Questo protocollo prevede una procedura passo-passo per rilevare i focolai indotti dalle radiazioni delle proteine di riparazione mediante colorazione dell'immunofluorescenza nelle linee cellulari del colon umano dopo l'irradiazione con il fascio misto neutroni. L'imaging ad immunofluorescenza è un metodo sensibile e fornisce prove visive per la comparsa di proteine della via di riparazione nei focolai in risposta agli agenti dannosi del DNA, come le radiazioni ionizzanti. Il fascio misto neutronico è usato nella terapia di cattura neutronica del boro, BNCT, e la risposta ai danni al DNA indotta dalle radiazioni non è stata completamente stabilita.
Il nostro protocollo può anche essere utile per l'analisi degli effetti biologici a livello cellulare dovuti alle radiazioni di altri fasci ad alto LET, come protoni che utilizzano la terapia con fascio di protoni o ioni di carbonio utilizzando la terapia adron. Dopo l'irradiazione, rimuovere il mezzo dalle cellule attaccate e lavarle una volta con 2,5 millilitri di PBS. Quindi fissare le cellule con un millilitro di 70%etanolo per 10 minuti.
Per permeabilizzare le cellule, rimuovere l'etanolo e lavarle con 2,5 millilitri di PBS. Aggiungere delicatamente un millilitro di 2%Triton X-100 in PBS per coprire i copripavimenti e incubare le cellule per cinque minuti a temperatura ambiente. Lavare le celle tre volte con PBS e bloccare la permeabilizzazione con un millilitro di 2%BSA diluito in PBS.
Quindi incubare le cellule per un minimo di 30 minuti con il 2%BSA. Per macchiare le cellule, aggiungere la giusta quantità di anticorpo primario diluito in PBS con BSA, come raccomandato nel manoscritto testuale. Quindi coprire la piastra di Petri e posizionare in una scatola di plastica con lignina idratata per mantenere l'umidità.
Incubarlo per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, eseguire tre lavaggi con PBS e aggiungere la giusta quantità di anticorpi secondari. Riportare il piatto nella scatola di plastica con lignina idratata e incubarlo per almeno 30 minuti a 37 gradi Celsius.
Quindi ripetere i lavaggi con PBS e aggiungere 100 microlitri di DAPI diluiti a una concentrazione finale di un microgrammo per millilitro per controsostenere i nuclei. Incubare le cellule per un massimo di due minuti a temperatura ambiente e ripetere i lavaggi con PBS. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere il PBS e mettere delicatamente un coverslip sopra il mezzo di montaggio, evitando la formazione di bolle d'aria.
Sigillare i bordi del coverslip con smalto per unghie e lasciare indurire il supporto di montaggio prima di eseguire la microscopia a fluorescenza. I focolai gamma-H2AX, che sono marcatori standard per le rotture a doppio filamento di DNA, sono stati rilevati in cellule tumorali del colon miscelate a neutroni, irradiate dal fascio e non irradiate. I fuochi appaiono come punti fluorescenti distinti.
Nelle cellule irradiate è stato osservato un diametro più elevato dei focolai gamma-H2AX. Inoltre, è stato rilevato un singolo binario di una particella alfa ad alto LET che attraversa i nuclei. La microscopia ad immunofluorescenza è stata utilizzata per rilevare proteine rappresentative rad52 e protein chinasi dipendente dal DNA.
Un alto valore medio del diametro dei focolai di chinasi proteica dipendente dal DNA è stato misurato alle rotture del DNA dopo l'irradiazione rispetto alle cellule di controllo. Le rotture a doppio filamento di DNA raggruppate sono state osservate nelle cellule irradiate come focolai più complessi, più grandi e raggruppati con maggiore intensità. Lo stadio più importante della colorazione dell'immunofluorescenza è la fissazione delle cellule e la permeabilità della membrana cellulare.
Questi passaggi sono necessari per consentire agli anticorpi di penetrare facilmente sia in quelle cellule che nelle proteine di riparazione intracellulari. Questa procedura fornisce informazioni sull'attivazione di ogni percorso di riparazione a livello cellulare. I risultati dovrebbero quindi essere confermati a livello molecolare utilizzando un saggio, come la PCR in tempo reale.
Questa tecnica consente ai ricercatori di esplorare la risposta ai danni al DNA indotta dalle radiazioni, che non è stata completamente determinata nel caso di travi diverse che utilizzano terapie antitumorali.
