Riconosciamo con gratitudine il sostegno della National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31800903, assegnato a W. Zheng) e del Wenzhou Science and Technology Project (n. Y2020426, assegnato a Y. Y. Weng) per questo lavoro.

Tutte le procedure sugli animali descritte in questo studio sono state condotte in conformità con le linee guida delineate nella Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università di Medicina di Wenzhou.
1. Animali
<ol><li>Acquista topi maschi C57BL/6 di età compresa tra 8 e 12 settimane e del peso di 20-22 g.</li>
	<li>Ottenere la linea murina transgenica Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato (Ai9) e topi maschi A2ARflox/flox .</li>
	<li>Assegnare in modo casuale i topi a due gruppi e alloggiarli in gabbie, con un massimo di cinque topi per gabbia, con un ciclo standard di 12 ore di luce/12 ore di buio per 1 settimana.</li>
	<li>Fornire ai topi cibo e acqua a sufficienza e mantenerli a una temperatura costante di 25 °C.</li>
</ol>2. Knockdown ChP-specifico di A 2ARs con AAV2/5-shRNA
<ol><li>Pesa ogni mouse e annota i valori.</li>
	<li>Anestetizzare i topi per via intraperitoneale con pentobarbital sodico all'1% al dosaggio di 6-8 ml/kg equivalenti a 60-80 mg/kg di pentobarbital e posizionare il mouse su un termoforo per tenerlo al caldo. NOTA: È fondamentale somministrare il corretto dosaggio di pentobarbital sodico in base al peso del topo per garantire il successo dell'intervento. L'anestesia non deve essere troppo profonda, in quanto potrebbe causare mortalità, ma non deve essere troppo superficiale, poiché il topo potrebbe svegliarsi durante la procedura, compromettendo potenzialmente l'efficacia dell'iniezione del virus. Verificare la corretta dose di anestesia pizzicando le dita dei piedi e assicurandosi che i topi non rispondano.</li>
	<li>Usa un rasoio per topi specializzato per tagliare i peli superiori dei topi anestetizzati .</li>
	<li>Applicare un unguento per gli occhi su entrambi gli occhi per evitare che si secchino e fissare i topi su un apparato stereotassico per immobilizzare il cervello. Copri l'animale con un telo sterile.</li>
	<li>Sterilizzare accuratamente la pelle della testa e del collo dei topi con tre cicli di disinfettante iodoforo e alcol al 75% per ridurre l'infezione postoperatoria. Quindi applicare l'1% di lidocaina per via topica sul cuoio capelluto dei topi e praticare una piccola incisione per esporre completamente il cranio al microscopio. NOTA: Utilizzare strumenti sterili durante tutta la procedura.</li>
	<li>Preparare due siringhe da 10 μL: una con AAV2/5-A2AR-shRNA acquistata (titolo: 6,27 × 109 vg/μL) e l'altra con AAV2/5-Scramble acquistata (titolo: 6,21 × 109 vg/μL). NOTA: Quando si utilizza la siringa, l'estremità anteriore deve essere collegata a un capillare di vetro ed è possibile ottenere un intervallo di 10 μL controllando la lunghezza del capillare di vetro.</li>
	<li>Utilizzare il microscopio per individuare il bregma e il lambda e impostare il punto di coordinate (AP: -0,58; ML: ±1,10; DL: -2.20) sulla siringa da 10 μL (Figura 1). Il punto di coordinate si basa sull'atlante stereotassico15 del cervello del topo.</li>
	<li>Praticare un piccolo foro nel cranio nel punto di coordinate regolato. NOTA: Al microscopio, la perforazione viene eseguita utilizzando una microfresa sterile contro la superficie del cranio. Dopo la perforazione, rimuovendo le meningi che coprono il cervello ed esponendo il parenchima cerebrale sottostante, si prevengono lesioni ai vasi sanguigni. Questo passaggio impedisce che la punta del capillare di vetro venga spezzata dalle meningi. Il diametro del foro praticato deve essere sufficiente per consentire alla punta dell'ago di entrare nel tessuto cerebrale.</li>
	<li>Somministrare 2 μL di virus AAV2/5-A2AR-shRNA nel ventricolo cerebrale tramite iniezione laterale a una velocità costante di 100 nL/min. Tenere l'ago in posizione per 10 minuti prima di estrarlo. Si noti che il virus è stato somministrato con iniezione unilaterale.</li>
