Questa ricerca è stata sostenuta da Deutsche ausgewiesenen (gruppo di Eder Max per AN: 110972), una borsa di tesi di dottorato di DGVS (di SMB) e una borsa di Studio Fondazione Fresenius-Else-Kröner (a RGG) all'University Medical Center Goettingen. Ringraziamo Jutta Blumberg e Ulrike Wegner per assistenza tecnica. Ringraziamo anche tutti i tecnici degli animali presso l'impianto di animale dell'University Medical Center Goettingen per mouse mantenendo. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti secondo le normative tedesche sul benessere degli animali.

Questo protocollo è in conformità degli orientamenti di cura degli animali all'Università medica centro Goettingen, Germania (33,9-42502-04-15/2056). Scrivi una recensione su tavole a seconda delle esigenze specifiche del singolo animale, alcuni dei passaggi del protocollo può essere modificato di conseguenza.
1. addominale palpazione dei topi KPC
<ol><li>Per evitare inutili ecografie, palpare l'addome del mouse per identificare i topi che eventualmente potrebbero sopportare una lesione intra-addominale e successivamente devono essere sottoposti a ecografia addominale.<ol>
<li>Eseguire la palpazione addominale settimanale a partire da 8 settimane di età nel modello del topo KPC. Ultrasuono di alta risoluzione può anche applicarsi in modelli di tumore trapiantato (ad esempio, orthotopics) o altri geneticamente costruito del topo. Nota: A seconda del tumore cinetica e studio obiettivo (studio di prevenzione, di intervento terapeutico Studio), rilevamento di tumori molto piccoli (1-2 mm) è fattibile all'inizio del tumore monitor prima di tumori possono essere palpati.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Posizionare il mouse sulla griglia della gabbia e delicatamente sollevare il mouse dalla coda e palpare l'addome delicatamente andando su e giù con indice e pollice della mano non fissazione (Figura 1).</li>
	<li>Se il mouse tollera la palpazione morbida, procedere aumentando lentamente la pressione. Una più grande resistenza possa essere facilmente individuato nell'addome superiore e inferiore. A volte, feci dure possono essere erroneamente interpretate come un tumore massa.</li>
</ol>2. preparazione dello spazio di lavoro
<ol><li>Fornire spazio per almeno tre unità di lavoro differenti: area di pre-scansione, scansione gabbia fase e recupero. Materiale richiesto sono rappresentati in Figura 2.</li>
	<li>Pulire la piastra di lavoro principale (per esempio con 70% etanolo) e accendere la piattaforma di riscaldamento prima della scansione (Figura 3). Assicurarsi che la temperatura di 38-40 ° C viene raggiunta prima che il primo mouse viene trasferito.</li>
	<li>Accendere la macchina di ultrasuono e creare una nuova cartella per i dati acquisiti (Figura 4). L'impostazione di modalità B viene applicata per l'imaging addominale. Inoltre, affinché che il trasduttore addominale è collegato alla porta attiva della macchina. Fissare la testa di trasduttore nella parte superiore della fase di lavoro utilizzando il sistema di montaggio trasduttore.</li>
	<li>Preparare una gabbia di recupero su una piastra riscaldante o la stuoia termica (o lampada di riscaldamento uso) affinché termoregolazione post-procedurale e pronta guarigione dei topi digitalizzati. Mettere un sottile strato di tessuto come cuscino nella parte inferiore di questa gabbia per evitare l'aspirazione di biancheria da letto con il rischio di soffocamento (Figura 5).</li>
</ol>3. inalazione anestesia
<ol><li>Procedere mettendo un mouse nella camera di induzione. Aprire la valvola per il flusso di gas vettore (1 L/min di ossigeno o aria) e impostare la concentrazione di isoflurane al 4%, permettendo una lentamente crescente saturazione della camera ad induzione. Assicurarsi che isoflurano corretto lo scavenging (filtro passivo o attivo) è a posto. Dopo circa 2-4 min il mouse sarà solitamente sotto sedazione profonda.<ol>
<li>Mantenere la sedazione con la somministrazione di isoflurano 2% attraverso il cono di naso nella fase di lavoro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasferire con cautela l'animale dalla camera di induzione per la fase di lavoro. Controllare il cono di naso per un flusso di gas costante. Mettere il muso del mouse nel cono di naso la presa di linea di anestesia. La posizione normale per la scansione iniziale è posizione supina. Il mouse può essere posizionato anche su lato destro o sinistro per migliorare la visibilità della testa pancreatica o tumori di coda (Figura 6).</li>
	<li>Anche se l'ecografia addominale non è dolorosa per sé, è possibile eseguire il test di pizzico di piede come indicatore per un dolore gratuito condizione e stato di anestesia profonda. Se il mouse è ancora attivo o muoversi attivamente, ritrasferimento l'animale indietro nella camera di induzione per induzione ripetuta e prolungata.</li>
	<li>Utilizzare l'unguento protezione degli occhi per prevenire lesioni della cornea a causa della perdita di liquidi.</li>
	<li>Durante l'anestesia, utilizzare un sistema di monitoraggio. Tuttavia, la temperatura rettale ed ECG non viene utilizzato regolarmente per ecografia addominale. D'importanza, topi perdono la capacità di termoregolarsi sotto anestesia. Pertanto, osservare da vicino i segni clinici per ipotermia o afflizione respiratoria come ansimante o apnea. Se qualsiasi sintomo è ovvio fermata isoflurano e posto il mouse nella gabbia recupero immediatamente.</li>
</ol>4. ecografia impostazioni
<ol><li>Accendere il sistema a ultrasuoni come descritto da istruzioni del produttore. Assicurarsi che l'impostazione primaria è messo su imaging generale con il pacchetto addominale attivato. Solito B-modalità-imaging viene utilizzato per l'acquisizione di dati come standard.</li>
	<li>Ottenere una qualità di immagine ottimizzata con i seguenti parametri: frequenza di 40 MHz, 2D-guadagno 25-30 dB, immagine profondità 10 mm, larghezza 10 mm, 3 zone focali con centro tra 3-6 mm.</li>
</ol>5. Mouse preparazione
<ol><li>Fissare l'estremità superiore ed inferiore con nastro adesivo. Essere il più attento possibile evitare qualsiasi pregiudizio all'animale a causa della fissazione (Figura 7).</li>
	<li>Rimuovere tutte le pellicce addominale utilizzando elettronico domestico clippers. Dovuto la struttura della pelliccia, iniziare dalla parte inferiore dell'addome fino alla gabbia toracica. Prendersi cura a processus xiphoideus per evitare le lesioni della pelle in questa zona. Nota: Mouse pelliccia riflette gli ultrasuoni e diminuisce la visibilità.</li>
	<li>Utilizzare la crema depilatoria per eseguire una preparazione ottimizzata della pelle e la rimozione completa della pelliccia. Amministrare un sottile strato di crema sulla punta dell'addome rasato con punte in cotone (Figura 8). Rimuovere la crema (dopo 30 s o successivamente a seconda la crema utilizzata) con tessuti a secco seguiti da molta acqua per rimuovere completamente tutti i residui (Figura 9, Figura 10, Figura 11). Crema resti potrebbero causare irritazioni della pelle e della mucosa dopo l'ecografia e possono così influenzare la salute.</li>
	<li>Per garantire un'adeguata scansione condizioni applicano un sacco di gel per ultrasuoni sull'addome (Figura 12). Di solito, gel per ultrasuoni calda viene utilizzato al fine di ridurre al minimo l'ipotermia per il mouse.</li>
	<li>Applicare manualmente un sottile strato di gel per ultrasuoni sulla testa del trasduttore. Eseguire un test toccando sul lato trasduttore con la tacca. Alla schermata di un segnale sul lato superiore sinistro può essere visto se il trasduttore è posizionato correttamente.</li>
</ol>6. addominale di ultrasuono
