Questo protocollo ha permesso lo sviluppo di modelli di cancro alla testa e al collo con specifiche operazioni genomiche, influenzando significativamente la nostra comprensione del ruolo di specifiche mutazioni geniche nel processo di neoplasia. Il vantaggio principale di questa tecnica è la facilità con cui la linea cellulare può essere sviluppata praticamente da qualsiasi organo. A dimostrare la procedura sarà Manu Prasad, uno studente laureato del mio laboratorio.
Inizia usando forbici chirurgiche per raccogliere la lingua da un topo transgenico B6 di sei settimane. Utilizzare un bisturi per tritare il tessuto in frammenti molto piccoli e raccogliere i pezzi in un tubo da 15 millilitri contenente 4,5 millilitri di mezzo semplice RPMI senza siero. Aggiungere 200 microlitri di miscela di tripli enzimi al tubo e incubare il campione a 37 gradi Celsius per 30 minuti toccando il tubo ogni 10 minuti per migliorare la dissociazione enzimatica del tessuto.
Al termine dell'incubazione, interrompere la reazione con 5%FBS in PBS e filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino a rete da 70 micro metri per separare le cellule dai frammenti di tessuto più grandi. Raccogliere le cellule per centrifugazione e sospendere di nuovo il pellet in tre millilitri di mezzo completo. Quindi placcare le cellule in tre millilitri di mezzo completo per piatto da 16 millimetri.
Trasferire gli aggregati cellulari trattenuti sopra il filtro in un piatto di coltura separato di 16 millimetri e aggiungere tre millilitri di mezzo completo. Tenere entrambi i piatti nell'incubatrice fino a formare colonie cellulari distinte. Dopo una settimana di coltura, esaminare microscopicamente le colture cellulari primarie per la presenza di contaminazione da fibroblasti, trattando le cellule con il 25% di tripside nel 02%EDTA a 37 gradi Celsius per un minuto e rimuovere eventuali fibroblasti.
Il giorno 10 della coltura utilizzare il 25% di tripsiderina nello 02%EDTA per tre o cinque minuti a 37 gradi Celsius per raccogliere le cellule dalla sospensione cellulare o colture di aggregati cellulari e vedere due volte 10 alla quinta cella primaria in due millilitri di mezzo per pozzo in ogni pozzo della piastra a 6 pozzi. Il giorno dopo trasduci le cellule con uno per 10 al genoma virale 12 per millilitro e incuba le cellule nel mezzo contenente particelle virali per 48 ore a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, sostituire i supernaganti di coltura con due millilitri di mezzo fresco completo per pozzo e riportare le cellule all'incubatore di coltura cellulare.
Dopo due settimane di espansione della coltura, seminare le cellule per la convalida e gli esperimenti tumorigeni in vivo. Utilizzando il vettore AAV CAS9, uno per 10 ai 12 genomi virali per millilitro del virus sono stati determinati per trasformare in modo efficiente le cellule di metra primaria in mappe tumorigeniche utilizzando il protocollo come dimostrato. Le cellule trasdotto Express Cre, CAS9 e Green Fluorescent Protein.
L'iniezione di cinque volte 10 alla quinta mappa primaria trasdutta AAV nella lingua, nel labbro e nella pelle dei topi SCID NOD, si traduce in formazione tumorale in questi animali a differenza dell'iniezione di mappe primarie, che non inducono tumori. La trasformazione tumorigenica delle cellule epiteliali della lingua primaria può essere confermata usando l'immunofluorescenza e l'assorbimento occidentale. L'analisi genomica mediante sequenziamento profondo del DNA, isolato dalle cellule trasformate, conferma l'efficace editing genico e il frameshift della proteina tumorale 53 e dei geni APC da parte del sistema AAV CAS9.
Inoltre, le cellule della lingua trasformate formano efficacemente tumori in sei topi neri di tipo C57 selvatici. L'analisi immunoistochimica delle cellule tumorali neoplastiche rivela l'espressione citoplasmatica di E-Cadherin e Cheratina 14, entrambi marcatori del tessuto epiteliale. Quando si tenta questa procedura, tenere sempre presente che un'eccessiva tritacarne o troppa reazione enzimatica porta a una ridotta vitalità delle cellule, portando a una riduzione dell'efficienza delle transazioni virali.
Utilizzando questa procedura, le linee cellulari possono essere geneticamente modificate per ottenere informazioni sul potenziale tumorigenico e metastatico delle cellule tumorali da qualsiasi tessuto di interesse.
