Questa pubblicazione è stata sostenuta da una sovvenzione del Department of Education (premio PR n #P031C160025-17, il titolo del progetto: 84,031 C) alle comunità Colorado State University-Pueblo (CSU-Pueblo) per costruire staminali attivo impegno (C-BASE). Ringraziamo corrente zoologia ed Elsevier per fornire i diritti per utilizzare i risultati rappresentativi pubblicati in precedenti lavori, come pure la redazione di Giove per averci fornito l'opportunità di pubblicare questo protocollo. Vorremmo anche ringraziare il programma C-BASE, Dr. Brian Vanden Heuvel (C-BASE e dipartimento di biologia, CSU-Pueblo), dipartimento di biologia di CSU-Pueblo, Thomas Graziano, Dr. Bernard Possidente (dipartimento di biologia, Skidmore College) e Dr. Claire Varian Ramos (Dipartimento di biologia, Pueblo Colorado State University) per il loro sostegno e assistenza.

Il seguente protocollo è un protocollo sperimentale utilizzato per posteriore specie del genere Drosophila su supporto contaminato quando l'ingestione orale di una tossina è appropriata; altre forme di esposizione sono possibili utilizzando la drosofila modello11,15,16,26. I metodi descritti nel presente protocollo precedentemente sono stati descritti da Hirsch et al. 19 e Peterson et al. 23 , 24 , 25.
1. impostare Stock popolazioni di Drosophila nel laboratorio di ricerca
<ol><li>Impostare un incubatore di controllo ambientale (o piccola camera) alle popolazioni stock house di Drosophila impostando le incubatrici per una temperatura costante, ciclo luce: buio e umidità, a seconda delle preferenze della specie in esame. Nota: Comodo condizioni ambientali variano dipendendo il nativo ecologia della specie scelto per lo studio. Ad esempio, d. melanogaster è originaria dell'Africa sub-sahariana Africa27 e in genere viene mantenuta a 25 ° C, 12:12 ciclo di luce: buio e circa 60% umidità16,18,19,20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 28 , 29 , 30. d'altra parte, p. montana gamma si estende in gran parte del Canada e negli Stati Uniti midwest, una regione molto più freddo; di conseguenza, p. montana è in genere mantenuta a 19 – 20 ° C e, talvolta, un regime di luce 24h per simulare condizioni durante la stagione degli amori31. Per una descrizione più dettagliata delle gamme geografiche di varie specie di Drosophila, vedere il sito Web modelli di speciazione di Drosophila 32.</li>
	<li>
Ottenere un comodo specie di Drosophila e/o la linea inbred da entrambi un centro stock (Vedi tabella materiali), un altro laboratorio di ricerca su richiesta, o Raccogli selvatici, popolazioni geneticamente variabile dal campo. Nota: La procedura seguente spiega i metodi per raccogliere le popolazioni selvatiche, geneticamente variabile della drosofila per mantenere nel laboratorio di ricerca. Questi metodi sono stati modificati da Markow e o ' Grady33 e Werner e Jaenike34 per raccogliere la massima diversità di specie in una volta, piuttosto che di specie particolare di destinazione con uno fonte di esca.<ol>
<li>Congelare una mezza dozzina banane mature nel freezer durante la notte e scongelare prima di tendere trappole esca.</li>
		<li>Preparare più L 1 – 2 bottiglie di plastica dal taglio di una fessura a forma di u nella parte anteriore la bottiglia per consentire mosche essere catturati nella bottiglia di esca e non fuggire. Tappo delle bottiglie di plastica con il loro tappo di bottiglia quindi le mosche non sfuggono via i coperchi.</li>
		<li>Aggiungere la banana decongelata al fondo delle bottiglie in modo che il fondo delle bottiglie contiene circa un pollice di banana. Mettete una fetta di pomodoro maturo in bottiglia. Aggiungere un impasto di lievito (il lievito rimasto dal processo di fabbricazione di birra) alla banana nella parte inferiore della bottiglia in modo che la banana ottiene in ammollo i residui di lievito.</li>
		<li>Aggiungere bastoni di legno (in posizione verticale verticale) alla bottiglia così le mosche hanno un substrato pulito ad allontanarsi sull'impasto di lievito e banana. La figura 1 illustra il prodotto finale di questi metodi.</li>
