Ringraziamo Valentina Greco per i topi K14-mCherry-H2B. Siamo grati alla Emory University Physics Department Machine Shop per aver generato i dischi coprioggetti in vetro. Questo lavoro è stato finanziato dal Career Development Award #IK2 BX005370 dal Dipartimento degli Affari dei Veterani degli Stati Uniti BLRD Service a LS, NIH Awards RF1-AG079269 e R56-AG072473 a MJMR e I3 Emory SOM / GT Computational and Data Analysis Award a MJMR.

Questa ricerca è stata eseguita in conformità con le linee guida per la cura e l'uso degli animali della Emory University e dell'Atlanta Veterans Affairs Medical Center ed è stata approvata dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Installazione dell'inserto per imaging dal vivo sul tavolino del microscopio invertito
<ol><li>Costruire l'inserto utilizzando file .stl (File supplementare 1, File supplementare 2 e File supplementare 3) specificando le dimensioni e il design 3D (vedere la Figura 1 e la Figura 2A), una stampante 3D e l'acido polilattico (PLA).</li>
	<li>Posizionare con cautela l'inserto (Figura 2B,C) nella grande scanalatura del tavolino del microscopio (Figura 2C e Figura 3A). Utilizzare le viti per fissare l'inserto tramite quattro fori per viti situati in ciascun angolo dell'inserto (Figura 2B-C). NOTA: L'inserto è bidirezionale e può essere ruotato di 180° a seconda dell'orientamento del tavolino del microscopio e dell'apparecchio per anestesia.</li>
	<li>Far scorrere la piastra riscaldante nell'inserto con il lato rivolto verso il basso (Figura 2D) in modo che l'unità si trovi sopra le scanalature inferiori dell'inserto con la porta della spina che passa sotto il stage (Figura 3B).</li>
	<li>Allineare l'apertura circolare scanalata nell'inserto con un obiettivo a immersione in olio di silicone 40x (Figura 3C) e applicare olio di silicone al centro dell'obiettivo.<ol><li>Se si esegue l'imaging per periodi di tempo più lunghi (>1 ora), applicare una generosa quantità di olio che persisterà sull'interfaccia vetrino coprioggetto/obiettivo durante l'imaging. Evitare che l'olio fuoriesca dai bordi dell'obiettivo.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilizzare una siringa per applicare una piccola quantità di grasso sottovuoto lungo l'apertura circolare scanalata e posizionare il disco coprioggetto sopra per sigillare l'inserto (Figura 3D). NOTA: Il disco coprioggetti viene creato rimuovendo le pareti di una piastra di coltura cellulare con fondo in vetro da 35 mm x 10 mm (eseguita da un'officina meccanica).</li>
	<li>Alza l'obiettivo 40x finché l'olio non bacia il fondo del vetrino.</li>
</ol>2. Configurazione dell'isoflurano e preparazione del mouse
<ol><li>Posizionare i componenti elettronici del vaporizzatore a basso flusso (camera di anestesia, tubo, vaporizzatore, contenitore di carbone) in modo che l'ogiva e il tubo collegato raggiungano l'inserto (Figura 3A). ATTENZIONE: L'isoflurano è un anestetico per inalazione e deve essere maneggiato con cura per evitare fuoriuscite e ridurre al minimo l'esposizione umana.</li>
	<li>Misurare il peso del flacone di isoflurano prima dell'uso e registrare. Attacca il tappo del vaporizzatore elettronico al flacone di isoflurano.</li>
	<li>Collegare il cavo di alimentazione al vaporizzatore elettronico. Chiudere le clip a cono blu e aprire le clip bianche della camera di induzione per consentire il flusso d'aria attraverso la camera nel contenitore del carbone. Rimuovere il cappello dell'aria ambiente rosso dal lato sinistro della macchina per consentire il flusso d'aria.</li>
	<li>Lasciare che il sistema si riscaldi per 5 minuti a 200 ml/min (flusso basso) e isoflurano al 2%. NOTA: Sebbene sia selezionata l'impostazione del cono del naso, la linea del cono del naso blu deve rimanere chiusa e la linea della camera di induzione bianca deve rimanere aperta.</li>
	<li>Una volta che il sistema è correttamente bilanciato, spurgare le linee per rimuovere l'isoflurano rimanente dalla camera.</li>
	<li>Posizionare il mouse nella camera di induzione e selezionare High Flow. Completare tutta la preparazione del topo (ad esempio, depilazione, somministrazione di farmaci topici, applicazione di unguento per gli occhi, ecc.) prima di posizionare il corpo dell'animale sopra l'inserto. Verificare che il mouse sia completamente anestetizzato utilizzando il metodo del riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi.<ol><li>Con la gamba estesa, usa un'unghia per pizzicare saldamente la punta del piede senza causare danni fisici. Se il topo mostra una reazione positiva allo stimolo (ad esempio, retrazione delle gambe, contrazione del piede, ecc.), continuare a somministrare l'anestetico all'interno della camera fino a quando non si osserva alcuna reazione. Una volta anestetizzato in modo appropriato, la frequenza respiratoria del topo dovrebbe rallentare a ~55-65 respiri al minuto18.</li>
	</ol></li>