<ol><li>Regolare il trasduttore sull'addome utilizzando una pressione decisa. Pesante compressione dell'addome del mouse può condurre a danno respiratorio o circolatorio e dovrebbe essere evitata.</li>
	<li>Scansione su e giù. Regolare il telaio della piattaforma di lavoro e le ruote per asse x e y.</li>
	<li>Come il primo passo per identificare entrambi i reni. Di solito appaiono come strutture omogenee iperecogeni nel basso addome. Il collegato renalis di essere facilmente reperibile che ulteriormente conduce alla vena cava inferiore (Figura 13).</li>
	<li>Utilizzare la vena lienalis serve come nave di pietra miliare per il pancreas. Tentativo di distinguere tra Renalis del vena e lienalis del vena. Al momento del rilevamento di vena lienalis pancreas può essere localizzato esattamente. Il pancreas normale è piuttosto una membrana si sono diffuse attraverso la cavità addominale rispetto a una struttura solida (Figura 14 e Figura 15).</li>
</ol>7. pancreatiche del tumore rilevamento e la valutazione del Volume
<ol><li>Identificare le lesioni pancreatiche da tutte le strutture circostanti. Essi generalmente appaiono come masse di hypoechoic disomogeneo tessuto rotonda o allungata (Figura 16). Il tumore è solitamente costante e difficilmente può essere compresso per la testa di scansione. Nota, di volta in volta che potrebbe essere difficile da distinguere chiaramente tra un tumore e un ciclo di piccole viscere. Prestare attenzione alla peristalsi dell'intestino che non devono essere osservata in tumori pancreatici.</li>
	<li>Sulla schermata di rilevazione del tumore su e giù per farsi un'idea delle dimensioni complessive e misurare il diametro più grande utilizzando la pinza di ultrasuono. Una volta trovata un'immagine adatta, congelamento della schermata e utilizzare lo strumento di misura per determinare con precisione le dimensioni del tumore. Nota, per un uso successivo che sarà importante differenziare se un tumore è localizzato nella coda, il corpo o la testa del pancreas.</li>
	<li>Prima di cambiare indietro per modalità live, assicurarsi di salvare immagini per registrare il lavoro. Notare che durante il congelamento dell'immagine che potrebbe accadere che la rotella di regolazione viene rilasciata, e la sonda ad ultrasuoni viene premuta ancora più all'addome del mouse. Di conseguenza, fissare la regolazione della compressione prima di cambiare la modalità di congelare.</li>
	<li>Dopo aver terminato la misurazione del primo aereo o ruotare la testa di scansione di 90° in posizione longitudinale (Figura 17), o girare il mouse al suo fianco, per rilevare la dilatazione longitudinale dei tumori. Alcuni tumori potrebbero essere necessario modificare la posizione del mouse per un'adeguata visibilità. Per i tumori della coda pancreatica, il mouse può essere collocato sul suo lato destro (Figura 10 e Figura 19), per i tumori pancreatici testa sul suo lato sinistro (Figura 11 e Figura 20).</li>
</ol>8. quantificazione del Volume del tumore
Nota: Uno degli obiettivi principale di tutti gli sforzi è la corretta determinazione del volume del tumore. Anche se ci sono diverse tecniche disponibile un metodo di calcolo, tra cui la formula di un ellissoide è preferito all'University Medical Center Goettingen.
<ol><li>Dotato di tutti i tre diametri ottenuti in precedenza, calcolare il volume approssimativo del tumore corrispondente (Figura 21).</li>
	<li>In alternativa, è possibile utilizzare un sistema motorio della testa di scansione per eseguire una scansione automatizzata della regione del tumore con il calcolo del volume successivo e 3-D-ricostruzione.</li>
</ol>9. recupero
<ol><li>Dopo la scansione, rimuovere con attenzione tutto il nastro adesivo e rimuovere con attenzione tutti i gel per ultrasuoni con il tessuto asciutto.</li>
	<li>Trasferire con cautela il mouse nella gabbia recupero ( Figura 21). Evitare qualsiasi tessuto di rivestimento sulla faccia di mouse´s che potrebbe causare danno respiratorio. Una posizione laterale per il recupero dovrebbe essere preferita.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+mouse+models+in+oncology+research+and+cancer+medicine.">Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine.</a> EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).</li><li>Olive, K. P., Politi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Translational therapeutics in genetically engineered mouse models of cancer. (2), 131-143 (2014).</li><li>Westphalen, C. B., Olive, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+mouse+models+of+pancreatic+cancer.">Genetically engineered mouse models of pancreatic cancer.</a> The Cancer Journal. 18 (6), 502-510 (2012).</li><li>Hingorani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trp53R172H+and+KrasG12D+cooperate+to+promote+chromosomal+instability+and+widely+metastatic+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+in+mice.">Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice.</a> Cancer Cell. 7 (5), 469-483 (2005).</li><li>Frese, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nab-Paclitaxel+potentiates+gemcitabine+activity+by+reducing+cytidine+deaminase+levels+in+a+mouse+model+of+pancreatic+cancer.">nab-Paclitaxel potentiates gemcitabine activity by reducing cytidine deaminase levels in a mouse model of pancreatic cancer.</a> Cancer Discovery. 2 (3), 260-269 (2012).</li><li>Paredes, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-invasive+method+of+quantifying+pancreatic+volume+in+mice+using+micro-MRI.">A non-invasive method of quantifying pancreatic volume in mice using micro-MRI.</a> PLoS One. 9 (3), e92263 (2014).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Aung, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotargeting+of+Integrin+alpha6beta4+for+Single-Photon+Emission+Computed+Tomography+and+Near-Infrared+Fluorescence+Imaging+in+a+Pancreatic+Cancer+Model.">Immunotargeting of Integrin alpha6beta4 for Single-Photon Emission Computed Tomography and Near-Infrared Fluorescence Imaging in a Pancreatic Cancer Model.</a> Molecular Imaging. 15, (2016).</li><li>Akladios, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+microCT+structural+imaging+to+preclinical+evaluation+of+hepatocellular+carcinoma+chemotherapeutics+on+orthotopic+graft+in+ACI+rats.">Contribution of microCT structural imaging to preclinical evaluation of hepatocellular carcinoma chemotherapeutics on orthotopic graft in ACI rats.</a> Bulletin du Cancer. 98 (2), 120-132 (2011).</li><li>Neesse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTGF+antagonism+with+mAb+FG-3019+enhances+chemotherapy+response+without+increasing+drug+delivery+in+murine+ductal+pancreas+cancer.">CTGF antagonism with mAb FG-3019 enhances chemotherapy response without increasing drug delivery in murine ductal pancreas cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 110 (30), 12325-12330 (2013).</li><li>Sastra, S. A., Olive, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+murine+pancreatic+tumors+by+high-resolution+ultrasound.">Quantification of murine pancreatic tumors by high-resolution ultrasound.</a> Methods in Molecular Biology. 980, 249-266 (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Con questo protocollo, è fornita una descrizione dettagliata per quantificare i tumori pancreatici usando la formazione immagine di ultrasuono addominale ad alta definizione in modelli murini geneticamente. Recentemente, Sastra et al pubblicato una descrizione dettagliata di come quantificare i tumori pancreatici in modelli murini, ma non visualizzato in quel momento istruzioni circa la preparazione e manipolazione come prerequisito per gli ulteriori passi sono stati mostrati11. L'obiett...

