Lo sviluppo di tecniche per studiare il trasporto di macromolecole tra il nucleo e il citoplasma e l'identificazione di una delocalizzazione errata delle proteine soppressori del tumore è essenziale per ottenere una comprensione più profonda della patogenesi CLL e aiutare nello sviluppo di nuove terapie. Questo protocollo fornisce un metodo rapido ed efficiente per generare frazioni nucleari e citoplasmatiche da cellule CLL primarie. Queste frazioni possono essere utilizzate in esperimenti a valle tra cui test di attività enzimatica, analisi proteomica e gonfiore occidentale.
Questa tecnica amplierà la nostra comprensione di come terapie e segnali micro-ambientali all'interno dei tumori alterino l'arresto delle proteine tra il nucleo e il citoplasma nelle cellule CLL e potenzialmente altre neoplasie cellulari B. Questo metodo può essere utilizzato per determinare la posizione delle proteine e/o attirare il movimento proteico a sua volta. Eseguire un gradiente detergente su ogni singola linea cellulare che si prevede di utilizzare per garantire la generazione ottimale di frazioni nucleari e citoplasmatici altamente arricchite.
Accanto a Jodie Hay e Michael Moles, a dimostrare questa procedura ci sarà Jennifer Cassels, una tecnico del mio laboratorio. Ottenere campioni di sangue periferico da pazienti affetti da leucemia linfocitica cronica precedentemente acconsentita in tubi di raccolta del sangue EDTA, accompagnati dal conteggio dei globuli bianchi. I campioni di sangue umano devono essere considerati pericolosi in quanto contengono potenzialmente virus trasmessi dal sangue.
Assicurarsi che questi campioni siano trattati in un armadietto di biosicurezza di classe due e che l'utente indossi sempre un camice da laboratorio e guanti. Smaltire materiali contaminati dal sangue nei disinfettanti. Se il numero di globuli bianchi è uguale o superiore a 40 milioni di celle per millilitro, diluire il campione con un rapporto di uno a uno con il tampone di lavaggio RT CLL.
Quindi aliquota RT density gradient medium in un tubo di centrifuga conica di dimensioni adeguate per il campione. Sovrapporre con cura il campione sopra il mezzo e centrifugare a 400 x g per 30 minuti a RT. Utilizzando una pipetta Pasteur in plastica, raccogliere delicatamente lo strato bianco di cellule mononucleari che si sono raccolte all'interfaccia del mezzo gradiente di densità nel tampone di lavaggio CLL. Trasferire questo monostrato isolato in un tubo di centrifuga conico fresco da 50 millilitri.
Per lavare le celle, aggiungere 40 millilitri di tampone di lavaggio CLL a questo monostrato e centrifugare a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Scartare il supernatante, scorrere il fondo del tubo per sospendere di nuovo il pellet e ripetere questo lavaggio. Scartare il supernatante, scorrere di nuovo la parte inferiore del tubo e quindi sospendere nuovamente il pellet di cella in un volume impostato di tampone di lavaggio CLL a seconda delle dimensioni del pellet.
Dopo aver contato le cellule e dopo la citometria del flusso per controllare la purezza cellulare, posizionare le cellule in piastre di coltura tissutale alla densità cellulare richiesta pronta per la stimolazione o il trattamento farmacologico. Dopo la stimolazione e/o il trattamento farmacologico, l'incubazione è completa. Trasferire le cellule in tubi di microfugo da 1,5 millilitri etichettati individualmente e pellet centrifugando a 200 x g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo aver scartato il supernatante, sospendere di nuovo il pellet cellulare in un millilitro di PBS ghiacciato con inibitori della fosfatasi. Centrifuga a 200 x g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il supernatante e tenere questi pellet di estratto di cella interi sul ghiaccio per ulteriori preparazioni.
Per preparare frazioni citoplasmatiche, sospendere delicatamente il pellet cellulare in 50 microlitri di tampone ipertonico 1x. Per consentire alle cellule di gonfiarsi, incubarle sul ghiaccio per 15 minuti. Dopo aver eseguito un gradiente detergente per determinare la concentrazione ottimale di detergente da utilizzare per un tipo di cella specifico, aggiungere da 0,8 a 2,5 microlitri di detersivo in ogni campione e vortice sull'impostazione più alta per 10 secondi.
Per verificare la llisi cellulare, osservare le cellule al microscopio a contrasto di fase prima e dopo l'aggiunta del detergente. Tutte le cellule hanno un nucleo denso e scuro circondato dal citoplasma che appare come un alone luminoso. Una volta lesa, centrifugare i campioni a 14.000 x g per 30 secondi a quattro gradi Celsius.
Con attenzione, senza disturbare il pellet, trasferire il supernatante in un tubo di microfugo etichettato pre-refrigerato e conservare questa frazione citoplasmatica a 80 gradi Celsius fino a ulteriori analisi. Garantire la completa rimozione della frazione citoplasmatica per prevenire la contaminazione della frazione nucleare. Al pellet rimanente, che contiene la frazione nucleare, aggiungere 50 microlitri di tampone dilisi completo e sospendere di nuovo tubazione su e giù.
Per solubilizzare le proteine associate alla membrana nucleare, aggiungere 2,5 microlitri di detersivo, vortice sull'impostazione più alta per 10 secondi e incubare sul ghiaccio per 30 minuti. Vortice sull'impostazione più alta per 30 secondi e centrifuga. Quindi trasferire il supernatante in un tubo di microfugo etichettato pre-refrigerato e immagazzinare questa frazione nucleare a 80 gradi Celsius fino a ulteriori analisi.