	<li>Quando il mouse è completamente anestetizzato, selezionare di nuovo High Flow per interrompere l'erogazione di isoflurano. Spurgare la camera prima di aprirla e regolare le clip (blu: aperte; bianche: chiuse) per erogare l'isoflurano attraverso l'ogiva. Selezionare Flusso basso mentre l'ogiva è attaccata al mouse per continuare l'erogazione dell'isoflurano.</li>
	<li>Infilare il tubo in isoflurano con il cono del naso attaccato attraverso la staffa angolare del tubo sull'inserto (Figura 3A e Figura 5).</li>
</ol>3. Posizionamento del topo sull'inserto per l'imaging intravitale
<ol><li>Collegare la piastra riscaldante al controller (contenente una sonda anale collegata), accenderla e lasciare che la piastra raggiunga i 36 °C (Figura 4A).</li>
	<li>Rimuovere il topo anestetizzato dalla camera di induzione e posizionarlo sulla piastra riscaldante (Figura 4B e Figura 5A). Eseguire rapidamente il trasferimento dalla camera all'inserimento per ridurre al minimo il tempo di attività del topo senza anestesia inalante.</li>
	<li>Fissare l'ogiva sul mouse (Figura 4B, C e Figura 5). Se necessario, utilizzare del nastro adesivo per fissare ulteriormente l'angolo e il posizionamento dell'ogiva.</li>
	<li>Inserire la sonda anale e regolare la temperatura del controller fino a quando la temperatura corporea del mouse non è stabile a ~36 °C (Figura 4A,B). Dopo che il mouse è stato posizionato correttamente, utilizzare una pellicola trasparente di plastica per intrappolare il calore, se necessario, per supportare ulteriormente la temperatura corporea appropriata (Figura 4C).</li>
	<li>Posizionate il mouse in modo che la testa sia allineata con il disco coprioggetto e immobilizzate l'orecchio al centro del vetrino coprioggetti utilizzando una clip auricolare in metallo (Figura 5A,B) o del nastro adesivo (Figura 5C). NOTA: La pressione della clip auricolare in metallo sull'orecchio può essere regolata allentando la vite che fissa la clip all'inserto. È possibile aggiungere una molla metallica per una maggiore flessibilità di serraggio della clip.<ol><li>Per modificare la posizione della clip auricolare, svitare il bullone con una chiave a brugola da 2.5 mm e trasferirlo nel sito secondario (Figura 2B,C). Quando si rimonta la clip per l'orecchio, posizionare la clip contro l'inserto, seguita dalla rondella sulla parte superiore. Utilizzare un bullone per fissare saldamente la clip con una leggera forza per ruotare la clip.</li>
	</ol></li>
	<li>Regolare il posizionamento z dell'obiettivo fino a quando le celle non si trovano all'interno della posizione focale (Figura 6A,D). Impostare i parametri z-stack e time-lapse in base agli obiettivi sperimentali e avviare l'acquisizione delle immagini. NOTA: Se si ottiene la configurazione corretta, l'orecchio del mouse può essere ripreso per almeno 3 ore consecutive (Figura 6A',D').<ol><li>Una volta impostati i limiti dello z-stack, regolare la potenza e il guadagno del laser per assicurarsi che nessun piano z sia sovrasaturato per ridurre al minimo il fotosbiancamento. Determinare i parametri time-lapse utilizzando lo spessore totale dello z-stack, i numeri dei passi (campionamento di Nyquist consigliato) e gli intervalli di tempo.</li>
		<li>Determinare i parametri di imaging (intervalli di tempo, tempo totale di imaging, ecc.) utilizzando più fattori, tra cui la vitalità animale in anestesia, il fotosbiancamento/fototossicità indotto dal laser e l'obiettivo dell'imaging dal vivo (ad esempio, dinamiche di divisione cellulare, interazioni cellula-cellula, ecc.).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Cessazione dell'imaging
<ol><li>Accendere il termoforo a circolazione d'acqua e impostarlo su Ciclo continuo e 35 °C per almeno 30 minuti prima di terminare l'acquisizione dell'immagine.</li>
	<li>Al termine dell'imaging, selezionare Low Flow sul vaporizzatore elettronico per interrompere l'erogazione di isoflurano e spostare il mouse su un termoforo fino a quando non si deambula.</li>
	<li>Una volta sveglio, sposta il mouse nel contenitore di trasferimento continuando a tenerlo su un termoforo fino a quando non è completamente deambulante. Monitora costantemente il mouse mentre sei sul termoforo finché non è reattivo.</li>
	<li>Sul vaporizzatore elettronico, fai clic su Seleziona menu > Controllo anestetico > Vuoto. Rimuovere il flacone di isoflurano dal sistema e riposizionare il tappo del produttore sul flacone.</li>
	<li>Misurare il peso della bombola di isoflurano e del contenitore del carbone e inserire i pesi nel registro. Una volta che il contenitore del carbone pesa 50 g oltre la misurazione di base, smaltire il contenitore e sostituirlo con una nuova unità. Rimettere l'isoflurano nella cassetta di sicurezza.</li>
	<li>Rimuovere il disco coprioggetti e pulirlo con carta per lenti e soluzione per lenti. Conservare correttamente per evitare graffi per il riutilizzo.</li>
	<li>Rimuovere il tubo per anestesia dalla staffa dell'inserto e svitare l'inserto dal tavolino del microscopio.</li>
</ol>

