Questo protocollo descriveva un metodo per l'enumerazione delle cellule tumorali rosse e l'isolamento clinico delle CTC. Per iniziare, coltivare le cellule tumorali MCF-7, MDA-MB-231 e HeLa in un pallone di coltura cellulare a una volta da 10 a un quinto in un millimetro di DMEM, integrato con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina-streptomicina. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.
Quando le linee cellulari crescono come monostrati aderenti al 95% di confluenza, staccarle dalla piastra di coltura con una soluzione di tripsina allo 0,25% per due minuti. Colorare le cellule tumorali aggiungendo tre microlitri di Calceina AM e posizionare il piatto nell'incubatrice per 30 minuti. Al termine dell'incubazione, digerire tutte le cellule con la tripsina.
Contare le cellule tumorali in coltura in PBS con una camera di conteggio delle cellule e diluire fino a ottenere 100 cellule tumorali per un millilitro di PBS. Successivamente, introdurre la sospensione cellulare diluita nel chip microfluidico utilizzando una siringa con una pompa a siringa a varie portate. Ottenere l'efficienza di cattura per le varie portate e determinare la portata ottimale.
Conta il numero di cellule tumorali catturate sul chip e che fuoriescono dall'uscita. Calcola l'efficienza di cattura utilizzando la formula fornita. Ripetere la procedura per ottenere l'efficienza di cattura per diversi numeri di cellule tumorali, da 10 a 100.
Testare e convalidare il chip microfluidico per un numero raro di cellule tumorali. Iniettare queste 10 sospensioni di campione nei chip microfluidici utilizzando un ago cavo realizzato con un estrattore di micropipette per aspirare le cellule tumorali diluite. Rileva ed enumera il numero di cellule tumorali per ciascun campione dopo la loro acquisizione sul chip.
Successivamente, colorare le cellule tumorali con Calceina AM ed enumerare 100 cellule tumorali in cinque microlitri di PBS. Spike queste cellule in un millilitro di campione di sangue intero e normale. Introdurre queste cellule nel chip ed enumerare il numero di cellule tumorali catturate sul chip con l'immunofluorescenza verde.
Eseguire l'enumerazione in vivo come descritto e calcolare l'efficienza di cattura dopo l'acquisizione. Enumerare da una a 10 cellule tumorali senza colorazione. Spike queste cellule in un millilitro di sangue intero e normale.
Introdurre questi campioni nel chip microfluidico e catturare le cellule tumorali. Aggiungere da tre a cinque microlitri di colorante fluorescente in 20-30 microlitri di PBS e introdurre questa soluzione sul chip con una siringa. Enumerare il numero di cellule tumorali catturate sul chip con l'immunofluorescenza blu e verde per determinare l'efficienza di cattura.
Successivamente, modificare la superficie del chip con 100 microlitri di 4%3-mercaptopropil trimetossisilano ed etanolo a temperatura ambiente per 45 minuti per la cattura basata sull'affinità della molecola di adesione cellulare antiepiteliale. Al termine dell'incubazione, lavare il chip tre volte con etanolo. Quindi aggiungere 100 microlitri dell'agente di accoppiamento GMBS e lasciarlo interagire per 30 minuti.
Al termine dell'incubazione, utilizzare una siringa per lavare il chip tre volte con un millilitro di PBS. Trattare il chip con 30-40 microlitri di neutravidina da 10 microgrammi per millilitro a temperatura ambiente per 30 minuti, portando all'immobilizzazione delle cellule sul GMBS, quindi sciacquare con PBS per rimuovere l'avidina in eccesso. Modificare il chip con tre microlitri di anticorpo anti-molecola di adesione delle cellule epiteliali biotinilate e incubare durante la notte.
Tutte le cellule tumorali sono state catturate intorno all'array del chip d'onda senza alcuna cellula mancante, indicando l'elevata efficienza di cattura del chip microfluidico. Le cellule tumorali colorate con Hoechst e Calceina AM sono mostrate qui. Le CTC di un paziente affetto da cancro gastrico catturate utilizzando piccoli microfiltri ellittici sono mostrate qui.
Inoltre, vengono mostrate le CTC di un paziente con cancro del colon-retto catturate utilizzando microfiltri trapezoidali ed emettendo fluorescenza sia blu che verde. L'elevata efficienza di cattura e vitalità sono state osservate per le cellule tumorali catturate utilizzando grandi microfiltri ellittici. L'analisi clinica di immunofluorescenza delle CTC colorettali catturate sul chip microfluidico ha riconosciuto le CTC come DAPI-positive, CK-positive, CD45-negative e i globuli bianchi come DAPI-positivi, CK-negativi, CD45-positivi.
Le cellule tumorali del colon-retto coltivate sul grande chip ellittico dopo la cattura e le cellule tumorali del colon-retto catturate sui microfiltri della grande ellisse sono mostrate qui. Questo metodo di modifica con aptamero fornisce un nuovo approccio per arricchire l'isolamento CTC.