		<li>Appendere esca bottiglie in alberi durante la notte e controllare che ogni aspirato di bocca di 24 h. vola fuori bottiglie e posizionare singolarmente le femmine in fiale con il mezzo per creare linee di iso-donna. Nota: Linee multi-femminili possono essere create, tuttavia, solo se le femmine di ogni specie possono essere chiaramente identificate. Inoltre, mosche del genere Drosophila occupano nicchie ecologiche diverse e avranno diverse esigenze dietetiche dipendendo quelle nicchie (Werner e Jaenike34); vedere Werner e Jaenike34 per dieta consigli e ricette di cucina.</li>
		<li>Esaminare i figli adulti di1 F sotto il microscopio di dissezione per identificare la specie dei raccolti della drosofila (Vedi Markow e o ' Grady33 e Werner e Jaenike34 per assistenza nell'identificazione delle varie specie ).</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57450/57450fig1.jpg"> Figura 1 : Rappresentazione pittorica di esche e utilizzato per raccogliere le popolazioni selvatiche di Drosophila nel campo. (A) Fly trappole insieme in un sito di campo locale in Colorado. (B) una vista ingrandita del fly trappole insieme a questo sito di campo. <a href="/files/ftp_upload/57450/57450fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol start="3"><li>Mantenere la iso-femmina o le linee multi-femminile in un incubatore di controllo ambientale o una stanza con temperatura costante, ciclo luce: buio e l'umidità. Per effettuare questa operazione, casa Vola in fiale o flaconi in preferito medio e lasciano le femmine gravide depongono le uova nel mezzo. Monitorare le fiale per la presenza di larve e pupe. Nota: Mosche del genere Drosophila occupano nicchie ecologiche diverse e avranno diverse esigenze dietetiche e ambientali abiotiche preferenze dipendendo quelle nicchie33,34. Preferenze ambientali e raccomandazioni dietetiche (e ulteriori istruzioni su allevamento Vola) possono essere trovati in Elgin e Miller28, Shaffer et al. 29, stocker e Gallant30, Markow e o ' Grady33e Werner e Jaenike34. Se utilizzando specie catturati, le condizioni ambientali locali possono essere simulate in incubatrici fino a quando la specie può essere identificata.</li>
	<li>Trasferire le scorte frequentemente a mezzo fresco, scartando vecchie fiale, per mantenere sani linee ed evitare l'infezione da acari. Nota: La frequenza di trasferimento dipenderà il ciclo di vita della specie. Ad esempio, trasferire Drosophila melanogaster ogni 2 settimane a mezzo fresco. Per ulteriori informazioni sul mantenimento di linee in laboratorio, vedere Rand et al. 16, Elgin e Miller28, Shaffer et al. 36di Database 29, stocker e Gallant30, Greenspan35e scienze della formazione.</li>
</ol>2. posteriore della drosofila nel terreno contaminato
Nota: Se il test della drosofila in laboratorio per la prima volta o con un nuovo contaminant(s), identificare la dose letale (Vedi Castaneda et al. 37 e Massie et al. 38 per i metodi) e la DL50 (vedere Castaneda et al. 37 e Akins et al. 39 per metodi) prima. Quindi, eseguire una curva dose-risposta per identificare concentrazioni biologicamente rilevanti per l'output desiderato fenotipica; vedere Hirsch et al. 19 e Zhou et al. 40 per i metodi.
<ol><li>Preparare soluzioni di riserva del mezzo contaminato presso la concentrazione desiderata, dipendendo la chimica del contaminante. Nota: ad esempio, per preparare soluzioni di riserva di PbAc: preparare soluzioni di riserva di acetato di piombo (PbAc) medio aggiungendo contaminante di acqua distillata (dH20) fino al medio realizzato con contaminanti dell'acqua raggiunge la concentrazione desiderata. Ad esempio, una soluzione stock di 1.000 µM PbAc, può essere preparata aggiungendo PbAc al dH20 fino a 1.000 µM PbAc. Diluire la soluzione stock (ad es. il 1.000 µM PbAc soluzione) fino alla concentrazione desiderata (ad esempio 500 µM PbAc) e mantenere queste soluzioni come magazzino pure.</li>