Imaging intravitale con un microscopio invertito per monitorare la dinamica delle cellule cutanee

<ol>
	<li>Babes, L., Yipp, B. G., Senger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+the+metastatic+pulmonary+environment.">Intravital microscopy of the metastatic pulmonary environment.</a> Methods in Molecular Biology. , 383-396 (2023).</li><li>Nal Chen, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+promote+glioblastoma+tumor+cell+migration+after+biopsy.">Neutrophils promote glioblastoma tumor cell migration after biopsy.</a> Cells. 11 (14), 2196 (2022).</li><li>Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+to+study+platelet-leukocyte-endothelial+interactions+in+the+mouse+liver.">Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver.</a> Journal of Visualized Experiments. 188 (188), (2022).</li><li>Rios, A. C., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+imaging+of+breast+cancer.">Multidimensional imaging of breast cancer.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 13 (5), (2022).</li><li>Fischer, M., Edelblum, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+to+visualize+murine+small+intestinal+intraepithelial+lymphocyte+migration.">Intravital microscopy to visualize murine small intestinal intraepithelial lymphocyte migration.</a> Current Protocols. 2 (8), (2022).</li><li>Pineda, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+hair+follicle+regeneration+in+the+mouse.">Intravital imaging of hair follicle regeneration in the mouse.</a> Nature Protocols. 10 (7), 1116-1130 (2015).</li><li>Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+to+study+cancer+progression+and+metastasis.">Intravital imaging to study cancer progression and metastasis.</a> Nature Reviews. Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).</li><li>Turk, M., Biernaskie, J., Mahoney, D. J., Jenne, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+techniques+to+image+wound+healing+in+mouse+skin.">Intravital microscopy techniques to image wound healing in mouse skin.</a> Methods in Molecular Biology. , 165-180 (2022).</li><li>Pal Arndt, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+3D+intravital+look+at+the+juxtaglomerular+renin-cell-niche+reveals+an+individual+intra/extraglomerular+feedback+system.">A quantitative 3D intravital look at the juxtaglomerular renin-cell-niche reveals an individual intra/extraglomerular feedback system.</a> Frontiers in Physiology. 13, 980787 (2022).</li><li>Oal Yam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+conversion+to+a+tumor-killing+phenotype+underpins+effective+microbial+therapy.">Neutrophil conversion to a tumor-killing phenotype underpins effective microbial therapy.</a> Cancer Research. 83 (8), 1315-1328 (2023).</li><li>Huang, S., Rompolas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+microscopy+for+intracutaneous+imaging+of+stem+cell+activity+in+mice.">Two-photon microscopy for intracutaneous imaging of stem cell activity in mice.</a> Experimental Dermatology. 26 (5), 379-383 (2017).</li><li>Durr, N. J., Weisspfennig, C. T., Holfeld, B. A., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximum+imaging+depth+of+two-photon+autofluorescence+microscopy+in+epithelial+tissues.">Maximum imaging depth of two-photon autofluorescence microscopy in epithelial tissues.</a> Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 026008 (2011).</li><li>Tauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+risks+of+multiphoton+microscopy+in+physiology.">Advantages and risks of multiphoton microscopy in physiology.</a> Experimental Physiology. 87 (6), 709-714 (2002).</li><li>Yoshitake, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparison+between+confocal+and+multiphoton+microscopy+for+rapid+histopathological+evaluation+of+unfixed+human+breast+tissue.">Direct comparison between confocal and multiphoton microscopy for rapid histopathological evaluation of unfixed human breast tissue.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (12), 126021 (2016).</li><li>Mesa, K., Rompolas, P., Zito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-induced+cell+death+and+epithelial+phagocytosis+regulate+hair+follicle+stem+cell+pool.">Niche-induced cell death and epithelial phagocytosis regulate hair follicle stem cell pool.</a> Nature. 522, 94-97 (2015).</li><li>Ral Li, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pdgfra+marks+a+cellular+lineage+with+distinct+contributions+to+myofibroblasts+in+lung+maturation+and+injury+response.">Pdgfra marks a cellular lineage with distinct contributions to myofibroblasts in lung maturation and injury response.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Tal Tumbar, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+epithelial+stem+cell+niche+in+skin.">Defining the epithelial stem cell niche in skin.</a> Science. 303 (5656), 359-363 (2004).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), 5563 (2011).</li><li>Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+microscopy.">Multi-photon microscopy.</a> Current Protocols. 3 (1), 634 (2023).</li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