Modelli murini geneticamente hanno acquisito un'importanza crescente nella ricerca sul cancro dovuto la loro capacità di ricapitolare strettamente la natura complessa di carcinogenesi umana1,2,3. Uno dei più frequentemente usati modelli per studiare lo sviluppo del cancro del pancreas, progressione e risposta terapeutica è caratterizzata da una mutazione d'attivazione nell'oncogene Kras combinato con un'inattivazione del soppressore del tumore p534. Questo LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX-1-Cre modello murino (KPC) imita la progressione graduale dalle lesioni pre-invasive neoplasia intraepiteliale pancreatica (PanIN) a carcinoma invasivo. Fenotipicamente, quasi tutti i topi sviluppano PDAC entro i primi sei mesi dopo la nascita. Tuttavia, rispetto ai modelli trapiantati, il modello KPC rivela un'insorgenza di tumore altamente variabile da 8 settimane a parecchi mesi4. Una volta che i tumori pancreatici raggiungono una certa dimensione (5-9 mm di diametro), rapidamente accelera la crescita del tumore e topi dovrà essere arruolati in studi preclinici5. Pertanto, la rilevazione esatta di inizio del tumore e la dimensione del tumore è un prerequisito essenziale per la logistica di studio preclinico e monitoraggio della terapia. In generale, diversi approcci come la formazione immagine a risonanza magnetica (MRI)6, esame7,8,9 o ultrasuono di alta risoluzione di tomografia computata possa essere impiegata per condurre lo screening del tumore e terapia10. Ogni tecnica ha i suoi vantaggi e svantaggi. Anche se MRI- o la tomografia computata (CT)-imaging permette l'acquisizione di dati ad alta risoluzione così come il calcolo del volume accurato, tempo prolungato esame sotto sedazione generale e attrezzature molto costose sono richiesta e non consentono frequenti scansione per un lungo periodo di tempo. Al contrario, piccolo animale ecografia è un metodo stabilito che possa essere impiegato per lo screening per le patologie addominali topi11. I vantaggi di questo metodo di imaging sono brevi tempi, alta risoluzione, di scansione e la possibilità di utilizzare l'ultrasuono di doppler o contrasto migliorato ultrasuono (CEUS) per visualizzare la perfusione degli organi in parallelo. Tuttavia, le conoscenze anatomiche, 3D fantasia e approfondita formazione pratica sono necessari per l'interpretazione corretta immagine.
Nel seguente articolo, viene fornito un protocollo dettagliato per l'utilizzo di ultrasuoni ad alta risoluzione nel modello KPC. Inoltre, immagini ecografiche standard sono raffigurate ed etichettate con strutture dell'organo per facilitare l'orientamento per l'investigatore.