	<li>Sigillare prontamente la pelle lesa utilizzando colla medica di biofibrina per prevenire la perdita di virus, che può essere risciacquata con liquido cerebrospinale dopo aver rimosso l'ago se la colla non viene applicata rapidamente. Inoltre, non utilizzare cotton fioc per pulire il liquido cerebrospinale, poiché potrebbe anche causare la perdita di virus.</li>
	<li>Per facilitare il recupero, posizionare il mouse su un termoforo per mantenere la temperatura corporea a 37,0 ± 0,5 °C e applicare l'1% di lidocaina per via topica sul cuoio capelluto del topo. Lasciare che i topi si riprendano per 2 settimane prima di indurre il modello EAE, poiché questo periodo è necessario per l'espressione del virus AAV2/5-A 2A R-shRNA e il successivo knockdown diA 2AR.</li>
</ol>3. Knockdown specifico per ChP di A 2AR con un sistema Cre/locus di X-overP1 (Cre/LoxP)
NOTA: Le seguenti procedure possono essere eseguite utilizzando il metodo descritto in precedenza. Fare riferimento ai passaggi 2.1-2.11 per i metodi di iniezione dettagliati.
<ol><li>Iniettare 2 μL di CRE-TAT ricombinasi in ciascun ventricolo laterale di un topo Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato come gruppo sperimentale e 2 μL di soluzione fisiologica sterile tamponata con fosfato (PBS) come gruppo di controllo. Utilizzando lo stesso protocollo di cui sopra (paragrafo 2), iniettare 2 μL di CRE-TAT ricombinasi in ciascuno dei ventricoli laterali di topi flox A2AR flox/flox insieme a 2 μL di PBS sterile come gruppo di controllo.</li>
	<li>Preparare sezioni di tessuto congelate ed eseguire la colorazione nucleare 2 settimane dopo l'iniezione di ricombinasi CRE-TAT. Per ulteriori informazioni, vedere i passaggi 4.1-4.3.</li>
</ol>4. Perfusione transcardica nei topi
<ol><li>Somministrare 60-80 mg/kg di pentobarbital sodico per anestetizzare in profondità i topi. Confermare il piano dell'anestesia pizzicando un dito del piede ed eseguire la perfusione transcardica utilizzando 40 mL di soluzione sterile di PBS seguita da 20 mL di paraformaldeide (PFA) al 4%. NOTA: Il successo della perfusione è indicato da un colore bianco nel fegato, mentre la presenza di polmoni ingrossati o di deflusso di PBS dalla bocca durante la perfusione suggerisce un fallimento della procedura.</li>
	<li>Estrai rapidamente il cervello del topo, garantendo una degradazione minima delle proteine.</li>
	<li>Immergere il cervello del topo in PFA/PBS al 4% durante la notte per la post-fissazione, seguita dalla sostituzione con una soluzione di PB al 30% di saccarosio per 72 ore. NOTA: È fondamentale evitare un'eccessiva disidratazione del tessuto cerebrale, quindi il cervello non deve essere lasciato nella soluzione di saccarosio PB per troppo tempo.</li>
</ol>5. Sezionamento e colorazione dei tessuti congelati
<ol><li>Incorporare il cervello di topo precedentemente disidratato in colla a temperatura di taglio ottimale (OCT), congelare il cervello incorporato e utilizzare un microtomo scorrevole per tagliare sezioni coronali con uno spessore di 20 μm.</li>
	<li>Posiziona le sezioni cerebrali sul vetrino. Una volta che le sezioni cerebrali sono asciutte, conservarle in frigorifero a -20 °C per gli esperimenti successivi.</li>
	<li>Metti ogni vetrino in una custodia e immergi il telaio in un contenitore pieno di PBS per risciacquare accuratamente il vetrino. Sciacquare delicatamente i vetrini cerebrali con la soluzione PBS tre volte, per 10 minuti ogni volta. NOTA: Prestare attenzione per evitare che le sezioni cerebrali cadano dal vetrino.</li>
	<li>Colorare i vetrini cerebrali con una soluzione di 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per 10 minuti.</li>
	<li>Sciacquare i vetrini cerebrali con soluzione PBS per 5 minuti.</li>
	<li>Applicare una goccia di mezzo di montaggio antisbiadimento sulle sezioni cerebrali.</li>
	<li>Posiziona un vetrino coprioggetto sulle sezioni cerebrali, sigilla il vetrino coprioggetto con smalto per unghie e analizza le sezioni utilizzando un microscopio a fluorescenza convenzionale.</li>
