Il nostro protocollo descrive l'allevamento, la manutenzione, la dissezione e l'elaborazione del campione dell'unico modello murino immunocompetente, GIST, attualmente in uso. Speriamo che i futuri ricercatori saranno in grado di utilizzare questo modello murino al fine di promuovere la ricerca traslazionale in GIST. Le terapie tradizionali in GIST prevedono una terapia molecolare mirata con inibitori della tirosin-chinasi.
Questo modello consente ai ricercatori di testare le immunoterapie in GIST. Per iniziare, sterilizzare tutti gli strumenti, indossare guanti durante la procedura e mantenere un campo sterile. Preparare l'area di incisione con etanolo al 70%.
Usando le forbici, fai un'incisione verticale della linea mediana di due centimetri ed entra nella cavità addominale. Lisare bruscamente eventuali aderenze intra-addominali. Per rimuovere il linfonodo mesenterico drenante, identificare il cieco e sollevare il suo mesentere in modo superiore.
Approssimativamente a metà strada verso la base del mesentere del colon, identificare il linfonodo mesenterico e sezionarlo bruscamente. Se necessario, dividere il tessuto linfonodale in terzi per l'isolamento proteico, l'istologia e la sospensione a singola cellula. Posizionare il tessuto linfonodale in 20 millilitri di mezzo RPMI per sospensioni monocellulari e mantenere sul ghiaccio.
Il cieco è per lo più sostituito da un GIST nei topi Kit558. Per l'isolamento del GIST e del cieco, dividere attentamente la giunzione ileocolica dalla base del tumore. Quindi, dividere nuovamente il cieco, due centimetri distali alla base del tumore.
Nel 50-60% dei topi Kit558, la testa del tumore contiene un cappuccio di tessuto cecale, che in genere contiene liquido sieroso, ma raramente può contenere pus. Sezionare bruscamente il tessuto del cappuccio lontano dal tessuto tumorale. Dividere il tessuto tumorale e il cieco in terzi per l'isolamento proteico, l'istologia e la sospensione unicellulare.
Per le sospensioni monocellulari, posizionare il tessuto tumorale o il cieco in HBSS con il 2% di FCS, sufficiente per coprire il campione e mantenere il ghiaccio. Versare il mezzo RPMI con il campione linfonodale su un filtro di 100 micrometri. Spostare il filtro su una nuova conica da 50 millilitri e schiacciare il linfonodo con l'estremità morbida di una siringa di plastica da tre millilitri.
Filtro di lavaggio con 20 millilitri di supporti RPMI. Centrifugare i campioni e aspirare il surnatante. Risospesso il pellet in 20 millilitri di tampone perline e versare su un filtro da 40 micrometri.
Raccogliere il filtrato cellulare. Conta le cellule usando un emocitometro. Centrifugare i campioni ed eliminare il surnatante.
Quindi, sospendere nuovamente il tampone per le perline per la citometria a flusso. Preparare il tampone di collagenasi come descritto nel manoscritto di testo. Mettere GIST in un piatto sterile e aggiungere 2,5 millilitri di tampone di collagenasi.
Usando un bisturi sterile e forbici, tritare il tumore fino a quando non è in frammenti fini. Utilizzare una pipetta di grandi dimensioni per aspirare il tumore e la collagenasi in un tubo da 50 millilitri. Incubarlo a 37 gradi Celsius per 30 minuti a 100 rotazioni al minuto, quindi spegnere la reazione con due millilitri di FBS.
Versare la collagenasi con il campione GIST su un filtro da 100 micrometri e schiacciare il tumore con l'estremità morbida di una siringa di plastica da tre millilitri e raccogliere in un tubo da 50 millilitri. Filtro di lavaggio con 20 millilitri di HBSS. Centrifugare il filtrato a 450 RCF per cinque minuti a quattro gradi Celsius, quindi scartare il surnatante.
Risospesso il pellet in 20 millilitri di tampone perline e versare su un filtro da 40 micrometri Raccogliere il filtrato e contare le celle utilizzando un emocitometro. Centrifugare e aspirare il surnatante, quindi risospendere nel tampone perline per la citometria a flusso. Usando le forbici, dividere il cieco longitudinalmente per esporre la mucosa interna.
Taglialo in sezioni da 0,5 centimetri e mettilo in un tubo da 50 millilitri con cinque millilitri di HBSS e 2% FBS. Agitare energicamente per 30 secondi e centrifugare a 450 RCF per 20 secondi. Quindi, scartare il surnatante.
Aggiungere da cinque a 20 millilitri di HBSS con EDTA a due millimolari. Incubarlo a 37 gradi Celsius a 100 rotazioni al minuto per 15 minuti. Centrifugare e scartare il surnatante, quindi risospescere il pellet in cinque-20 millilitri di HBSS.
Agitare vigorosamente la miscela per 30 secondi, quindi centrifugare a 450 RCF per 20 secondi ed eliminare il surnatante. Ripeti questo processo ancora una volta. Risospendare il pellet in cinque millilitri di tampone di collagenasi, quindi incubarlo a 37 gradi Celsius per 30 minuti a 100 rotazioni al minuto.
Agitare vigorosamente ogni 10 minuti e spegnere la reazione con due millilitri di FBS. Versare la collagenasi con il campione di cieco su un filtro di 100 micrometri e schiacciare con l'estremità morbida di una siringa di plastica da tre millilitri. Lavare il filtro con 20 millilitri di HBSS e raccogliere il filtrato.
Centrifugare e scartare il surnatante. Risospesso il pellet in 20 millilitri di tampone perline e versare su un filtro da 40 micrometri. Raccogliere filtrare e contare le cellule utilizzando un emocitometro.
Ripetere ancora una volta il processo di centrifugazione e risospesciare il pellet nel tampone perline per la citometria a flusso. I topi Kit558 hanno avuto una durata media di otto mesi a causa dell'ostruzione intestinale progressiva. I tumori dei topi Kit558 hanno espresso marcatori canonici di GIST, tra cui il KIT tirosin-chinasico, il canale transmembrana Dog1 e il fattore di trascrizione ETV1.
I tumori sono stati studiati per i cambiamenti nella via di segnalazione KIT come i marcatori a valle ERK e AKT o il microambiente immunitario, che imitava da vicino il GIST umano. La risonanza magnetica o la TC sono state utilizzate per tracciare il volume del tumore come misurazione accurata della risposta tumorale. Sezionare il tumore lontano dalla giunzione ileocolica e lontano dal cappuccio cecale è importante per catturare il vero peso del tumore e l'analisi immunitaria e molecolare.
All'interno del GIST, questo modello ha permesso lo studio del microambiente tumorale, nonché delle immunoterapie.