<table><tbody><tr><td>Visual Sonics Vevo2100 High Resolution Ultrasound System, including imaging stage and anesthesia line</td><td>FUJIFILM VisualSonics Inc, Canada</td><td>VS-11945</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100 MicroScan Transducer MS-550-D (22-55MHz)</td><td>FUJIFILM VisualSonics Inc, Canada</td><td>VS-11874</td><td></td></tr><tr><td>Vevo Anesthesia System (anesthesia induction chamber with fresh and waste gas inlet)</td><td>FUJIFILM VisualSonics Inc, Canada</td><td>SA-12055</td><td></td></tr><tr><td>Vevo Imaging Station (working stage with nose cone for anesthesia supply)</td><td>FUJIFILM VisualSonics Inc, Canada</td><td>SA-11982</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;electronic pet clippers</td><td>Panasonic Marketing Europe, Germany</td><td>5025232484324</td><td>Panasonic ER-PA10-s</td></tr><tr><td>Labotect Hot plate</td><td>Labor tech G&amp;ouml;ttingen, Germany</td><td>13854</td><td></td></tr><tr><td>eye cream (ophthalmic ointment)</td><td>Sch&amp;uuml;lke&amp;amp;Mayr, Germany</td><td>9080249</td><td></td></tr><tr><td>veterinary isoflurane</td><td>Abbvie, Germany</td><td>4831867</td><td></td></tr><tr><td>depilatory cream</td><td>RB healthcare UK, United Kingdom</td><td>8218535</td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol (v/v) in distilled water</td><td>TH. Geyer, Germany</td><td>22941000</td><td></td></tr><tr><td>ultrasound gel</td><td>Asmuth, Germany</td><td>13477</td><td></td></tr><tr><td>tissue wipes</td><td>Kimberly-Clark Germany, Germany</td><td>7558</td><td></td></tr><tr><td>cotton tips</td><td>Meditrade, Germany</td><td>75481116</td><td></td></tr><tr><td>glass bowl for ultrasound gel</td><td>ARC France, France</td><td>H1149</td><td></td></tr><tr><td>water bowl</td><td>W &amp;amp; P Trading Co., USA</td><td>B00K2P6PLQ</td><td></td></tr><tr><td>gauze sponges</td><td>Fuhrmann, Germany</td><td>960504</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizing high resolution ultrasound to monitor tumor onset and growth in genetically engineered pancreatic cancer models