</ol>6. Induzione EAE
NOTA: Eseguire l'induzione EAE dopo 2 settimane dall'iniezione di shRNA o CRE-TAT ricombinasi11.
<ol><li>Creare una soluzione acquosa mescolando 2,5 mg di glicoproteina oligodendrocitaria mielinica (MOG35-55) con 2 mL di PBS. Preparare una soluzione completa di olio adiuvante di Freunds (CFA) mescolando M. tuberculosis (H37Ra) con adiuvante di Freunds (IFA) incompleto.</li>
	<li>Mescolare le soluzioni acquose e oleose in rapporto 1:1. Usa una pipa a T per montare la miscela in uno stato di olio in acqua. NOTA: Il tubo a T è anche chiamato tubo a tre vie. È un tubo di plastica in grado di controllare la direzione del flusso della soluzione per miscelare completamente il MOG35-55 e il CFA.</li>
	<li>Utilizzare un omogeneizzatore ad alta velocità per produrre l'emulsione dell'antigene MOG per il modello EAE in condizioni di bagno di ghiaccio.</li>
	<li>Anestetizzare i topi per via intraperitoneale con pentobarbital sodico all'1% alla dose di 6-8 ml/kg equivalenti a 60-80 mg/kg di pentobarbital.</li>
	<li>Iniettare per via sottocutanea l'emulsione dell'antigene MOG in quattro punti diversi (collo, schiena, fianchi sinistro e destro) a un volume di 10 ml/kg per un totale di quattro iniezioni ciascuna. NOTA: È importante selezionare attentamente il sito di iniezione, poiché siti diversi possono avere effetti diversi sulla morbilità e sulla mortalità dei topi. Inoltre, ripetute iniezioni di MOG possono portare alla tolleranza immunitaria, quindi il team di ricerca ha scelto un singolo metodo di iniezione per prevenire questo potenziale problema.</li>
	<li>Iniettare immediatamente 500 ng/mL di tossina della pertosse (PT) per via intraperitoneale alla dose di 5 mg/kg dopo l'iniezione di MOG. NOTA: Il PT aumenta la permeabilità della barriera emato-encefalica (BBB) e facilita l'infiltrazione delle cellule T nel cervello.</li>
	<li>Dopo 48 ore, iniettare per via intraperitoneale la soluzione di PT allo stesso volume.</li>
</ol>7. Punteggio di deficit neurologico
<ol><li>Valutare e classificare i topi giornalmente utilizzando una scala di valutazione 16 che va da 0 a15 per valutare l'incidenza e la gravità dell'EAE in base ai seguenti deficit neurologici: Coda: 0 indica l'assenza di segni, 1 rappresenta una coda semiparalizzata e 2 indica una coda completamente paralizzata. Arti: 0 indica l'assenza di segni, 1 rappresenta un'andatura debole o alterata, 2 indica la paresi e 3 rappresenta un arto completamente paralizzato.</li>
	<li>Assegna un punteggio di 12 a un animale tetraplegico con paralisi completa e assegna un punteggio di 15 alla mortalità.</li>
</ol>8. Colorazione con ematossilina-eosina (H&E)
<ol><li>Prendi il cervello di topo disidratato e incorporalo in paraffina fusa. Lasciare raffreddare e solidificare il blocco di paraffina per un uso successivo. NOTA: Il blocco di paraffina deve essere completamente asciutto e fresco per evitare danni ai tessuti.</li>
	<li>Tagliare il blocco di paraffina cerebrale di topo in vetrini spessi 5 μm. Disporre la sezione di cervello di topo di paraffina su un vetrino e asciugarla in forno a 60 °C per 3 ore.</li>
	<li>Immergere i vetrini in sequenza nella soluzione di xilene I per 10 min, nella soluzione di xilene II per 10 min, nell'alcol 100% I per 3 min, nell'alcol 100% II per 3 min, nell'alcol al 95% per 3 min, nell'alcol al 90% per 3 min, nell'alcool all'80% per 3 min, nell'alcool al 70% per 3 min e nell'acqua distillata per 1 min.</li>
</ol>9. Analisi quantitativa della reazione a catena della polimerasi (qPCR)
<ol><li>Dopo aver perfuso i topi con PBS, rimuovere il ChP dai ventricoli ed estrarre l'RNA con Trizol. Sintetizzare il cDNA utilizzando il primo kit di sintesi del cDNA a filamento.</li>
	<li>Eseguire l'analisi qPCR utilizzando la premiscela Ex Taq SYBR-green e un sistema di PCR in tempo reale. Utilizzare i seguenti primer A2AR: avanti - GCCATCCCATTCGCCATCA; inverso - GCAATAGCCAAGAGGCTGAAGA.</li>
</ol>