Per i litolati interi, sospendere di nuovo il pellet di estratto di cella intero in 100 microlitri di tampone dilisi completo pipettando su e giù. Per garantire una lisi cellulare completa, aggiungere cinque microlitri di detersivo e incubare sul ghiaccio per 30 minuti. Vortice sull'impostazione più alta per 30 secondi e poi centrifuga a 14.000 x g per 20 minuti a quattro gradi Celsius.
Trasferire il supernatante in un tubo di microfugo pre-refrigerato e conservare l'intero litolato cellulare a 80 gradi Celsius fino a ulteriori analisi. Per quantificare il traffico proteico tra frazioni nucleari e citoplasmatici, eseguire analisi quantitative western blot e importare le immagini. Per visualizzare l'immagine sulla barra multifunzione Immagine, fare clic sul pulsante Scegli nel gruppo Schermo e fare clic su Canale Chemi.
La finestra di dialogo Scegli visualizzazione si aprirà per abilitare ulteriori regolazioni, se necessario. Implementare ulteriori miglioramenti utilizzando i cursori regolabili nella scheda LUT dell'immagine, inclusa luminosità o contrasto. Utilizzate la scheda Curve (Curves) per rettifiche più fini.
Per l'analisi dei dati, fare prima clic sulla barra multifunzione Analisi. Per analizzare un solo canale, deselezionare i canali che non vengono analizzati facendo clic sull'anteprima del canale Don't Show di un canale, lasciando visualizzato solo il canale desiderato. Per quantificare l'intensità del segnale, fare clic su Aggiungi rettangolo per aggiungere rettangoli all'immagine.
Fare clic sul centro di una feature, ad esempio una banda proteica, per posizionare un rettangolo intorno ad essa. Dopo aver aggiunto le forme desiderate, fare clic su Seleziona per riportare il cursore allo strumento di selezione. Per sottrarre il rumore di fondo, fate clic sul primo pulsante del gruppo Sfondo e selezionate Mediana (Median) dal menu a discesa.
Impostare la larghezza del bordo su tre nella finestra di dialogo Sfondo e selezionare i segmenti che meglio rappresentano lo sfondo dell'immagine da utilizzare per il calcolo dello sfondo. Per esportare i dati, fare clic sulla scheda Forme sopra la tabella. Per la densitometria sono necessari valori nella colonna Segnale.
Il segnale è la somma dei valori di intensità dei pixel o del totale per una forma meno il prodotto dello sfondo nell'area. Quindi fare clic sul pulsante Report, su Salva con nome o Avvia foglio di calcolo. Per calcolare l'espressione normalizzata della proteina di interesse per ogni piano o variabile all'interno del foglio di calcolo salvato, dividere il segnale ottenuto per la proteina di interesse per il segnale per la corrispondente banda di controllo del carico proteico.
Per esportare l'immagine, fare clic sulla scheda Immagini trovata sopra la tabella e quindi fare clic sull'immagine da esportare. Se si usa l'immagine per una presentazione o altri formati digitali, fare clic sull'icona del software, posizionare il puntatore del mouse su Esporta, fare clic su Immagine per elementi multimediali digitali e quindi salvare l'immagine in base alle esigenze. L'arricchimento delle cellule CLL con un WCC superiore a 40 milioni per millilitro mediante centrifugazione a densità consente un elevato recupero cellulare.
L'analisi del campione per citometria del flusso dopo la gating su FSC e SSC rivela che la purezza delle cellule CLL è superiore al 95% come indicato dalla doppia espressione superficiale dei marcatori cellulari CLL, CD19 e CD5. Quando le macchie immunologiche sono state eseguite sulle frazioni risultanti della linea cellulare CLL, Mac-1, e delle cellule CLL primarie, il frazionamento indicava che il livello di detersivo ottimale per le cellule Mac-1 era a una o 60 diluizione, rispetto a uno a 30 per le cellule CLL primarie. Quando la localizzazione subcellulare di FOXO1 nelle frazioni nucleari e citoplasmatiche è stata determinata in Mac-1 e nelle cellule CLL primarie, la generazione di frazioni altamente arricchite è stata dimostrata dall'espressione quasi esclusiva della lamina nel nucleare e beta tubulina nelle frazioni citoplasmatiche.
L'espressione di FOXO1 è stata ridotta nel citoplasma dopo il trattamento con AZD 8055, rispetto all'NDC, accompagnato da un aumento dell'espressione FOXO1 nel compartimento nucleare, dimostrando così la traslocazione proteica. Dopo che singole macchie immunologiche di cinque campioni primari di CLL sono state quantificate all'interno di frazioni subcellulari, È stato scoperto che AZD 8055 riduce i livelli di espressione DI FOXO1 nel citoplasma e aumenta l'espressione nel nucleo. Bcr cross-linking aumento dell'espressione citoplasmatica FOXO1.
Ricorda di tenere tutti i reagenti e i campioni sul ghiaccio per prevenire la degradazione delle proteine. Le frazioni subcellulari generate in questa procedura possono anche essere utilizzate in saggi di attività enzimatica come un saggio di attività FOXO, che consente di disegnare parallelismi tra la posizione cellulare di FOXO1 e la sua attività di legame del DNA. Lo sviluppo di questa tecnica ci ha permesso di affrontare il traffico di proteine specifiche all'interno delle cellule CLL in risposta a inibitori selettivi e supporta i nostri studi paralleli sull'immunofluorescenza per generare un set di dati robusto e quantificabile.
