Il principale vantaggio di questa tecnica è che riflette l'attività dell'RNA polimerasi II misurando l'mRNA appena sintetizzato che non sono influenzati dalla degradazione dell'RNA. Questo protocollo è stato originariamente descritto usando l'ibridazione microarray, ma può essere facilmente adottato per il sequenziamento ad alta velocità dell'mRNA appena trascritto. A dimostrare questa procedura sarà Tiago Baptista, ex studente laureato del nostro laboratorio.
Dopo aver inoculato le cellule S.cerevisiae, coltivarle durante la notte a 30 gradi Celsius con agitazione costante a 150 giri/min. Il giorno dopo, misurare la densità ottica a 600 nanometri. Diluire la coltura in un OD600 di circa 0,1 in 100 millilitri di mezzo YPD.
Far crescere le cellule fino a quando l'OD600 è di circa 0,8. Successivamente, misurare l'OD600 della cultura notturna di S.pombe. Diluire questa cultura in un OD600 di circa 0,1 millilitri su 500 di mezzo YAS e lasciarla crescere fino a quando l'OD600 è di circa 0,8.
In primo luogo, preparare una nuova soluzione di due molari a quattro tiouracil. Mantenere la soluzione preparata a temperatura ambiente e protetta dalla luce. Aggiungere la soluzione a quattro tiouracil alle colture S.cerevisiae e S.pombe in modo che la concentrazione finale sia di cinque millimolari.
Incubare le colture S.cerevisiae e S.pombe rispettivamente a 30 gradi Celsius e 32 gradi Celsius con agitazione costante per sei minuti. Dopo questo, rimuovere una piccola aliquota di ogni coltura e contare le cellule usando un contatore di cellule automatico o una camera Neubauer. Centrifuga a 2.500 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti per raccogliere le cellule.
Scartare il supernatante e lavare le cellule con ghiaccio freddo una volta il PBS. Centrifugare di nuovo a 2.500 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Successivamente, rimospend le cellule in cinque millilitri di ghiaccio freddo una volta il PBS.
Mescolare le cellule S.cerevisiae e S.pombe con un rapporto di tre a uno. Centrifugare i campioni misti a 2.500 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Quindi rimuovere il PBS e congelare le cellule in azoto liquido.
Conservare il campione a -80 gradi Celsius fino a quando non è pronto per l'uso. Quando è pronto per procedere, scongelare le cellule sul ghiaccio per circa 20-30 minuti. Utilizzare un kit di estrazione dell'RNA di lievito adattato per estrarre l'RNA come delineato nel protocollo di testo.
Successivamente, trasferire la cartuccia del filtro nel tubo di raccolta finale. Elute l'RNA con 50 microlitri di acqua priva di RNasi trattata con DEPC che è stata preriscaldata a 100 gradi Celsius. Centrifuga a 16.000 volte g per un minuto.
Quindi utilizzare 50 microlitri di acqua senza RNasi preriscaldata trattata con DEPC per eludere nuovamente l'RNA nello stesso tubo. Centrifuga a 16.000 volte g per un minuto assicurandosi che l'intero volume del campione sia passato attraverso il filtro. In caso di allora, centrifugare di nuovo per un periodo di tempo più lungo.
Al termine, quantificare e controllare la purezza del campione utilizzando l'attrezzatura appropriata. Utilizzare acqua priva di nucleasi trattata con DEPC per regolare la concentrazione dell'RNA precedentemente acquisito a due milligrammi per millilitro. Aliquota 200 microgrammi di RNA totale e riscaldarlo a 60 gradi Celsius per 10 minuti.
Raffreddarlo immediatamente sul ghiaccio per due minuti. Aggiungere 600 microlitri di acqua priva di RNasi trattata con DEPC. Aggiungere 100 microlitri di tampone di biotinilazione e quindi aggiungere 200 microlitri di BIOTINA HPDP.
Se la soluzione HPDP di biotina precipita fuori dalla soluzione, aumentare il volume di DMSO o DMF fino al 40% del volume di reazione come delineato nel protocollo di testo. Proteggere il campione dalla luce e incubarlo a temperatura ambiente con agitazione delicata per tre ore. Successivamente, aggiungere un volume approssimativamente uguale di cloroformio ai tubi e mescolare vigorosamente.
Centrifuga a 13.000 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Successivamente, trasferire attentamente la fase superiore in nuovi due tubi millilitro. Aggiungere una quantità di cinque cloruri di sodio molare pari a circa 1/10 del volume del campione.
Quindi mescolare il campione. In primo luogo, riscaldare l'RNA biotinilato a 65 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi raffreddare i campioni sul ghiaccio per cinque minuti.
Aggiungere 100 microlitri di perline magnetiche rivestite di Streptavidin all'RNA biotinilato. Incubare a temperatura ambiente con lievi scosse per 90 minuti. Posizionare le colonne fornite con il kit nel supporto magnetico.
Quindi, aggiungere 900 microlitri di tampone di lavaggio a temperatura ambiente alle colonne. Applicare la miscela di perline e RNA da 200 microliter sulle colonne. Raccogliere il flusso in tubi da 1,5 millilitri e quindi applicarlo nuovamente alla stessa colonna magnetica.
Mantenere questo flusso, se necessario, in quanto rappresenta la frazione di RNA senza etichetta. Per iniziare la convalida RT-qPCR delle diverse frazioni, sintetizzare prima cDNA come delineato nel testo. Quindi amplificare il cDNA in tempo reale qPCR utilizzando un protocollo standard.
I livelli misurati di trascrizioni nelle frazioni purificate da cellule di tipo selvatico coltivate con e senza quattro tiouracil hanno confermato che questa procedura purifica specificamente l'RNA etichettato. L'analisi del ceppo delta spt20 rivela che la quantità di RNA totale allo stato stazionario è in gran parte invariata o è solo leggermente ridotta per i geni testati. Risultati simili si vedono per i ceppi cancellati per bre1.
Tuttavia, l'analisi dell'RNA appena trascritto nel ceppo delta spt20 rivela una diminuzione da tre a cinque volte della sintesi dell'mRNA per tutti i geni testati. Nel frattempo, la perdita di bre1 porta a una diminuzione più discreta ma ancora visibile. Dopo l'esaurimento indutbile di spt7, una subunità strutturale del complesso sagale, i livelli di mRNA appena trascritti sono ridotti in misura simile al ceppo di cancellazione.
Quando i livelli totali di RNA sono misurati mediante analisi a livello genomico, si vede che solo pochi geni hanno i loro livelli di espressione alterati al momento della cancellazione di spt20 regolando o regolando verso il basso. Tuttavia, l'analisi dell'RNA appena trascritto rivela che i livelli di oltre 4.000 geni sono significativamente ridotti almeno due volte al momento della cancellazione di spt20 che suggerisce un effetto positivo globale della saga sulla trascrizione dell'RNA polimerasi II nei lieviti in erba. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla trascrizione in Saccharomyces cerevisiae, è stato applicato solo con lievi variazioni a Usando questo protocollo, abbiamo potuto rilevare una diminuzione globale della sintesi dell'mRNA che è stata compensata da una diminuzione globale della degradazione dell'mRNA.