Silenziamento genico selettivo nel plesso coroideo

<ol>
	<li>Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+secretion+by+the+choroid+plexus.">Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus.</a> Physiological Reviews. 93 (4), 1847-1892 (2013).</li><li>Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. 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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti o altre divulgazioni da dichiarare.

La ricerca ha presentato due approcci distinti per il knockdown mirato dei geni ChP. Il primo approccio prevedeva l'iniezione ICV di CRE-TAT, che contiene Cre ricombinasi, in topi flox A2AR/flox. Il secondo approccio ha comportato l'iniezione ICV di AAV2/5 trasportatore di shRNA di A2AR. Utilizzando queste due strategie, il lavoro ha ottenuto il knockdown selettivo di A 2A R all'interno del ChP ed è stato in grado di dimostrare gli effetti protettivi dell'inibizione della segnalazione di...

Si è spesso pensato che il plesso coroideo (ChP) aiutasse a mantenere l'omeostasi funzionale del cervello secernendo liquido cerebrospinale (CSF) e fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF)1,2. L'aumento della ricerca negli ultimi tre decenni ha rivelato che il ChP rappresenta un percorso distinto per l'infiltrazione delle cellule immunitarie nel sistema nervoso centrale (SNC).
Le giunzioni strette (TJ) del ChP, composte da un epitelio ChP monostrato, mantengono l'omeostasi immunologica impedendo alle macromolecole e alle cellule immunitarie di entrare nel cervello3. Tuttavia, in determinate condizioni patologiche, il tessuto ChP rileva e risponde ai modelli molecolari associati al pericolo (DAMP) nel liquido cerebrospinale e nel sangue, portando a infiltrazioni immunitarie anomale e disfunzioni cerebrali 4,5. Nonostante il suo ruolo critico, le piccole dimensioni del ChP e la sua posizione unica nel cervello rendono difficile studiarne la funzione senza influenzare altre regioni cerebrali. Pertanto, manipolare l'espressione genica in modo specifico nel ChP è un approccio ideale per comprenderne la funzione.
Inizialmente, le linee transgeniche dell'enzima di ricombinazione della ciclizzazione (Cre), che esprimono Cre sotto il controllo di promotori specifici per i geni espressi nel ChP, sono state comunemente utilizzate per eliminare i geni bersaglio mediante l'ibridazione con i geni candidatifloxed 6,7,8. Ad esempio, il fattore di trascrizione Forkhead box J1 (FoxJ1) è espresso esclusivamente nell'epitelio ChP del cervello prenatale del topo7. Pertanto, la linea FoxJ1-Cre è stata spesso utilizzata per eliminare i geni situati nel ChP 6,9. Tuttavia, il successo di questa strategia dipende fortemente dalla specificità del promotore. Si scoprì gradualmente che il modello di espressione di FoxJ1 non era abbastanza distintivo, poiché FoxJ1 era presente anche nelle cellule epiteliali ciliate in altre parti del cervello e del sistema periferico7. Per superare questa limitazione, è stata eseguita un'iniezione intra-cerebroventricolare (ICV) di Cre ricombinasi per veicolare la ricombinasi nei ventricoli delle linee transgeniche floxate. Questa strategia ha mostrato un'elevata specificità, come evidenziato dalla presenza di fluorescenza tdTomato esclusivamente nel tessuto ChP10,11. Tuttavia, questo metodo è ancora limitato dalla disponibilità di linee di topi transgenici floxati. Per affrontare questo problema, i ricercatori hanno impiegato l'iniezione ICV di virus adeno-associato (AAV) per ottenere il knockdown specifico per ChP o la sovraespressione dei geni bersaglio12,13. Una valutazione completa di diversi sierotipi di AAV per l'infezione da ChP ha rivelato che AAV2/5 e AAV2/8 mostrano forti capacità di infezione nel ChP, pur non infettando altre regioni cerebrali. Tuttavia, è stato riscontrato che AAV2/8 infetta l'ependima che circonda i ventricoli, mentre il gruppo AAV2/5 non ha mostrato alcuna infezione14. Questo metodo ha il vantaggio di superare i limiti dell'acquisizione di animali transgenici floxati.
Questo articolo descrive un protocollo passo-passo per il knockdown genico nel ChP utilizzando due metodi: ICV di AAV2/5 che trasporta shRNA del recettore dell'adenosina A 2A (A 2AR) e proteina ricombinasi Cre costituita dalla sequenza TAT (CRE-TAT) ricombinasi per ottenere il knockdown specifico per ChP di A2A R. I risultati dello studio suggeriscono che abbattere A2AR nella ChP può alleviare l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE). Questo protocollo dettagliato fornisce una guida utile per gli studi sulla funzione della ChP e per il knockdown specifico dei geni nella ChP.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A2ARflox/flox mice</td>
			<td>State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV2/5-A2AR-ShRNA virus</td>
			<td>Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD</td>
			<td>pt-4828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antifade mounting medium</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillary</td>
			<td>Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd</td>
			<td>B100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>brain stereotaxic apparatus</td>
			<td>RWD, Shenzhen</td>
			<td>69100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRE-TAT recombinase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Absin</td>
			<td>B25A031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>frozen slicing machine</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H37Ra</td>
			<td>Becton Dickinson and company</td>
			<td>231141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton, American</td>
			<td>P/N:&#160;86259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incomplete Freunds adjuvant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F5506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOG35-55</td>
			<td>Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>4010006243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT glue</td>
			<td>Epredia</td>
			<td>6502p</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Chengdu Kelong Chemical Reagent Company</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pentobarbital sodium</td>
			<td>Boyun Biotech</td>
			<td>PC13003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette gun</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>N45014F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Takara</td>
			<td>&#160;6110A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real- Time PCR System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>CFX96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A502792-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>super high speed homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3737025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylene solution</td>
			<td>Chengdu Kelong Chemical Reagent Company</td>
			<td>1330-20-7</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted knockdown of genes in the choroid plexus