In questo studio, presentiamo un nuovo strumento che facilita l'imaging intravitale stabile e a lungo termine di epiteli cutanei di topo intatti su microscopi confocali invertiti. Questa invenzione è realizzata in PLA, che è il materiale stampabile in 3D più comune ed economico; tutti i costi di stampa 3D interni per questo inserto ammontano a < $ 5. I due pezzi separati dell'inserto (Figura 1, File supplementare 1 e File supplementare 2) possono essere f...

La microscopia intravitale è un potente strumento che consente il monitoraggio dei comportamenti delle cellule nei loro ambienti imperturbati in vivo. Questo metodo unico ha fornito informazioni chiave sul funzionamento interno di complessi sistemi di organi dei mammiferi, tra cui il polmone1, il cervello2, il fegato3, la ghiandola mammaria4, l'intestino5 e la pelle6. Inoltre, questo approccio ha rivelato alterazioni comportamentali cellulari durante lo sviluppo del tumore7, la guarigione delle ferite8,9, l'infiammazione10 e altre diverse patologie in situ. In questo studio, ci concentriamo sul miglioramento dell'accessibilità della microscopia intravitale per visualizzare le dinamiche epiteliali e stromali vive nella pelle intatta del topo. La comprensione dei comportamenti cellulari nella pelle dei mammiferi è di grande importanza clinica a causa della notevole capacità rigenerativa e tumorigenica di questo tessuto.
L'imaging intravitale nei topi è stato eseguito principalmente utilizzando microscopi multifotoni verticali grazie alla loro capacità di fornire immagini ad alta risoluzione a profondità tissutali >100 μm11,12. Tuttavia, questi strumenti non hanno la versatilità e l'accessibilità più generale dei microscopi confocali invertiti, che sono più facili da usare ed economici, offrono la capacità di visualizzare cellule in coltura, non richiedono un'oscurità completa durante l'acquisizione delle immagini e sono generalmente più sicuri, tra gli altri notevoli vantaggi13,14. In questo studio, presentiamo un nuovo strumento che migliora significativamente l'accessibilità all'imaging intravitale adattando questo approccio ai microscopi confocali invertiti.
Qui, presentiamo un design dell'inserto del palco personalizzato stampato in 3D che incorpora diverse caratteristiche chiave per facilitare l'imaging intravitale stabile e a lungo termine della pelle dell'orecchio del topo su un microscopio confocale invertito (Figura 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4 e Figura 5). Queste caratteristiche specializzate includono un foro dell'obiettivo sfalsato che consente all'intero corpo di un topo adulto di essere completamente piatto durante l'imaging. Ciò riduce al minimo l'interferenza vibrazionale dei movimenti del corpo del topo sull'imaging ed elimina la necessità di somministrare ketamina e xilazina per smorzare la respirazione, una pratica spesso abbinata all'imaging intravitale6. Inoltre, le staffe angolari sull'inserto posizionano correttamente un cono nasale in isoflurano per allinearlo con la faccia del mouse, una clip auricolare in metallo immobilizza l'orecchio del mouse su un disco coprioggetti costruito su misura e una piastra riscaldante biofeedback a circuito chiuso staccabile opzionale si trova a filo all'interno dell'inserto per supportare la temperatura corporea del mouse durante le lunghe sessioni di imaging. Il disco coprioggetto personalizzato, che fornisce una superficie piana essenziale per la testa e l'orecchio del topo, è stato generato in un'officina meccanica rimuovendo le pareti di un piatto di coltura cellulare contenente vetrino coprioggetti generico. L'uso di una lente a immersione in olio di silicone 40x (apertura numerica 1,25 [N.A.], distanza di lavoro 0,3 mm) in combinazione con il disco coprioggetti e l'inserto del tavolino personalizzato fornisce immagini ad alta risoluzione >50 μm di profondità nel derma dell'orecchio.
Per testare la funzionalità di questo nuovo inserto per microscopio invertito, abbiamo catturato z-stack che coprono tutti gli strati epiteliali epidermici in un corso di tempo di 3 ore nell'orecchio di un topo adulto transgenico vivo K14-H2B-mCherry15 (i nuclei epiteliali in questa linea murina contengono un'etichetta fluorescente rossa) (Figura 6A-A'). Abbiamo anche catturato z-stack che si estendono su diversi strati di fibroblasti all'interno del derma cutaneo in un corso di tempo di 3 ore nell'orecchio di un Pdgfra-rtTA16 transgenico vivo; pTRE-H2B-GFP17 topo adulto (i nuclei dei fibroblasti in questa linea murina contengono un'etichetta fluorescente verde dopo l'induzione della doxiciclina) (Figura 