	<li>Preparare il supporto, le linee guida del produttore riportato per servire come mezzo di controllo. Preparare ulteriore supporto, le linee guida del produttore riportato; Tuttavia, supplemento contaminante soluzione preparata per dH20. Nota: ad esempio, se si utilizza un istante media della drosofila , aggiungere circa un cucchiaino da tè istantaneo medio ad un flacone di plastica. Aggiungere circa 5 – 5.5 mL dH20 al mezzo. Cospargere alcuni grani di lievito vivo per preparare il supporto di controllo. Per preparare il supporto sperimentale, integrare la soluzione di riserva (ad esempio 500 µM PbAc) per dH20.</li>
	<li>
Trasferire riproduttivo praticabile maturi maschi e femmine da popolazioni stock nel controllo e il supporto sperimentale. Nota: Il post-eclosion tempo per la maturità riproduttiva è diversa tra le specie di Drosophila 41.<ol>
<li>Picchiettare delicatamente il flaconcino di mosche stock giù con la mano dominante. Garantire che le mosche si sposta automaticamente sul fondo del flaconcino. Con l'altra mano, togliere il tappo del flaconcino mentre toccando il flaconcino e collocare un fresco flacone di controllo o contaminato medio sopra la fiala con le mosche. Tenere le fiale insieme e capovolgerli sopra, picchiettando delicatamente, in modo che le mosche sono trasferite automaticamente al flaconcino fresco di controllo o contaminato medio. Mentre ancora toccando il flaconcino con le mosche, tappo del flaconcino.</li>
		<li>Ripetere con più fiale, assicurandosi di standardizzare il numero di mosche in ogni flaconcino. Nota: Il numero totale di adulti trasferiti tramite trasferimento singolo o anestesia dipenderà la dimensione delle fiale utilizzate per evitare il sovraffollamento.</li>
		<li>Incubare gli adulti in condizioni ambientali standard (cioè un'incubatrice) e consentono agli adulti di accoppiarsi e deporre le uova nel mezzo per 24 – 96 h.</li>
		<li>Dopo 24 – 96 h, scartare gli adulti in un obitorio (un pallone riempito con olio minerale e tappate con un imbuto attillati) lasciando dietro di sé fecondato uova (che diventano in seguito i soggetti dell'esperimento) di maturare per il test. Posizionare le fiale nell'incubatrice per consentire le uova a sviluppare.</li>
		<li>Monitorare le fiale per larve instar vagando alla ricerca di larve che stanno emergendo dal mezzo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. raccogliere soggetti sperimentali nelle varie fasi dello sviluppo
Nota: I soggetti sperimentali possono essere raccolti in qualsiasi fase dello sviluppo, nel cieche codificate provette coniche da 15 mL e testato per accumulo. Metodi per testare l'accumulo di contaminanti dipenderà il contaminante in fase di studio. Ad esempio, accumulo di PbAc possa essere testato utilizzando la spettrometria di massa di Inductively-Coupled al Plasma (ICP-MS)42. Inoltre, i soggetti sperimentali possono essere raccolti in qualsiasi fase inerente allo sviluppo per essere testati per una varietà di effetti fenotipici di contaminanti. La figura 2 illustra il ciclo di vita di Drosophila 43. La figura 3 illustra il protocollo sperimentale per l'esposizione e le varie fasi di sviluppo per la raccolta.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57450/57450fig2.jpg"> Figura 2 : Panoramica sui concettuale di ciclo di vita di d. melanogaster (il sistema più comunemente usato di modello drosofila ). Le fasi del ciclo di vita di Drosophila sono: 1) uovo, larva 2) primo-instar, 3) seconda-instar larva, 4) terza-instar larva, 5) vagando terza-instar larva, pupa 6) occhialino, pupa 7) l'effetto occhi rossi, 8) appena obtecta adulto e adulto 9) maturo. <a href="/files/ftp_upload/57450/57450fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57450/57450fig3.jpg"> Figura 3 : Panoramica concettuale dei metodi per esporre oralmente Drosophila a medie contaminate parentale (F0) sia le generazioni successive (F1 e successivi). (A) metodi per esposizione orale durante lo sviluppo della generazione esposta. (B) metodi per testare il trasferimento di contaminanti alla prole (F.1 per la generazione desiderata). Questa figura è stata modificata da Peterson et al. 24 <a href="/files/ftp_upload/57450/57450fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol><li>
Raccogliere larve instar terzo errante
	<ol>