Il LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX-1-Cre modello murino (KPC) rappresenta un modello transgenico stabilito e frequentemente utilizzato per valutare nuove terapie nel cancro del pancreas. L'inizio del tumore è variabile nel modello KPC da 8 settimane a diversi mesi. Di conseguenza, strumenti di imaging non invasivo sono tenuti a schermo per l'inizio del tumore e monitor per la risposta al trattamento. Per risolvere questo problema, diversi approcci sono emerse negli ultimi anni. Ultrasuono di alta risoluzione ha importanti vantaggi quali la non invasività, tempi di sessione veloce e un'alta risoluzione di immagine senza esposizione a radiazioni. Tuttavia, ecografia nei topi non è banale e sufficiente conoscenza anatomica e competenze pratiche necessari per eseguire con successo ad ultrasuoni ad alta risoluzione in modelli preclinici di cancro del pancreas. Con il seguente articolo, una guida dettagliata di hands-on per ecografia addominale in modelli murini con un focus particolare su modelli endogeni del cancro del pancreas è presentata. Inoltre, viene fornito un riepilogo degli errori comuni e come evitarli.

L'imaging ad ultrasuoni è una tecnica versatile e non invasivo che viene utilizzata per risolvere diversi problemi in modelli murini di malattie umane. Rispetto a tutti gli altri vantaggi principali approcci imaging sono efficienza ad alta velocità, costo, tempo di acquisizione breve e l'imaging in tempo reale. Tuttavia, questo strumento ha bisogno di competenze per generare immagini accurate e di alta qualità. In particolare nel caso di artefatti indesiderati almeno qualche esperienza...

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Utilizing High Resolution Ultrasound to Monitor Tumor Onset and Growth in Genetically Engineered Pancreatic Cancer Models

Questo articolo viene descritto l'utilizzo dell'ecografia ad alta risoluzione in topi geneticamente ingegnerizzati cancro del pancreas. L'obiettivo primario è quello di fornire istruzioni precise per il rilevamento e la valutazione dei tumori pancreatici endogeni.

Utilizzando ultrasuoni ad alta risoluzione per Monitor l'inizio del tumore e la crescita nei modelli geneticamente del cancro del pancreas

The LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53R172H/+; Pdx-1-Cre (KPC) mouse model represents an established and frequently used transgenic model to evaluate novel ...

utilizing-high-resolution-ultrasound-to-monitor-tumor-onset-growth

Research

JoVE Journal

Cancer Research

10.7K Views.  University Medical Center Goettingen. Questo articolo viene descritto l'utilizzo dell'ecografia ad alta risoluzione in topi geneticamente ingegnerizzati cancro del pancreas. L'obiettivo primario è quello di fornire istruzioni precise per il rilevamento e la valutazione dei tumori pancreatici endogeni.