Il plesso coroideo (ChP) funge da porta d'accesso critica per l'infiltrazione delle cellule immunitarie nel sistema nervoso centrale (SNC) sia in condizioni fisiologiche che patologiche. Recenti ricerche hanno dimostrato che la regolazione dell'attività di ChP può offrire protezione contro i disturbi del SNC. Tuttavia, studiare la funzione biologica del ChP senza influenzare altre regioni del cervello è impegnativo a causa della sua delicata struttura. Questo studio presenta un nuovo metodo per il knockdown genico nel tessuto ChP utilizzando virus adeno-associati (AAV) o proteina ricombinasi dell'enzima di ricombinazione della ciclizzazione (Cre) costituita dalla sequenza TAT (CRE-TAT). I risultati dimostrano che dopo l'iniezione di AAV o CRE-TAT nel ventricolo laterale, la fluorescenza è stata concentrata esclusivamente nel ChP. Utilizzando questo approccio, lo studio ha abbattuto con successo il recettore dell'adenosina A2A (A 2AR) nel ChP utilizzando l'interferenza dell'RNA (RNAi) o Cre/locus dei sistemi X-overP1 (Cre/LoxP) e ha dimostrato che questo knockdown potrebbe alleviare la patologia dell'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE). Questa tecnica può avere importanti implicazioni per la ricerca futura sul ruolo della ChP nei disturbi del SNC.

