche caricate con siRNA utilizzando un dispositivo microfluidico

La dimensione delle nanoparticelle lipidiche influisce sulla biodistribuzione, sull'effetto antitumorale e sulle prestazioni di silenziamento genico. Pertanto, il metodo di controllo delle dimensioni LNP è una tecnica efficace per la produzione di nano farmaci, compresi i sistemi di rilascio dell'RNA. Questo dispositivo microfluidico originale, chiamato dispositivo iLiNP, era in grado di controllare le dimensioni LNP che vanno da 20 a 100 nanometri a intervalli di 10 nanometri.

Il dispositivo iLiNP può produrre non solo LNP caricati con siRNA, ma anche LNPS caricati con mRNA e LNP caricati con ribonucleoproteine. Per iniziare, prendere le soluzioni lipidiche di etanolo e produrre gli LNP caricati con siRNA mescolando DOTAP, DSPC, colesterolo e soluzioni DMG-PEG2k in un rapporto molare da 50 a 10 a 38,5 a 1,5. Regolare la concentrazione lipidica totale a otto millimolari.

Quindi prendere le soluzioni acquose di 154 millimolari soluzione salina e 25 millimolari tampone di acetato a pH 4 e filtrarle attraverso filtri a membrana da 0,2 micrometri o filtri a siringa. Preparare la soluzione tampone di siRNA sciogliendo 70 microgrammi di siGL4 in un millilitro di tampone di acetato da 25 millimolari. Riempire una siringa di vetro da un millilitro con soluzioni lipidiche e acquose, rispettivamente.

Collegare le siringhe di vetro ai capillari di picco utilizzando connettori a siringa, quindi impostare la portata delle soluzioni lipidiche e acquose e introdurre le soluzioni lipidiche e acquose separatamente nel dispositivo iLiNP utilizzando pompe a siringa. Raccogliere le sospensioni LNP in un microtubo dall'uscita del dispositivo iLiNP. Dializzare la sospensione di LNP utilizzando una membrana di dialisi da 12 a 14 kiloDalton di peso molecolare a quattro gradi Celsius durante la notte contro soluzione salina o DPBS per POPC LNP e LNP caricati con siRNA, rispettivamente.

Raccogliere le sospensioni LNP dializzate in microtubi e quindi pipettare da 20 a 30 microlitri della sospensione LNP in una micro cella al quarzo. Infine, misurare la dimensione LNP, la distribuzione delle dimensioni LNP e l'indice di polidisperibilità mediante diffusione dinamica della luce. La distribuzione dimensionale POPC LNP prodotta in diverse condizioni di flusso, come la portata totale e i rapporti di portata sono mostrati qui.

Le dimensioni LNP precise che vanno da 20 a 100 nanometri possono essere controllate utilizzando questo dispositivo iLiNP. Gli LNP di piccole dimensioni si formano in condizioni di portata totale elevata. Inoltre, le dimensioni LNP che si formano al FRR 5 sono più piccole di quelle del FRR 3, indipendentemente dalla portata totale.

La distribuzione dimensionale degli LNP caricati con siRNA è mostrata qui. I siRNA sono incapsulati negli LNP dall'interazione elettrostatica tra il lipide cationico DOTAP e i siRNA caricati negativamente. Il dispositivo iLiNP ha prodotto LNP cationici caricati con siRNA a 90 nanometri con una distribuzione ristretta.

L'efficienza di incapsulamento del siRNA è stata del 95% a causa dell'interazione elettrostatica tra il lipide cationico e i siRNA caricati negativamente. Sono state valutate la citotossicità e l'attività di silenziamento genico dei LNP caricati con siRNA a 19 nanometri. Gli LNP caricati con siRNA hanno mostrato citotossicità alla dose di 10-100 siRNA nanomolari.

Il livello di espressione della luciferasi è diminuito a seconda della concentrazione di siRNA. Gli LNP caricati con siRNA hanno soppresso l'espressione dell'80% di luciferasi alla dose di 100 siRNA nanomolari. Le ottimizzazioni delle condizioni di flusso sono i passaggi più importanti nel protocollo per ottenere le dimensioni desiderate LNP.

Il metodo di produzione LNP basato su microfluidico, incluso il dispositivo iLiNP, non richiede alcuna procedura complicata e dovrebbe essere utilizzato come metodo di produzione LNP standard.