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Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will survive longer than five years. In order to understand and mimic the microenvironment of pancreatic tumors, we utilized a murine orthotopic model of pancreatic cancer that allows non-invasive imaging of tumor progression in real time. Pancreatic cancer cells expressing green fluorescent protein (PANC-1 GFP) were suspended in basement membrane matrix, high concentration, (e.g., Matrigel HC) with serum-free media and then injected into the tail of the pancreas via laparotomy. The cell suspension in the high concentration basement membrane matrix becomes a gel-like substance once it reaches room temperature; therefore, it gels when it comes in contact with the pancreas, creating a seal at the injection site and preventing any cell leakage. Tumor growth and metastasis to other organs are monitored in live animals by using fluorescence. It is critical to use the appropriate filters for excitation and emission of GFP. The steps for the orthotopic implantation are detailed in this article so researchers can easily replicate the procedure in nude mice. The main steps of this protocol are preparation of the cell suspension, surgical implantation, and whole body fluorescent in vivo imaging. This orthotopic model is designed to investigate the efficacy of novel therapeutics on primary and metastatic tumors.

A procedure to implant green fluorescent protein-expressing pancreatic cancer cells (PANC-1 GFP) orthotopically into the pancreas of Balb-c Ola Hsd-Fox1nu mice to assess tumor progression and metastasis is presented here.

Fluorescente ortotopico modello murino di cancro al pancreas

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

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Ricerca sul cancro

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the limitations of current treatments, as the majority of patients do not respond to immunotherapy. Development of accurate preclinical models to quickly identify novel and effective therapeutic combinations are critical to address this unmet clinical need. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDA) is a canonical example of an immune checkpoint blockade resistant tumor with only 2% of patients responding to immunotherapy. The genetically engineered KrasG12D+/-;Trp53R172H+/-;Pdx-1 Cre (KPC) mouse model of PDA recapitulates human disease and is a valuable tool for assessing therapies for immunotherapy resistant in the preclinical setting, but time to tumor onset is highly variable. Surgical orthotopic tumor implantation models of PDA maintain the immunobiological hallmarks of the KPC tissue-specific tumor microenvironment (TME) but require a time-intensive procedure and introduce aberrant inflammation. Here, we use an ultrasound-guided orthotopic tumor implantation model (UG-OTIM) to non-invasively inject KPC-derived PDA cell lines directly into the mouse pancreas. UG-OTIM tumors grow in the endogenous tissue site, faithfully recapitulate histological features of the PDA TME, and reach enrollment-sized tumors for preclinical studies by four weeks after injection with minimal seeding on the peritoneal wall. The UG-OTIM system described here is a rapid and reproducible tumor model that may allow for high throughput analysis of novel therapeutic combinations in the murine PDA TME.

We describe a protocol for the ultrasound guided implantation of murine-derived pancreatic ductal adenocarcinoma cell lines directly into the native tumor site. This approach resulted in pancreatic tumors detectable by ultrasound scanning within 2-4 weeks of injection, and significantly reduced the proportion tumor cell seeding on the peritoneal wall as compared to surgical orthotopic implantation.

Impianto ortotopico a ultrasuoni dell'adenocarcinoma dugalese Murine

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic alterations in oncogenes such as the KRAS oncogene, which constitutes ~25% of lung cancer cases. The difficulty in therapeutically targeting KRAS-driven lung cancer partly stems from having poor models that can mimic the progression of the disease in the lab. We describe a method that permits the relative quantification of primary KRAS lung tumors in a Cre-inducible LSL-KRAS G12D mouse model via ultrasound imaging. This method relies on brightness (B)-mode acquisition of the lung parenchyma. Tumors that are initially formed in this model are visualized as B-lines and can be quantified by counting the number of B-lines present in the acquired images. These would represent the relative tumor number formed on the surface of the mouse lung. As the formed tumors develop with time, they are perceived as deep clefts within the lung parenchyma. Since the circumference of the formed tumor is well-defined, calculating the relative tumor volume is achieved by measuring the length and width of the tumor and applying them in the formula used for tumor caliper measurements. Ultrasound imaging is a non-invasive, fast and user-friendly technique that is often used for tumor quantifications in mice. Although artifacts may appear when obtaining ultrasound images, it has been shown that this imaging technique is more advantageous for tumor quantifications in mice compared to other imaging techniques such as computed tomography (CT) imaging and bioluminescence imaging (BLI). Researchers can investigate novel therapeutic targets using this technique by comparing lung tumor initiation and progression between different groups of mice.

This protocol describes the steps taken to induce KRAS lung tumors in mice as well as the quantification of formed tumors by ultrasound imaging. Small tumors are visualized in early timepoints as B-lines. At later timepoints, relative tumor volume measurements are achieved by the measurement tool in the ultrasound software.

Rilevamento della progressione del tumore del polmone nei topi mediante Ultrasound Imaging

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

Bioluminescent Orthotopic Model of Pancreatic Cancer Progression

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%. New therapeutic options are critically needed and depend on improved understanding of pancreatic cancer biology. To better understand the interaction of cancer cells with the pancreatic microenvironment, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression. Luciferase-tagged pancreatic cancer cells are resuspended in Matrigel and delivered into the pancreatic tail during laparotomy. Matrigel solidifies at body temperature to prevent leakage of cancer cells during injection. Primary tumor growth and metastasis to distant organs are monitored following injection of the luciferase substrate luciferin, using in vivo imaging of bioluminescence emission from the cancer cells. In vivo imaging also may be used to track primary tumor recurrence after resection. This orthotopic model is suited to both syngeneic and xenograft models and may be used in pre-clinical trials to investigate the impact of novel anti-cancer therapeutics on the growth of the primary pancreatic tumor and metastasis.

