I saggi di acquisizione ed estensione del D-loop sono i primi a consentire una quantificazione imparziale e diretta delle fasi di formazione ed estensione del D-loop durante la ricombinazione omologa in cellule di lievito a crescita mitotica. Questa tecnica indipendente dalla vitalità consente lo studio di proteine nel metabolismo del D-loop che altrimenti non sarebbe possibile districarsi dai ruoli successivi, solo guardando i prodotti BIR. In futuro, prevediamo la transizione di questi test alle cellule umane per comprendere meglio il ruolo delle proteine chiave, tra cui BRCA2 e i casi bloom e Warner kilo nella ricombinazione omologa.
Inizia centrifugando i campioni per cinque minuti. Risospendere il pellet in 2,5 millilitri di soluzione di psoralene 1x e trasferirlo in una capsula di Petri da 60 x 15 millimetri. Per nessun controllo di reticolazione, risospendere il pellet in 2,5 millilitri di soluzione TE1.
Quindi, impostare la sorgente di luce UV nella parte superiore dello shaker orbitale, impostato su 50 RPM. Per reticolare i campioni utilizzando un cross-linker UV con lampadine a onde lunghe da 365 nanometri. Posizionare le piastre di Petri da uno a due centimetri sotto la sorgente di luce UV per 10 minuti agitando delicatamente su una lastra di plastica o plexiglass pre-raffreddata.
Quindi trasferire il campione in un nuovo tubo da 15 millilitri. Risciacquare la capsula di Petri con 2,5 millilitri di soluzione di TE1 e aggiungerla al tubo. Centrifugare i campioni per cinque minuti.
Scartare il surnatante e conservare il pellet a meno 20 gradi Celsius. Posizionare i campioni sul ghiaccio per lo scongelamento. Contemporaneamente, preriscaldare un bagno secco a 30 gradi Celsius.
Risospendere i campioni in un millilitro di tampone sferoplastico e trasferirli in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Quindi aggiungere 3,5 microlitri di soluzione di zimolyasi e mescolare delicatamente picchiettando. Incubare a 30 gradi Celsius per 15 minuti.
E poi posizionare i tubi sul ghiaccio. Centrifugare per tre minuti e posizionare i campioni su ghiaccio. Lavare i campioni tre volte in un millilitro di tampone di sferofra e centrifugare i campioni per tre minuti.
Risospendere i campioni in un millilitro di tampone enzimatico di restrizione a freddo. Centrifugare per tre minuti e posizionare i campioni su ghiaccio. Ripetere il lavaggio una volta.
Risospendere i campioni in un millilitro di tampone enzimatico di restrizione freddo 1x. Dividere equamente il campione in due. Centrifugare i campioni per tre minuti a 16.000 G a quattro gradi Celsius.
Risospendere una provetta da ciascun campione in 180 microlitri di tampone enzimatico di restrizione 1,4x con oligo ibridanti e un altro tubo in 180 microlitri di tampone enzimatico di restrizione 1,4x senza oligo ibridanti. Congelare i campioni in azoto liquido. Scongelare i campioni sul ghiaccio.
Preriscaldare un bagno secco a 65 e un altro a 37 gradi Celsius. Aliquot 36 microlitri del campione in una nuova provetta da microcentrifuga e quattro microlitri di SDS all'1% e miscelati picchiettando delicatamente sul lato del tubo. Incubare a 65 gradi Celsius per 15 minuti picchiettando delicatamente ogni cinque minuti.
Posizionare i campioni sul ghiaccio immediatamente dopo l'incubazione. Aggiungere 4,5 microlitri di Triton X-100 al 10% e mescolare mediante pipettaggio. Aggiungere da 20 a 50 unità di enzima di restrizione EcoR1 o HindIII ad alta fedeltà a ciascun campione.
E incubare a 37 gradi Celsius per un'ora con delicata agitazione ogni 20-30 minuti. Durante questo periodo, bagno secco preriscaldato a 55 gradi Celsius e un bagno d'acqua a 16 gradi Celsius. Aggiungere 8,6 microlitri di SDS al 10% a ciascun campione e mescolare mediante pipettaggio e maschiatura.
Incubare a 55 gradi Celsius per 10 minuti. Aggiungere 80 microlitri di Triton X-100 al 10% a ciascun campione e miscelare mediante pipettaggio. Aggiungere 660 microlitri di tampone di legatura 1x senza ATP, un ATP millimolare a pH 8,0 e otto unità di T4 DNA ligasi a ciascun campione e mescolare delicatamente per inversione.
Incubare 16 gradi Celsius per 1,5 ore con un'inversione ogni 30 minuti. Posizionare i campioni sul ghiaccio immediatamente dopo l'incubazione. Dopo la purificazione del DNA come descritto nel protocollo, utilizzare due microlitri di DNA purificato per impostare una reazione qPCR da 20 microlitri secondo le istruzioni del produttore.
Per ogni campione, impostare cinque reazioni di controllo e una reazione di quantificazione ed eseguirle in duplicato. L'analisi del dosaggio DLC due ore dopo la rottura a doppio filamento o l'induzione del DSB ha mostrato che la reticolazione degli psoraleni è fondamentale e l'efficienza dipende dal tempo tra la raccolta del campione e la qPCR. I valori di ARG4 Cp erano simili tra i campioni reticolati ma inferiori per il campione senza reticolazione poiché il DNA senza legami incrociati amplifica in modo più efficiente.
Per tutti i campioni, il controllo qPCR della legatura intermolecolare era all'interno dell'intervallo. La robusta induzione DSB è stata evidenziata da un basso segnale qPCR per il controllo che amplifica attraverso il sito di riconoscimento dell'endonucleasi HO. Risultati simili sono stati osservati per il controllo EcoR1 qPCR.
Il segnale DLC con oligo ibridante è stato calcolato normalizzando al controllo della legatura intermolecolare. L'analisi del dosaggio DLE eseguita sei ore dopo l'induzione del DSB ha mostrato che i valori di ARG4 CP erano simili tra il campione di oligos con e senza ibridazione. Il controllo qPCR della legatura intermolecolare ha rivelato un segnale accettabile per il campione con e senza oligos ibridante, ma un segnale inferiore per il campione fallito.
In tutti e tre i campioni, c'era una robusta induzione DSB. Poiché la scissione dell'HindIII dipende dal ripristino del sito enzimatico di restrizione da parte dell'oligo ibridante. C'era una differenza significativa nell'amplificazione attraverso il sito di scissione HindIII sul filamento resecato tra la larghezza e senza campioni di oligo.
È stata osservata una minore differenza nell'amplificazione attraverso il sito sul filamento esteso perché qui la scissione dell'HindIII dipende anche dall'estensione. I campioni e il tampone devono essere mantenuti sempre freddi. I campioni devono essere congelati dopo la risospensione in tampone enzimatico di restrizione a freddo 1,4x con o senza oligo ibridanti.
Gli effetti a valle della formazione e dell'estensione del D-loop sulla formazione del prodotto possono essere studiati utilizzando saggi di Southern blotting o di endpoint genetici. Gli effetti sulla ricerca per omologia possono essere studiati utilizzando CP elevati. L'immunoprecipitazione della cromatina può fornire informazioni sul reclutamento di una proteina di interesse.