The choroid plexus (ChP) was often thought to help maintain brain functional homeostasis by secreting cerebrospinal fluid (CSF) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF)1,2. Increasing research over the last three decades has revealed that the ChP represents a distinct pathway for immune cell infiltration into the central nervous system (CNS).
The tight junctions (TJs) of the ChP, composed of a monolayer ChP epithelium, maintain immunological homeostasis by preventing macromolecules and immune cells from entering the brain3. However, under certain pathological conditions, the ChP tissue detects and responds to danger-associated molecular patterns (DAMPs) in the CSF and blood, leading to abnormal immune infiltration and brain dysfunction4,5. Despite its critical role, the ChP&#39;s small size and unique location in the brain make it difficult to study its function without affecting other brain regions. Therefore, manipulating gene expression specifically in the ChP is an ideal approach to understanding its function.
Initially, cyclization recombination enzyme (Cre) transgenic lines, which express Cre under the control of promoters specific to genes expressed in the ChP, were commonly used to delete target genes by breeding with floxed candidate genes6,7,8. For example, the transcription factor Forkhead box J1 (FoxJ1) is exclusively expressed in the ChP epithelium of the prenatal mouse brain7. Thus, the FoxJ1-Cre line was often used to delete genes located in the ChP6,9. However, the success of this strategy relies heavily on the specificity of the promoter. It was gradually discovered that the FoxJ1 expression pattern was not distinctive enough, as FoxJ1 was also present in ciliated epithelial cells in other parts of the brain and peripheral system7. To overcome this limitation, intra-cerebroventricular (ICV) injection of Cre recombinase was performed to deliver recombinase into the ventricles of floxed transgenic lines. This strategy showed high specificity, as evidenced by the presence of tdTomato fluorescence solely in the ChP tissue10,11. However, this method is still limited by the availability of floxed transgenic mouse lines. To address this issue, researchers have employed ICV injection of adeno-associated virus (AAV) to achieve ChP-specific knockdown or the overexpression of target genes12,13. A comprehensive evaluation of different AAV serotypes for ChP infection revealed that AAV2/5 and AAV2/8 exhibit strong infection abilities in the ChP, while not infecting other brain regions. However, AAV2/8 was found to infect the ependyma surrounding ventricles, whereas the AAV2/5 group showed no infection14. This method has the advantage of overcoming the limitations of acquiring floxed transgenic animals.
This article describes a step-by-step protocol for gene knockdown in the ChP using two methods: ICV of AAV2/5 carrying shRNA of the adenosine A2A receptor (A2AR) and Cre recombinase protein consisting of TAT sequence (CRE-TAT) recombinase to achieve ChP-specific knockdown of A2AR. The study findings suggest that knocking down A2AR in the ChP can alleviate experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This detailed protocol provides useful guidance for ChP function studies and the specific knockdown of genes in the ChP.

Autore in primo piano: Approfondimenti e innovazioni nelle tecniche di manipolazione dell'espressione genica per la ricerca sul plesso coroideo 

Knockdown mirato dei geni nel plesso coroideo

The objective of this research is to investigate the techniques for manipulating gene expression in the choroid plexus. Our study has introduced the two methods that allow for technique exclusively in the choroid plexus without any discernible impact on other regions. Our findings can potentially enhance future function studies of the choroid plexus in neuroscience.Our research has reviewed that inhibiting T-cell infiltration across the choroid plexus through selective lockdown of adenosine to a receptor is sufficient to protect mice from EAE pathology. This finding supports the notion that detecting gateway activity in the choroid plexus could present a promising new strategy for treating multiple sclerosis. This study presents two alternative methods for gene expression manipulation in the choroid plexus.ICV injection of Cre recombinase into those transgenic mice or ICV injection of AAV2/5, or it's targeted SHI in the WT mice. These methods overcome issues with promoting specificity and transgenetic mouse breeding.

Knockdown di A2AR specifico per ChP mediante iniezione ICV di AAV2/5-shRNA o CRE-TAT Il ruolo di A2AR nel ChP come potente regolatore dell'informazione neurale nella patogenesi dell'EAE rimane poco chiaro. Abbattere l'espressione di A 2ARspecifica per ChP potrebbe far luce sugli effetti regolatori di A2AR sul sistema immunitario centrale nell'EAE e in altre infiammazioni del sistema nervoso. Questo studio ha utilizzato l'iniezione ICV di CRE-TAT per ridurre ...

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Qui, descriviamo un metodo per alterare selettivamente le espressioni geniche nel plesso coroideo evitando qualsiasi impatto in altre aree cerebrali.

The choroid plexus (ChP) serves as a critical gateway for immune cell infiltration into the central nervous system (CNS) under both physiological and ...

L'obiettivo di questa ricerca è quello di studiare le tecniche per manipolare l'espressione genica nel plesso coroideo. Il nostro studio ha introdotto i due metodi che consentono di eseguire la tecnica esclusivamente nel plesso coroideo senza alcun impatto percepibile su altre regioni. I nostri risultati possono potenzialmente migliorare i futuri studi sulla funzione del plesso coroideo nelle neuroscienze.La nostra ricerca ha esaminato che l'inibizione dell'infiltrazione delle cellule T attraverso il plesso coroideo attraverso il blocco selettivo dell'adenosina a un recettore è sufficiente per proteggere i topi dalla patologia EAE. Questa scoperta supporta l'idea che il rilevamento dell'attività gateway nel plesso coroideo potrebbe presentare una nuova strategia promettente per il trattamento della sclerosi multipla. Questo studio presenta due metodi alternativi per la manipolazione dell'espressione genica nel plesso coroideo.Iniezione ICV di Cre ricombinasi in quei topi transgenici o iniezione ICV di AAV2/5, o è SHI mirato nei topi WT. Questi metodi superano i problemi legati alla promozione della specificità e all'allevamento transgenico dei topi.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Targeted Knockdown of Genes in the Choroid Plexus