Improved understanding of pancreatic cancer biology is critically needed to enable the development of better therapeutic options to treat pancreatic cancer. To address this need, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression using in vivo bioluminescence imaging.

Bioluminescente modello ortotopico di cancro al pancreas Progressione

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%.  New therapeutic options are critically needed and depend on improved ...

Medicina

Analysis of Lymph Node Volume by Ultra-High-Frequency Ultrasound Imaging in the Braf/Pten Genetically Engineered Mouse Model of Melanoma

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox&#160;genetically engineered mice (Braf/Pten mice) are widely used as an in vivo model of metastatic melanoma. Once a primary tumor has been induced by tamoxifen treatment, an increase in metastatic burden is observed within 4-6 weeks after induction. This paper shows how Ultra-High-Frequency UltraSound (UHFUS) imaging can be exploited to monitor the increase in metastatic involvement of the inguinal lymph nodes by measuring the increase in their volume.
The UHFUS system is used to scan anesthetized mice with a UHFUS linear probe (22-55 MHz, axial resolution 40 &#181;m). B-mode images from the inguinal lymph nodes (both left and right sides) are acquired in a short-axis view, positioning the animals in dorsal recumbency. Ultrasound records are acquired using a 44 &#181;m step size on a motorized mechanical arm. Afterward, two-dimensional (2D) B-mode acquisitions are imported into the software platform for ultrasound image post-processing, and inguinal lymph nodes are identified and segmented semi-automatically in the acquired cross-sectional 2D images. Finally, a total reconstruction of the three-dimensional (3D) volume is automatically obtained along with the rendering of the lymph node volume, which is also expressed as an absolute measurement.
This non-invasive in vivo technique is very well tolerated and allows the scheduling of multiple imaging sessions on the same experimental animal over 2 weeks. It is, therefore, ideal to assess the impact of pharmacological treatment on metastatic disease.

Melanoma is a very aggressive disease that quickly spreads to other organs. This protocol describes the application of ultra-high-frequency ultrasound imaging, coupled with 3D rendering, to monitor the volume of the inguinal lymph nodes in the Braf/Pten mouse model of metastatic melanoma.

Analisi del volume dei linfonodi mediante imaging ecografico ad altissima frequenza nel modello murino geneticamente modificato braf/Pten del melanoma

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox&#160;genetically engineered mice (Braf/Pten mice) are widely used as an in vivo model of metastatic melanoma. Once a ...

Generation of an Orthotopic Xenograft of Pancreatic Cancer Cells by Ultrasound-Guided Injection

Pancreatic cancer (PCa) represents one of the deadliest cancer types worldwide. The reasons for PCa malignancy mainly rely on its intrinsic malignant behavior and high resistance to therapeutic treatments. Indeed, despite many efforts, both standard chemotherapy and innovative target therapies have substantially failed when moved from preclinical evaluation to the clinical setting. In this scenario, the development of preclinical mouse models better mimicking in vivo characteristics of PCa is urgently needed to test newly developed drugs. The present protocol describes a method to generate a mouse model of PCa, represented by an orthotopic xenograft obtained by ultrasound-guided injection of human pancreatic tumor cells. Using such a reliable and minimally invasive protocol, we also provide evidence of in vivo engraftment and development of tumor masses, which can be monitored by ultrasound (US) imaging. A noteworthy aspect of the PCa model described here is the slow development of the tumor masses over time, which allows precise identification of the starting point for pharmacological treatments and better monitoring of the effects of therapeutic interventions. Moreover, the technique described here is an example of implementation of the 3Rs principles since it minimizes pain and suffering and directly improves the welfare of animals in research.

We present a protocol to generate a minimally invasive orthotopic pancreatic cancer model by ultrasound-guided injection of human pancreatic cancer cells and the subsequent monitoring of tumor growth in vivo by ultrasound imaging.

Generazione di uno xenotrapianto ortotopico di cellule tumorali pancreatiche mediante iniezione guidata da ultrasuoni

Pancreatic cancer (PCa) represents one of the deadliest cancer types worldwide. The reasons for PCa malignancy mainly rely on its intrinsic malignant ...