6B-D'). I nostri dati ad alta risoluzione dimostrano una stabilità costante grazie all'assenza di deriva nei piani x, y e z, dimostrando così l'efficacia di questo nuovo strumento di imaging intravitale per l'uso su microscopi invertiti. È importante sottolineare che le dimensioni di questo inserto per tavolino stampato in 3D possono essere regolate, come descritto in File supplementare 1, File supplementare 2 e File supplementare 3, per adattarsi a qualsiasi microscopio invertito e il posizionamento dell'apertura dell'obiettivo può essere spostato in posizioni alternative all'interno dell'inserto per adattarsi meglio all'imaging di un particolare tessuto e/o modello animale di interesse. Questa invenzione può quindi consentire ai singoli laboratori, o ai ricercatori con accesso confocale alla struttura principale, di adattare questo strumento alle loro esigenze uniche di imaging intravitale, semplificando così la valutazione di diverse biologia cellulari in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Printer</td>
			<td>Qudi Tech</td>
			<td>i-Fast</td>
			<td>3D prints using PLA material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x 1.25NA silicone objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxR Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Swab</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76337-046</td>
			<td>Cream/ointment application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td>Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flathead Screwdriver (2.5 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Affiix insert to microscope stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flathead Screws x 4 (#6-32)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Screw insert into microscope stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Culture Dish</td>
			<td>chemglass Life Sciences</td>
			<td>CLS-1811-002</td>
			<td>Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Plate controller</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>TCAT-2LV</td>
			<td>Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex Wrench (1.5 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For M3 setscrew adjustments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex Wrench (2.5 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Adjust tension on metal ear clip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravital Imaging Insert</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>HPA030782-100uL</td>
			<td>Mouse anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling Tape (or Scotch Tape)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10127-458</td>
			<td>Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal fastener</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>used as ear clip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>RRID: IMSR_JAX:034459</td>
			<td>Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: K14-H2BPAmCherry</td>
			<td>Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University</td>
			<td></td>
			<td>Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as &#34;K14-H2B-mCherry&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK 
			Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>RRID: IMSR_JAX:005104</td>
			<td>&#160;Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose Sealing Wrap</td>
			<td>Glad</td>
			<td></td>
			<td>Enhance mouse warmth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optixcare</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MSPP-078932779</td>
			<td>Eye lubricant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Set screws x 3 (M3; 6 mm)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SS3M6</td>
			<td>Attachment for heatplate module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Immersion Oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Applied to 40x silicone objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Heating Plate</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>HP-4M</td>
			<td>Provides heat to animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SF-01</td>
			<td>Mouse anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Grease</td>
			<td>Flinn Scientific</td>
			<td>AP1095</td>
			<td>Seals coverslip disk to insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>hair removal&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water circulating heat pad</td>
			<td>Stryker Medical</td>
			<td>TP700</td>
			<td>for mouse revival post-imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

