Lo scarabeo della patata del Colorado è uno dei parassiti più gravi della patata nelle zone temperate. Gli studi sull'immunità e sulla patogenesi di questo parassita vengono effettuati principalmente nella fase attiva. Tuttavia, nelle zone temperate, questo parassita trascorre la maggior parte del suo ciclo di vita in uno stato di ibernazione.
In questo studio, presentiamo un metodo per l'ibernazione dello scarabeo della patata del Colorado e una tecnica per la raccolta dei coleotteri in inverno. Il vantaggio principale di questo metodo è che consente di ottenere un numero qualsiasi di individui svernanti per l'analisi del virus in qualsiasi periodo di letargo. Utilizzare gabbie costituite da un telaio rigido in legno con una dimensione di 25 x 25 x 40 centimetri.
Per costruire un telaio per la gabbia, utilizzare doghe di legno spesse almeno due centimetri e larghe quattro. Coprire l'interno della gabbia con una rete in acciaio inossidabile di dimensioni non superiori a cinque per tre millimetri. Fissare la rete con una cucitrice per legno.
Rivestire l'interno della gabbia con un geotessile sintetico nero con una densità di 60 grammi per metro quadrato. Attacca saldamente un tubo di tessuto sintetico traslucido traspirante, alto circa 60 centimetri alla parte superiore della gabbia. Incrociare e fissare due robuste corde al fondo della gabbia per estrarla dal terreno quando necessario.
Scava una buca nel terreno profonda 40 centimetri. Stendere erba secca o fieno sulla buca. Posiziona la gabbia all'interno in modo che il fieno o l'erba secca si trovino tra le pareti della gabbia e il terreno.
Riempi le gabbie con il terreno dello stesso campo di patate in cui vengono raccolti gli insetti. Installare data logger di temperatura e umidità impermeabili nelle gabbie alle profondità richieste. Pianta le piantine di patate all'interno della gabbia tre o quattro settimane prima dell'introduzione del coleottero e annaffiale moderatamente.
Fissare verticalmente un tubo di tessuto sintetico a un bastoncino di qualsiasi materiale installato all'esterno della gabbia. Raccogli manualmente i coleotteri adulti nei campi di patate privi di pesticidi verso la fine della vegetazione delle patate. Conservare i coleotteri raccolti in secchi di plastica da 20 litri contenenti cime di patate per nutrire gli insetti prima di metterli nelle gabbie.
Copri i secchi con un tessuto traspirante. Posiziona non più di 200 individui di coleotteri sulle piante di patate coperte dalla rete di tessuto sintetico. Quando le cime di patate sono consumate, aggiungere quelle fresche messe in un barattolo di plastica contenente acqua e cambiare le cime di patate ogni giorno.
Una volta che tutti gli scarafaggi si sono scavati nel terreno per svernare, slega il tubo di tessuto sintetico dal bastoncino e stendi il tessuto. Rimuovere la neve sopra la superficie della gabbia. Allentare la gabbia su ciascun lato con una pala robusta.
Estrarre la gabbia dal terreno usando delle corde. Porta la gabbia in laboratorio. Rimuovere il terreno dalla gabbia in piccole porzioni, rompere con cura grandi pezzi di terreno e isolare i coleotteri usando una pinzetta.
Separare i coleotteri vivi dai cadaveri. I coleotteri vivi e sani compattano il terreno intorno a loro formando una cavità d'aria, una cosiddetta culla, e quindi si separano facilmente dal terreno. I coleotteri uccisi dai funghi sono mummificati o hanno micelio visibile sulla superficie.
Gli insetti che si decompongono battericamente sono scuri. Setacciare il terreno attraverso un setaccio per assicurarsi che tutti i coleotteri siano isolati e non danneggiati. Collocare i cadaveri con sintomi di un'infezione fungina o di una decomposizione batterica in una singola provetta Falcon sterile per una futura identificazione.
Conservare i coleotteri vivi in frigorifero a una temperatura di 2 gradi Celsius fino all'analisi in contenitori chiusi e ventilati contenenti un batuffolo di cotone umido. Per raccogliere l'emolinfa, praticare una puntura nella parte laterale dell'addome sotto l'aorta con un ago da insulina. Per isolare l'intestino, tagliare la capsula di testa, spremere tutto il contenuto in una capsula di Petri con tampone fosfato.
Separare l'intestino e purificarlo dal grasso e dai vasi malpighiani. Separa una sezione desiderata dell'intestino, come l'intestino anteriore, l'intestino medio o l'intestino posteriore. Per isolare il corpo adiposo, separarlo dagli altri tessuti dopo l'isolamento dell'intestino.
Per isolare i funghi entomopatogeni dai cadaveri, mettere i cadaveri mummificati in una camera di umidità sterile. Utilizzare i conidi aerei o gli sclerozi del contenuto interno dei coleotteri per la placcatura su agar destrosio Sabouraud con acido lattico allo 0,4%. Isolare i batteri dai cadaveri con sintomi di carie batterica.
Tagliare la testa di uno scarabeo, spremere il contenuto interno e raccoglierlo in tubi per la successiva placcatura su terreni per batteri. Temperature sotto lo zero nelle gabbie a 30 centimetri di profondità, sono state registrate dalla fine di novembre all'inizio di aprile. La temperatura media durante questo periodo è stata di 3,3 0,1 gradi Celsius.
La temperatura più bassa registrata è stata di 7,9 gradi Celsius a metà febbraio. La mortalità degli insetti è aumentata durante il letargo e ha raggiunto un massimo in primavera prima dell'emersione. Il numero iniziale di coleotteri era di 2.000, di cui 1.470 individui sono sopravvissuti.
Pertanto, il tasso di sopravvivenza dei coleotteri durante il letargo è stato del 61%Un'analisi di 530 cadaveri ha mostrato che durante il periodo di ibernazione il 53% di essi era caratterizzato da sintomi di decomposizione batterica e il 25% era caratterizzato da sintomi di infezione fungina. La Beauveria dominava tra le colture isolate di funghi entomopatogeni. Metarhizium, Cordyceps e Lecanicillium erano molto meno comuni.
Tra i batteri isolati dai cadaveri con sintomi di decomposizione batterica, sono state identificate specie appartenenti ai generi Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas, Serratia, Rahnella e Glutamicibacter. L'utilizzo di questo metodo può risolvere il problema di ottenere scarabei della patata del Colorado dal campo in inverno. Permette di ottenere tutti gli individui di cui hai bisogno con il basso tasso di mortalità degli insetti.
Lo studio dei vari aspetti del letargo dei coleotteri è importante sia dal punto di vista fondamentale che applicativo per migliorare l'approccio al controllo di questo parassita. E, naturalmente, questa tecnica può essere adattata ad altre specie di insetti che svernano nel terreno.