<li>Avviare il monitoraggio fiale quando luci accendono nell'incubatrice, come le larve si emergono dal mezzo e spostare verso l'alto sul lato del flacone all'interno di un h dopo le luci si accendono nell'incubatrice. All'interno di questo h, rimuovere le larve di terza vagando instar dai lati del flaconcino con cura utilizzando un bastone di legno o delle pinzette. Nota: Il numero di larve disponibile per raccolta dipenderà il numero di uova deposte in "2.3.4".</li>
		<li>Per rimuovere il mezzo in eccesso dalle larve, posto le larve in un piccolo becher con dH2O. Pour la dH2O fuori il becher e posto le larve su un tergicristallo delicato compito. Utilizzando un pulitore delicato compito, rimuovere delicatamente l'eccesso di dH2O dalle larve.</li>
		<li>Mantenere popolazioni sperimentali in un'incubatrice di controllo ambientale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Raccogliere gli adulti recentemente-obtecta
	<ol>
<li>Fiale di monitor per eclosion osservando la colorazione delle pupe lungo i lati delle fiale. Nota: Pupe scurirà durante lo sviluppo. Tempo inerente allo sviluppo, in particolare pre-eclosion, dipende dalla specie testate.</li>
		<li>Quando i primi adulti iniziano a eclose, dump e scartare questi adulti in una camera mortuaria contenente olio minerale.</li>
		<li>Quando le luci si accendono nell'incubatrice la mattina seguente, dump e scartare qualsiasi adulti di età sconosciuta (o verginità) che possono avere obtecta durante la notte o durante le luci morningbefore su.</li>
		<li>Circa 4 ore più tardi, anestetizzare qualsiasi adulti che è emerso come nuova-obtecta adulti con una pistola di CO2 nei flaconcini. Adulti posto su un piatto di2 CO sotto un microscopio di dissezione. Adulti sesso cercando sesso pettini sulle zampe anteriori dei maschi e ovipositors nelle femmine. Nota: D. melanogaster devono essere raccolte entro 6 h di sfarfallamento per evitare accoppiamento ma altre specie può avere tempi più lunghi dello sviluppo (e di conseguenza, non è necessario essere raccolte entro questo lasso di tempo).</li>
		<li>Separare gli adulti sulla CO2 piastra utilizzando un bastone di legno. Trasferire delicatamente adulti in gruppi di sesso-specifici utilizzando un bastone di legno per la storia pre-esistente corrispondente media.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Raccogliere gli adulti maturi Eclosion post-della
	<ol>
<li>Consentire a rimanere sull'esposizione media corrispondente pre-eclosion dalla fase di uovo al post-eclosion età desiderata in un'incubatrice di controllo ambientale.</li>
		<li>Trasferire singolarmente gli adulti per il mezzo di controllo per 24 h prima del test per consentire gli adulti per lo sposo di eccesso di terreno contaminato i loro corpi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. posteriore soggetti sperimentali per testare gli effetti di Multigenerational o esposizione transgenerazionale.
<ol><li>Per il posteriore la generazione parentale (aka il P0 o F0 generazioni), transfer adulti da stock popolazioni di controllo e il supporto sperimentale secondo la procedura descritta in "2.1" a "2.3" e "3.1" a "3.3".</li>
	<li>Quando gli adulti sono riproduttivo maturi (vedere Pitnick et al. 41), singolarmente un flaconcino di trasferimento (come indicato in 2.3.1) dei maschi ad un fresco flacone di controllo o medio sperimentale. Trasferire singolarmente un flaconcino di femmine al fresco flacone che ora contiene i maschi. Consentono agli adulti di mate e deporre le uova nel mezzo per 24-96 h. Dump e scartare gli adulti in un obitorio contenenti olio minerale e ri-Incubare fiale per consentire la prole a sviluppare.</li>
	<li>Ripetere i punti 4.1 e 4.2 a seconda il numero desiderato di generazioni.</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Drosophila melanogaster è stato stabilito come un potente modello per una gamma di processi biologici a causa la conservazione ricca di geni e percorsi tra d. melanogaster e gli esseri umani13,14. Per le stesse ragioni che è un potente modello di scienza medica, Drosophila è emerso come un sistema di modello adatto per studiare l'impatto dell'inquinamento di origine antropica su una gamma di endpoint tossicologici. Diversi laboratori...