streamlined intravital imaging approach for long-term monitoring of epithelial tissue dynamics on an inverted confocal microscope

Comprendere i comportamenti cellulari normali e aberranti in vivo è necessario per sviluppare interventi clinici per contrastare l'inizio e la progressione della malattia. È quindi fondamentale ottimizzare gli approcci di imaging che facilitano l'osservazione della dinamica cellulare in situ, dove la struttura e la composizione del tessuto rimangono imperturbate. L'epidermide è la barriera più esterna del corpo, nonché la fonte dei tumori umani più diffusi, vale a dire i carcinomi cutanei cutanei. L'accessibilità del tessuto cutaneo rappresenta un'opportunità unica per monitorare i comportamenti delle cellule epiteliali e dermiche in animali intatti utilizzando la microscopia intravitale non invasiva. Tuttavia, questo sofisticato approccio di imaging è stato realizzato principalmente utilizzando microscopi multifotoni verticali, che rappresentano una barriera significativa per l'ingresso per la maggior parte dei ricercatori. Questo studio presenta un inserto per microscopio stampato in 3D progettato su misura adatto per l'uso con microscopi confocali invertiti, semplificando l'imaging intravitale a lungo termine della pelle dell'orecchio in topi transgenici vivi. Riteniamo che questa invenzione versatile, che può essere personalizzata per adattarsi alla marca e al modello di microscopio invertito scelto e adattata per visualizzare sistemi di organi aggiuntivi, si rivelerà preziosa per la più ampia comunità di ricerca scientifica migliorando significativamente l'accessibilità della microscopia intravitale. Questo progresso tecnologico è fondamentale per rafforzare la nostra comprensione delle dinamiche delle cellule vive in contesti normali e patologici.

Intravital microscopy is a powerful tool that allows the monitoring of cell behaviors in their unperturbed in vivo environments. This unique method has provided key insights into the inner workings of complex mammalian organ systems, including the lung1, brain2, liver3, mammary gland4, intestine5, and skin6. Furthermore, this approach has revealed cell behavioral alterations during tumor development7, wound healing8,9, inflammation10, and other diverse pathologies in situ. In this study, we focus on enhancing the accessibility of intravital microscopy to image live epithelial and stromal dynamics in intact mouse skin. Understanding cell behaviors in mammalian skin is of high clinical importance due to the remarkable regenerative and tumorigenic capacity of this tissue.
Intravital imaging in mice has&#160;been primarily performed using upright multiphoton microscopes due to their ability to provide high-resolution imaging at tissue depths &#62;100 &#181;m11,12. Nevertheless, these instruments&#160;lack the workhorse versatility and more general accessibility of inverted confocal microscopes, which are more user-friendly and cost-effective, provide the ability to image cultured cells, do not require complete darkness during image acquisition, and are generally safer, among other notable advantages13,14. In this study, we present a new tool that significantly enhances intravital imaging accessibility by adapting this approach for inverted confocal microscopes.
Here, we present a 3D-printed custom stage insert design that incorporates several key features to facilitate stable, long-term intravital imaging of mouse ear skin on an inverted confocal microscope (Figure 1, Figure 2, Figure 3, Figure 4, and Figure 5). These specialized features include an offset objective hole that allows the full body of an adult mouse to lay entirely flat during imaging. This minimizes the vibrational interference of mouse body movements on imaging and eliminates the need to administer ketamine and xylazine to dampen breathing, a practice often coupled with intravital imaging6. In addition, corner brackets on the insert correctly position an isoflurane nose cone to align with the face of the mouse, a metal ear clip immobilizes the mouse ear to a custom-built coverslip disk, and an optional detachable closed-loop biofeedback heat plate lies flush within the insert to support the mouse body temperature during long imaging sessions. The custom coverslip disk, which provides a flat surface essential for the mouse head and ear to lay flat, was generated in a machine shop by removing the walls of a generic coverslip-containing cell culture dish. The use of a 40x silicone oil immersion lens (1.25 numerical aperture [N.A.], 0.3 mm working distance) in conjunction with the coverslip disk and custom stage insert provides high resolution images &#62;50 &#181;m deep into the ear dermis.
To test the functionality of this new inverted microscope stage insert, we captured z-stacks spanning all epidermal epithelial layers over a 3 h time course in the ear of a live transgenic K14-H2B-mCherry15 adult mouse (epithelial nuclei in this mouse line contain a red fluorescent label) (Figure 6A-A&#39;). We also captured z-stacks spanning several fibroblast layers within the skin dermis over a 3 h time course in the ear of a live transgenic Pdgfra-rtTA16; pTRE-H2B-GFP17 adult mouse (fibroblast nuclei in this mouse line contain a green fluorescent label following doxycycline induction) (Figure 6B-D&#39;). Our high-resolution data demonstrate consistent stability by lack of drift in the x-, y-, and z-planes, thus proving the effectiveness of this new intravital imaging tool for use on inverted microscopes. Importantly, the dimensions of this 3D-printed stage insert can be adjusted, as described in Supplementary File 1, Supplementary File 2, and Supplementary File&#160;3, to fit any inverted microscope, and the positioning of the objective opening can be moved to alternative locations within the insert to better suit imaging a particular tissue and/or animal model of interest. This invention can thus empower individual laboratories, or investigators with core facility confocal access, to adapt this tool for their unique intravital imaging needs, thereby streamlining evaluation of diverse in vivo cell biology.