High-Resolution Ultrasonography for the Analysis of Orthotopic ATC Tumors in a Genetically Engineered Mouse Model

Anaplastic thyroid carcinoma (ATC) is associated with a poor prognosis and short median survival time, but no effective treatment improves the outcomes significantly. Genetically engineered murine models that mimic ATC&#39;s progression may help researchers to study treatments for this disease. Crossing three different genotypes of mice, a TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Trp53&#916;ex2-10/&#916;ex2-10&#160;transgenic ATC model was developed. The ATC murine model was induced by an intraperitoneal injection of tamoxifen with overexpression of BrafV600E and deletion of Trp53, and the tumors were generated within about 1 month. High-resolution ultrasound was applied to investigate the tumor initiation and progression, and the dynamic growth curve was obtained by measuring the tumor sizes. Compared to magnetic resonance imaging (MRI) and computed tomography scanning, ultrasound has advantages in observing the ATC murine model, such as being noninvasive, portable, in real-time, and without radiation exposure. High-resolution ultrasound is suitable for dynamic and multiple measurements. However, ultrasonographic examination of the thyroid in mice requires relevant anatomical knowledge and experience. This article provides a detailed procedure for utilizing high-resolution ultrasound to scan tumors in the transgenic ATC model. Meanwhile, ultrasonic parameter adjustment, ultrasound scanning skills, anesthesia and recovery of the animals, and other elements that need attention during the process are listed.

The present protocol describes high-frequency ultrasonography for visualizing the entire mouse thyroid gland and monitoring the growth of anaplastic thyroid carcinoma.

Ecografia ad alta risoluzione per l'analisi di tumori ATC ortotopici in un modello murino geneticamente modificato

Anaplastic thyroid carcinoma (ATC) is associated with a poor prognosis and short median survival time, but no effective treatment improves the outcomes ...

Imaging pancreatico murino utilizzando una finestra stabilizzata impiantata

Stabilized Window for Intravital Imaging of the Murine Pancreas

The physiology and pathophysiology of the pancreas are complex. Diseases of the pancreas, such as pancreatitis and pancreatic adenocarcinoma (PDAC) have high morbidity and mortality. Intravital imaging (IVI) is a powerful technique enabling the high-resolution imaging of tissues in both healthy and diseased states, allowing for real-time observation of cell dynamics. IVI of the murine pancreas presents significant challenges due to the deep visceral and compliant nature of the organ, which make it highly prone to damage and motion artifacts. 
Described here is the process of implantation of the Stabilized Window for Intravital imaging of the murine Pancreas (SWIP). The SWIP allows IVI of the murine pancreas in normal healthy states, during the transformation from the healthy pancreas to acute pancreatitis induced by cerulein, and in malignant states such as pancreatic tumors. In conjunction with genetically labeled cells or the administration of fluorescent dyes, the SWIP enables the measurement of single-cell and subcellular dynamics (including single-cell and collective migration) as well as serial imaging of the same region of interest over multiple days. 
The ability to capture tumor cell migration is of particular importance as the primary cause of cancer-related mortality in PDAC is the overwhelming metastatic burden. Understanding the physiological dynamics of metastasis in PDAC is a critical unmet need and crucial for improving patient prognosis. Overall, the SWIP provides improved imaging stability and expands the application of IVI in the healthy pancreas and malignant pancreas diseases.

Autore in primo piano: Rivoluzionare la comprensione della malattia pancreatica attraverso l'imaging intravitale avanzato 

We present a protocol for the surgical implantation of a stabilized indwelling optical window for subcellular-resolution imaging of the murine pancreas, allowing serial and longitudinal studies of the healthy and diseased pancreas.

Finestra stabilizzata per l'imaging intravitale del pancreas murino

The physiology and pathophysiology of the pancreas are complex. Diseases of the pancreas, such as pancreatitis and pancreatic adenocarcinoma (PDAC) have ...

Utilizzando ultrasuoni ad alta risoluzione per Monitor l'inizio del tumore e la crescita nei modelli geneticamente del cancro del pancreas

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Fluorescente ortotopico modello murino di cancro al pancreas

Impianto ortotopico a ultrasuoni dell'adenocarcinoma dugalese Murine

Rilevamento della progressione del tumore del polmone nei topi mediante Ultrasound Imaging

Bioluminescente modello ortotopico di cancro al pancreas Progressione

Analisi del volume dei linfonodi mediante imaging ecografico ad altissima frequenza nel modello murino geneticamente modificato braf/Pten del melanoma

Generazione di uno xenotrapianto ortotopico di cellule tumorali pancreatiche mediante iniezione guidata da ultrasuoni

Ecografia ad alta risoluzione per l'analisi di tumori ATC ortotopici in un modello murino geneticamente modificato

Finestra stabilizzata per l'imaging intravitale del pancreas murino

Finestra stabilizzata per l'imaging intravitale del pancreas murino

Finestra stabilizzata per l'imaging intravitale del pancreas murino