Ogni anno, circa 1.000 nuovi prodotti chimici vengono introdotti dalla industria chimica1,2; Tuttavia, l'impatto ambientale di solo una piccola percentuale di questi prodotti chimici è testato prima della distribuzione2,3. Anche se catastrofi su larga scala sono rare, esposizione subletale e cronica per una grande varietà di sostanze inquinanti sono diffuse in entrambi esseri umani e animali selvatici4,5. Al centro storico di ecotossicologia e tossicologia ambientale era quello di testare la letalità, singola esposizione chimica, l'esposizione acuta e gli effetti fisiologici dell'esposizione, come un mezzo per misurare l'impatto degli inquinanti sulla sopravvivenza6, 7 , 8 , 9 , 10. anche se c'è uno spostamento verso approcci etici e non invasiva alla sperimentazione animale, approcci attuali stanno limitando a causa del ruolo che lo sviluppo, proprietà emergenti e fattori esterni (ad esempio livello di popolazione e interazioni a livello di ecosistema) giocano nella mediazione ecologicamente importante endpoint8. Di conseguenza, c'è una necessità per i metodi che includono un approccio più olistico senza sacrificare la fauna selvatica e/o vertebrati in laboratorio.
Sistemi di modello invertebrati marini, come Drosophila melanogaster, sono un'alternativa interessante per affrontare la necessità di un approccio più olistico per test di tossicità. D. melanogaster, è stato originariamente sviluppato come un sistema di modello invertebrati marini per la ricerca genetica umani circa un secolo fa11. D. melanogaster prominente è ora utilizzato come alternativa modello vertebrati per diversi motivi: 1) la conservazione di geni e percorsi tra d. melanogaster e gli esseri umani; 2) tempo di generazione breve rispetto ai modelli vertebrati; 3) economico costo di manutenzione; 4) alleviare nella generazione di campioni di grandi dimensioni; e 5) pletora di fenotipica ed ecologicamente-rilevanti endpoint disponibili per il test11,12,13,14,15,16,17 .
Diversi laboratori11,15,16,17,18,19,20,21,22, 23 , 24 , 25 ora stanno usando d. melanogaster come alternativa modello vertebrati per test di tossicità per comprendere gli effetti dell'inquinamento sugli esseri umani. Specie selvatiche locali di Drosophila può essere utilizzato, anche, come modelli di tossicità per la fauna selvatica (e gli esseri umani) rispondere a ecologicamente-, relativamente al comportamento-ed evolutivamente pertinenti domande a più livelli biologici di organizzazione. Utilizzando specie del genere Drosophila come modello, diversi endpoint misurabili sono possibili11,15,16,18,19,20 ,21,22,23,24,25. Inoltre, utilizzando il modello di Drosophila , tossicologi possono: 1) eticamente collegare effetti a più livelli biologici dell'organizzazione; 2) incorporare il ruolo dei fattori emergenti e lo sviluppo; 3) studio endpoint ecologicamente importanti (oltre agli endpoint medicamente importanti); 4) verificare fattori di stress multipli contemporaneamente; 5) e prova a lungo termine multigenerazionale (ad es. evolutiva e transgenerazionale) implicazioni di fattori di stress. Pertanto, utilizzando la Drosophila come sistema modello consente una moltitudine di approcci, non limitato a studiare approcci meccanicistici con ceppi inbred di d. melanogaster nel laboratorio.
In questa carta, presentiamo i metodi di allevamento e raccolta della drosofila per rispondere a varie domande tossicologiche. Più specificamente, descriviamo la metodologia per 1) allevamento Drosophila in mezzo cucita con uno o più inquinanti; 2) raccogliendo Drosophila durante lo sviluppo (ad es. errante terza-instar larve, pupal casi, appena obtecta adulti e adulti maturi); e 3) l'allevamento della drosofila in medio contaminato e prova intergenerazionale e trasmissione transgenerazionale, come pure le implicazioni evolutive esposizione tossico a lungo termine. Utilizzando questo protocollo, il precedente autori18,19,20,21,22,23,24,25 sono segnalati diversi effetti fisiologici, genetici e comportamentali di sviluppo (Pb2 +) esposizione al piombo. Questo protocollo consente tossicologi di utilizzare un approccio più olistico e tossicologico, che è essenziale per comprendere come gli agenti inquinanti sono fattori di rischio per gli esseri umani e animali selvatici in un ambiente sempre più inquinato.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Carolina Biological Instant Drosophila Medium Formula 4-24</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>173204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila vials, Narrow (PS), Polystyrene, Superbulk, 1000 vials/unit</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>32-116SB</td>
			<td>Used to store flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flugs Closures for vials and bottles, Narrow plastic vials</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>49-102</td>
			<td>Used to store flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard trays, trays only, narrow</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>32-124</td>
			<td>Used to organize populations of flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard trays, dividers only, narrow</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>32-126</td>
			<td>Used to organize populations of flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Nalgene Square Wide-Mouth HDPE Bottles with Closure</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>03-312D</td>
			<td>Useful for storage of contaminants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Nalgene Color-Coded LDPE Wash Bottles</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>03-409-17C</td>
			<td>Useful for storage of contaminants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#160;Repeater M4 Manual Handheld Pipette Dispenser</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>14-287-150</td>
			<td>Used to prepare medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitips Advanced Pipetter Tips - Standard, Eppendorf Quality Tips</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>13-683-708</td>
			<td>Used to prepare medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flypad, Standard Size (8.1 X 11.6cm)</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>59-114</td>
			<td>Used to anesthetize flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flystuff foot valve</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>59-121</td>
			<td>Used to anesthetize flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, green (1 continguous foot/unit)</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>59-124G</td>
			<td>Used to anesthetize flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil, Light, White, High Purity Grade, 500 mL HDPE Bottle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-130</td>
			<td>Used to make a morgue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Erlenmeyer Flask Set - 3 Sizes - 50, 150 and 250ml, Karter Scientific 214U2</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Used to make a morgue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BGSET5 Glass Beaker Set Of 5</td>
			<td>Walmart</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inbred or wildtype line of Drosophila</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center at Indiana University</td>
			<td></td>
			<td>https://bdsc.indiana.edu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild popultions of Drosophila</td>
			<td>UC San Diego Drosophila Stock Center</td>
			<td></td>
			<td>https://stockcenter.ucsd.edu/info/welcome.php</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental protocol for using drosophila as an invertebrate model system for toxicity testing in the laboratory

