Questo protocollo è necessario per valutare i diversi ruoli di elementi biochimici definiti nel nucleo e nel citoplasma e per analizzare le interazioni intracellulari tra questi domini all'interno di varie linee cellulari. Questa tecnica utilizza apparecchiature di laboratorio e reagenti comuni per separare in modo più efficiente le frazioni citoplasmatiche e nucleari. Questo protocollo può farlo in modo meno costoso e più veloce rispetto ad altri protocolli.
Man mano che gli studi sulle interazioni citoplasmatiche e nucleari diventano più diffusi, l'impatto della localizzazione sugli eventi intracellulari può essere meglio compreso. Lo scambio tra il citoplasma e il nucleo può essere analizzato, indicando se alcune molecole durante questi scambi possono portare allo sviluppo del cancro, come hanno indicato studi sulle proteine nucleari. Il passo più critico nel protocollo è modificare la concentrazione del tampone di lisi a una concentrazione adeguata.
Poiché l'uso del tampone di lisi dipende in gran parte dalla rottura delle membrane cellulari e ci sono varianti naturali nell'efficacia del tampone di lisi su diverse linee cellulari. Per iniziare, pellettare le celle, utilizzando tubi da 1,5 millilitri tramite centrifugazione per cinque minuti a 2000 G.Scartare il surnatante usando una pipetta aspirante. Risospendere il pellet in 300 microlitri di tampone di lisi ghiacciato.
Quindi, ruotare i tubi ad una velocità di circa 12.000 G a quattro gradi Celsius per due minuti. Rimuovere con attenzione il surnatante e posizionarlo in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Il pellet rimanente sarà la frazione nucleare.
Quindi, aggiungere 500 microlitri di PBS ghiacciato al pellet e centrifugare a 2000 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Per confermare la separazione dei compartimenti usando qPCR, in primo luogo, convertire l'RNA in DNA complementare utilizzando un kit disponibile in commercio. Preparare la master mix di trascrittasi inversa.
Aggiungi modello di RNA. Incubare le reazioni in un termociclatore. Procedere per l'esecuzione della reazione a catena quantitativa della polimerasi e dell'analisi.
Inizia diluendo la sintesi del cDNA con acqua DEPC per avere una concentrazione finale di 20 nanogrammi per millilitro. Utilizzando una miscela master PCR, preparare la reazione per ciascun campione utilizzando istruzioni manuali. Acquisire sonde commerciali necessarie per rilevare il frazionamento citoplasmatico e nucleare.
Utilizzare MALAT1 come marcatore nucleare e TUG1 come marcatore citoplasmatico. Calcolare il volume di ciascun componente moltiplicando ogni componente per tre per ciascuna delle repliche tecniche per il singolo campione. Per ogni campione nucleare e citoplasmatico, acquisire la frazione nucleare miscelata con MALAT1, la frazione citoplasmatica con MALAT1, la frazione nucleare con TUG1 e la frazione citoplasmatica con TUG1.
Vortice brevemente per mescolare le soluzioni e trasferire 20 microlitri della miscela in ciascun pozzetto di una piastra di reazione ottica. Coprire la piastra con una pellicola adesiva trasparente utilizzata per la qPCR e centrifugare brevemente la piastra per eliminare le bolle d'aria, quindi ruotare il campione a 300 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Utilizzando un software di progettazione e analisi, selezionare la curva standard per i parametri ciclici.
Utilizzando il software qPCR, selezionare l'esecuzione del programma di installazione. Nella pagina delle proprietà del file di dati selezionare i parametri del metodo e del ciclo di input. Dopo aver inserito i parametri del ciclo, selezionare la scheda della piastra e immettere i campioni da eseguire.
Seleziona avvia esecuzione. Al termine dell'esecuzione, creare un foglio di calcolo dei dati con il nome dell'esempio, il nome della destinazione e il ciclo di quantificazione. Inizia con i campioni MALAT1 per calcolare la frazione nucleare.
Sottrarre la frazione citoplasmatica MALAT1 dalla frazione nucleare MALAT1. Continuare con i campioni MALAT1 per calcolare la frazione citoplasmatica. Sottrarre la frazione nucleare MALAT1 dalla frazione citoplasmatica MALAT1 e quindi calcolare i due elevati a delta CQ negativo. Eseguire i calcoli con campioni TUG1.
Quando TUG1 è presente come controllo positivo per gli elementi citoplasmatici, i livelli di frazionamento citoplasmatico dovrebbero essere superiori ai livelli di frazionamento nucleare. Un risultato negativo quando si osservano livelli di frazionamento citoplasmatico nel campione con MALAT1. Ciò indica la contaminazione dell'RNA isolato dalla frazione nucleare, potenzialmente dovuta a concentrazioni di lisi troppo basse o troppo alte.
MALAT1 e TUG1 hanno mostrato la più alta correlazione con la separazione nucleare e citoplasmatica, come confermato attraverso un Western blot e l'elettroforesi dell'RNA, che ha confermato la purezza e la qualità dei campioni. Inoltre, la purezza degli estratti nucleari e citoplasmatici può essere dimostrata da un Western blot che utilizza la lamina come marker per la frazione nucleare e l'alfa-tubulina come marker positivo per la frazione citoplasmatica. Nessun picco è stato osservato nell'elettroforesi dell'RNA citoplasmatico, dimostrando alta qualità e poca o nessuna contaminazione nel campione di RNA citoplasmatico.
L'utilizzo del tampone di lisi è fondamentale per il corretto frazionamento e l'ottimizzazione della concentrazione del tampone di lisi alla linea cellulare di interesse desiderata è essenziale. Questa tecnica consente lo studio mirato dell'interazione nucleare e citoplasmatica, che è ampiamente applicabile a una varietà di argomenti di ricerca e consente una migliore comprensione di come la localizzazione di specifici elementi biologici può essere correlata alla loro funzione.