Autore in primo piano: Sviluppo di uno strumento per l'utilizzo di microscopi confocali invertiti per l'imaging intravitale in vivo 

Approccio semplificato di imaging intravitale per il monitoraggio a lungo termine della dinamica del tessuto epiteliale su un microscopio confocale invertito

We developed a tool to perform intravital imaging on live mice using an inverted confocal microscope. This enables us to track skin cell dynamics throughout homeostasis and compare cell behaviors during disease onset and progression. Multiphoton microscopy is the primary approach applied to achieve intravital cell tracking.However, the disadvantages of these microscopes include limited day-to-day imaging versatility, high cost, and technical complexity. Our new tool enables the use of versatile inverted confocal microscopes for in vivo intravital imaging. By modifying the design file, the stage insert dimensions can be customized to fit any make of inverted microscope.The objective hole can be resized and repositioned to fit any animal model and tissue of choice.

Il corretto assemblaggio dell'inserto di imaging dal vivo su un microscopio confocale invertito e l'orientamento appropriato di un topo transgenico in cima all'inserto sono convalidati acquisendo pile z di tessuto dell'orecchio vivo marcato con fluorescenza in un corso di tempo ≥1 ora con evidenza minima di deriva negli assi x, y e z. Le immagini devono essere acquisite a intervalli coerenti (il tempo di intervallo dipenderà dalla domanda biologica, dalla forza del segnale di fluorescenza, ecc.) in modo che la dinamic...

Watch this Scientific Journal Video about Developing a Tool for Using Inverted Confocal Microscopes for In Vivo Intravital Imaging at JoVE.com

Il protocollo presenta un nuovo strumento per semplificare l'imaging intravitale utilizzando la microscopia confocale invertita.

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...

Abbiamo sviluppato uno strumento per eseguire l'imaging intravitale su topi vivi utilizzando un microscopio confocale invertito. Questo ci permette di monitorare le dinamiche delle cellule della pelle durante l'omeostasi e di confrontare i comportamenti delle cellule durante l'insorgenza e la progressione della malattia. La microscopia multifotone è l'approccio principale applicato per ottenere il tracciamento intravitale delle cellule.Tuttavia, gli svantaggi di questi microscopi includono la limitata versatilità di imaging quotidiano, il costo elevato e la complessità tecnica. Il nostro nuovo strumento consente l'uso di versatili microscopi confocali invertiti per l'imaging intravitale in vivo. Modificando il file di progettazione, le dimensioni dell'inserto del tavolino possono essere personalizzate per adattarsi a qualsiasi marca di microscopio invertito.Il foro dell'obiettivo può essere ridimensionato e riposizionato per adattarsi a qualsiasi modello animale e tessuto a scelta.