Proprietà emergenti e fattori esterni (interazioni livello di popolazione e a livello di ecosistema, in particolare) svolgono i ruoli importanti nel mediare gli endpoint ecologicamente importanti, anche se raramente sono considerati negli studi tossicologici. D. melanogaster sta emergendo come un modello di tossicologia per gli effetti comportamentali, neurologici e genetici di sostanze tossiche, per citarne alcuni. Ancora più importante, può essere utilizzato specie del genere Drosophila come sistema modello per un approccio integrativo framework incorporare le proprietà emergenti e rispondere a domande ecologicamente rilevanti nella ricerca di tossicologia. Lo scopo di questa carta è quello di fornire un protocollo per l'esposizione di specie del genere Drosophila agli inquinanti da utilizzarsi come sistema modello per una gamma di uscite fenotipiche e domande ecologicamente rilevanti. Più specificamente, questo protocollo può essere usato per 1) collegare più livelli biologici di organizzazione e comprendere l'impatto delle sostanze tossiche su entrambi fitness a livello individuale e della popolazione; 2) verificare l'impatto delle sostanze tossiche nelle diverse fasi di esposizione inerente allo sviluppo; 3) prova implicazioni multigenerazionale ed evolutivi di inquinanti; e 4) test di contaminanti e fattori di stress multipli contemporaneamente.