687 Views.  Wenzhou Medical University. L'obiettivo di questa ricerca è quello di studiare le tecniche per manipolare l'espressione genica nel plesso coroideo. Il nostro studio ha introdotto i due metodi che consentono di eseguire la tecnica esclusivamente nel plesso coroideo senza alcun impatto percepibile su altre regioni. I nostri risultati possono potenzialmente migliorare i futuri studi sulla funzione del plesso coroideo nelle neuroscienze.La nostra ricerca ha esaminato che l'inibizione dell'infiltrazione delle cellule...

Video: Autore in primo piano: Approfondimenti e innovazioni nelle tecniche di manipolazione dell'espressione genica per la ricerca sul plesso coroideo 

The choroid plexus (ChP) serves as a critical gateway for immune cell infiltration into the central nervous system (CNS) under both physiological and pathological conditions. Recent research has shown that regulating ChP activity may offer protection against CNS disorders. However, studying the biological function of the ChP without affecting other brain regions is challenging due to its delicate structure. This study presents a novel method for gene knockdown in ChP tissue using adeno-associated viruses (AAVs) or cyclization recombination enzyme (Cre) recombinase protein consisting of TAT sequence (CRE-TAT). The results demonstrate that after injecting AAV or CRE-TAT into the lateral ventricle, the fluorescence was exclusively concentrated in the ChP. Using this approach, the study successfully knocked down the adenosine A2A receptor (A2AR) in the ChP using RNA interference (RNAi) or Cre/locus of X-overP1 (Cre/LoxP) systems, and showed that this knockdown could alleviate the pathology of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This technique may have important implications for future research on the ChP's role in CNS disorders.

Here, we describe a method to selectively alter gene expressions in the choroid plexus while avoiding any impact in other brain areas.

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ChP Specific Knockdown of A2ARs with AAV2/5-shRNA and Cre/LoxP System

ChP Specific Knockdown of A2ARs with AAV2/5-shRNA and Cre/LoxP System  

To begin, place the anesthetized mice on the surgical platform. After trimming the hair, apply eye ointment down both eyes to prevent them from drying. Then fix the mice onto a stereotaxic apparatus for immobilization.Make a small incision under a microscope to fully expose the skull. Prepare two 10 microliter syringes, one containing AAV2/5-adenosine 2A receptor shRNA, and the other containing AAV2/5 scramble. Then use the microscope to locate the bregma and lambda and set the coordinate point on the 10 microliter syringe based on the mouse brain stereotaxic atlas.Drill a small hole in the skull at the established coordinate point. Inject two microliters of AAV2/5-Adenosine 2A receptor shRNA virus into the brain ventricle via lateral injection at a steady rate of 100 nanoliters per minute. Keep the needle in place for 10 minutes before withdrawing.Seal the injured skin promptly using medical bio fibrin glue to prevent virus loss. Place the mouse on a heating pad, maintaining its body temperature approximately at 37 degrees Celsius to facilitate recovery. Inject two microliters of CRE-TAT Recombinase into each lateral ventricle of Arosa L-D-L-T-D tomato mouse for the experimental group, and two microliters of sterile PBS for the control group.Two weeks after the CRE-TAT Recombinase injection, prepare frozen tissue sections, perform nuclear staining and prepare the slide for imaging Knocking down adenosine 2A receptor in the choroid plexus in homozygous adenosine 2A receptor fluxed mouse, using CRE-TAT, led to decreased EAE clinical scores. Similarly, knocking down choroid plexus in adenosine 2A receptor wild-type mice, using AAV2/5 shRNA decreased EAE clinical scores. The QPCR analysis showed that the mRNA levels of adenosine 2A receptor decreased in the AAV2/5 shRNA and CRE-TAT groups, compared to each control.Silencing adenosine 2A receptor, specifically in the choroid plexus, reduced immune cell infiltration into the spinal cord.