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Research

JoVE Journal

Biology

Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope

1.1K Views.  Emory University School of Medicine. Abbiamo sviluppato uno strumento per eseguire l'imaging intravitale su topi vivi utilizzando un microscopio confocale invertito. Questo ci permette di monitorare le dinamiche delle cellule della pelle durante l'omeostasi e di confrontare i comportamenti delle cellule durante l'insorgenza e la progressione della malattia. La microscopia multifotone è l'approccio principale applicato per ottenere il tracciamento intravitale delle cellule.Tuttavia, gli svantaggi di questi microscopi incl...

Video: Autore in primo piano: Sviluppo di uno strumento per l'utilizzo di microscopi confocali invertiti per l'imaging intravitale in vivo 

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It is therefore critical to optimize imaging approaches that facilitate the observation of cell dynamics in situ, where tissue structure and composition remain unperturbed. The epidermis is the body&#39;s outermost barrier, as well as the source of the most prevalent human cancers, namely cutaneous skin carcinomas. The accessibility of skin tissue presents a unique opportunity to monitor epithelial and dermal cell behaviors in intact animals using noninvasive intravital microscopy. Nevertheless, this sophisticated imaging approach has primarily been achieved using upright multiphoton microscopes, which represent a significant barrier for entry for most investigators. This study presents a custom-designed, 3D-printed microscope stage insert suitable for use with inverted confocal microscopes, streamlining the long-term intravital imaging of ear skin in live transgenic mice. We believe this versatile invention, which may be customized to fit the inverted microscope brand and model of choice and adapted to image additional organ systems, will prove invaluable to the greater scientific research community by significantly enhancing the accessibility of intravital microscopy. This technological advancement is critical for bolstering our understanding of live cell dynamics in normal and disease contexts.

The protocol presents a new tool to simplify intravital imaging using inverted confocal microscopy.

Ricerca

Biologia

Installing the Live Imaging Insert on an Inverted Microscope Stage

To begin installing the 3D printed live imaging insert on the inverted microscope stage, carefully place the insert into the large microscope stage groove. Using screws, secure each corner of the insert. Slide the heat plate into the side opening of the insert in a plug side down orientation, so the plate lays atop the lower insert grooves with the plug port underneath the stage.Align the grooved circular opening in the insert with a 40 x silicone oil immersion objective and apply silicone oil to the center of the objective. Then using a syringe, apply a small amount of vacuum grease along the grooved circular opening. Lay the cover slip disk on top of the opening to seal it onto the insert.Finally, raise the 40 x objective until it barely touches the bottom of the glass cover slip.

Installazione dell'inserto Live Imaging su un tavolino per microscopio invertito

Mounting the Mouse on the Live Imaging Insert for Intravital Imaging

Before placing the anesthetized mouse on the live imaging insert installed on the inverted microscope stage, thread the isoflurane tubing with the attached nose cone through the corner tubing bracket on the insert. After plugging the heat plate into the controller containing an attached anal thermometer probe and switching it on, transfer the anesthetized mouse from the induction chamber onto the heat plate. Then secure the nose cone onto the mouse.Insert the anal probe into the animal and adjust the controller to maintain a stable body temperature of about 36 degrees Celsius. Cover the properly-positioned mouse with a plastic cling wrap to trap body heat and elevate the body temperature. Position the mouse such that its head aligns with the cover slip disc and immobilize its ear onto the center of the glass cover slip using a metal ear clip or tape.After completing imaging, select the Low Flow option on the electronic vaporizer to cease isoflurane delivery. Transfer the mouse to a heating pad until it becomes ambulatory. After removing the cover slip disc, wipe it clean with lens paper and lens solution.Store it properly to avoid scratches for reuse. Next, detach the anesthetic tubing from the insert bracket and unscrew the insert from the microscope stage. The acquired Z-stacks of fluorescently-labeled live mouse ear tissue showed minimal drift in the x, y and z axes over time, validating the custom 3D printed live imaging inserts.The time points from a three hour time lapse movie of the mCherry positive mouse ear epidermal cells of an adult male mouse revealed a single z plane remaining in focus over the extended time. Similar observations were made from another three-hour time lapse movie of GFP positive ear dermal fibroblasts of an adult female mouse.