Questo metodo consente di fornire espressione di microRNA nei reni dei topi con una vasta gamma di condizioni patologiche, come la fibrosi renale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la profilazione dell'espressione del microRNA con elevata precisione e sensibilità utilizzando un processo semplice che consente di risparmiare tempo e previene gli errori tecnici. Per eseguire l'intervento chirurgico fittizio, utilizzare forbici chirurgiche e pinzette per fare un'incisione nella pelle all'addome e tagliare il muscolo e la membrana peritoneale dalla vescica al bordo inferiore sinistro delle costole.
Inumidire due tamponi di cotone con PBS e tirare con cura l'intestino di lato. Posizionare i tamponi inumiditi per identificare il rene sinistro e l'uretero. Chiudere la membrana peritoneale e quindi l'incisione con nylon 4-0.
Per eseguire l'ostruzione uretrale unilaterale, o UUO, fare un'incisione nella pelle all'addome e tagliare il muscolo e la membrana peritoneale come dimostrato per l'intervento fittizio. Posizionare una siringa da 2,5 millilitri sotto il mouse. Inumidire due tamponi di cotone con PBS, quindi tirare accuratamente l'intestino di lato con le pinzette e posizionare i tamponi per identificare l'ureter sinistro.
Usa le pinzette per sollevare il rene sinistro. Usa la seta 4-0 per ligare l'uretero sinistro in due punti a circa un centimetro di distanza. Tagliare l'uretro nel punto centrale delle due legature e quindi utilizzare suture di nylon 4-0 per chiudere la membrana peritoneale e l'incisione.
Dopo aver tagliato la membrana peritoneale, come precedentemente dimostrato, sollevarla con una pinzetta e utilizzare forbici chirurgiche per fare un'incisione laterale sul bordo superiore, quindi continuare l'incisione lungo il bordo più basso delle costole. Identificare il rene sinistro e refluirlo con PBS fino a quando il rene diventa giallo-bianco. Rimuovere il rene tagliando l'arteria renale sinistra e la vena con le forbici chirurgiche e posizionarlo in una piastra di Petri, quindi lavarlo con cura con PBS.
Tagliare il rene in circa campioni da 10 milligrammi con le forbici chirurgiche e le pinzette, mettere ogni pezzo di rene nel proprio tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri e chiudere il tappo del tubo. Mettere un campione di rene nell'omogeneizzatore di silicone e aggiungere 700 microlitri di un reagente di lisi a base di fenile/guanidina. Premere e torcere lentamente il pestello dell'omogeneizzatore contro il campione di rene per omogeneizzarlo.
Ripetere la pressatura e la torsione fino a quando il campione non viene completamente sciolto nel reagente dellalisi. Per omogeneizzare ulteriormente il campione, trasferire il lisato omogeneizzato nella colonna di spin del biopolimero e ruotarlo a 14.000 volte G per tre minuti, quindi trasferire il lisato precipitato in un tubo microcentrifugo da 1,5 millilitri inutilizzato. Unire il lisato nel tubo con 140 microlitri di cloroformio e cappuccio saldamente il tubo.
Per mescolare il llysato e il cloroformio, invertire il tubo 15 volte. Incubare i campioni per due o tre minuti a temperatura ambiente, quindi girarli a 12.000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Senza disturbare il precipitato, trasferire il supernatante in un nuovo tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri e aggiungere 1,5 volte il suo volume di etanolo al 100%.
Vortice la miscela per cinque secondi. Caricare 700 microlitri del campione su una colonna di spin ancorata a membrana in un tubo di raccolta a due millilitri. Chiudere il tappo della colonna e ruotare la colonna a 15.000 volte G per 15 secondi, quindi gettare via il lisato precipitato nel tubo di raccolta.
Lavare accuratamente il campione aggiungendo 700 microlitri di tampone di lavaggio uno alla colonna di spin ancorata a membrana in un tubo di raccolta a due millilitri. Quindi ripetere la centrifugazione e gettare via il tubo di raccolta. Ripetere il lavaggio due volte con 500 microlitri di tampone di lavaggio due per lavaggio.
Dopo l'ultimo lavaggio, ruotare la colonna di spin ancorata a membrana in un tubo di raccolta da due millilitri a 15.000 volte G per un minuto e gettare via il lisato precipitato. Trasferire la colonna di spin ancorata a membrana in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Sciogliere l'RNA totale aggiungendo 30 microlitri di acqua priva di RNasi alla colonna, chiudere il cappuccio della colonna e lasciarlo per cinque minuti a temperatura ambiente.
Quindi gira la colonna a 15.000 volte G per un minuto. Trasferire il campione contenente RNA totale in un nuovo tubo di microcentrifugo sul ghiaccio e misurare la concentrazione di RNA totale per spettrofotometria. Preparare una soluzione di mixaggio principale in base alle indicazioni del manoscritto e aggiungere otto microlitri a ciascun tubo di una striscia di tubi a otto pozzi.
Dopo aver regolato la densità totale dell'RNA, posizionare un'aliquota di 12 microliter dell'RNA totale in ogni tubo e chiudere il cappuccio. Centrifugare i tubi per 15 secondi. Mettere i tubi nel termociclo e incubarli per 60 minuti a 37 gradi Celsius.
Al termine, incubarli immediatamente per cinque minuti a 95 gradi Celsius per la sintesi di cDNA. Trasferire il cDNA in un nuovo tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri e diluirlo 10 volte con acqua distillata. Vortice e centrifuga il tubo per cinque secondi, quindi eseguire PCR quantitativo in tempo reale, come descritto nel manoscritto testuale.
Questo protocollo è stato utilizzato per creare un modello unilaterale di topo ostruzione uretrale tramite legatura ureterale sinistra in topi maschi di otto settimane del peso di 20-25 grammi. Gli ureteri erano completamente ostruito da una doppia legatura con suture di seta 4-0. I reni sono stati raccolti a otto giorni dopo l'intervento chirurgico.
I dati del microRNA qRT-PCR indicavano che il livello di microRNA 3070-3p era significativamente aumentato e i livelli di microRNA, 7218-5p e microRNA 7219-5p sono diminuiti nei reni dei topi UUO rispetto ai controlli. Quando si tenta questo protocollo, ricordarsi di ripetere la torsione del campione di rene fino a quando non viene completamente sciolto nel reagente di lisi a base di fenil/ guanidina per ottenere una buona estrazione di RNA.