Di esporre oralmente Drosophila a un contaminant(s) durante lo sviluppo, possono essere testate varie domande tossicologiche esponendo Drosophila a diversi livelli di organizzazione biologica. Questa sezione presenta risultati rappresentativi ottenuti usando questo protocollo in articoli precedentemente pubblicati23,24. In particolare, questo protocollo è stato utilizzato in precedenza per valutare l'accumulo, e...

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Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

In questo articolo, forniamo un protocollo dettagliato per l'esposizione di specie del genere Drosophila agli inquinanti con l'obiettivo di studiare l'impatto dell'esposizione su una gamma di uscite fenotipiche alle varie fasi di sviluppo e per più di una generazione.

Protocollo sperimentale per l'utilizzo di Drosophila come sistema modello invertebrati marini per test di tossicità in laboratorio

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

experimental-protocol-for-using-drosophila-as-an-invertebrate-model

Research

JoVE Journal

Biology

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

12.6K Views.  Colorado State University-Pueblo. In questo articolo, forniamo un protocollo dettagliato per l'esposizione di specie del genere Drosophila agli inquinanti con l'obiettivo di studiare l'impatto dell'esposizione su una gamma di uscite fenotipiche alle varie fasi di sviluppo e per più di una generazione.

Video: Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Testing Nicotine Tolerance in Aphids Using an Artificial Diet Experiment

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well know to have insecticidal properties. One response of tobacco plants to herbivory, or being gnawed upon by insects, is to increase the production of this neurotoxic alkaloid. Here, we will demonstrate how to set up an experiment to address this question of whether a tobacco-adapted strain of the green peach aphid, Myzus persicae, can tolerate higher levels of nicotine than the a strain of this insect that does not infest tobacco in the field.

In this video and assay is demonstrated that tests the tolerance of nicotine to two types of aphids one that infests tobacco plants in the field and one that does not.

Test di tolleranza nicotina in Afidi Utilizzando un esperimento artificiale dieta

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well ...

Ricerca

Biologia

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

La preparazione di Drosophila Gli embrioni per Live-Imaging Utilizzando il protocollo goccia

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

A lungo termine del test di tossicità letale con il crostaceo Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

Un protocollo per l'utilizzo di Gene imposta analisi di arricchimento per identificare il modello animale adeguato per la ricerca traslazionale

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

Protocollo di laboratorio per analisi genetiche del contenuto dell'intestino del rDNA acquatica macroinvertebrati Using Group-specific Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Istituzione di un pH extracellulare acido sistema cultura

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish (Nothobranchius furzeri)

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of reference fish model systems, such as zebrafish and medaka. In recent years, an emerging fish &#8211; the turquoise killifish (Nothobranchius furzeri) &#8211; has been adopted by a growing number of research groups in the fields of biology of aging and ecology. With a captive life span of 4 - 8 months, this species is the shortest-lived vertebrate raised in captivity and allows the scientific community to test &#8211; in a short time &#8211; experimental interventions that can lead to alterations of the aging rate and life expectancy. Given the unique biology of this species, characterized by embryonic diapause, explosive sexual maturation, marked morphological and behavioral sexual dimorphism - and their relatively short adult life span -&#160;ad hoc husbandry practices are in urgent demand. This protocol reports a set of key husbandry measures that allow optimal turquoise killifish laboratory care, enabling the scientific community to adopt this species as a powerful laboratory animal model.

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

Laboratory housing of turquoise killifish can be scaled up&#160;to house and efficiently raise thousands of individual fish in a centralized water filtration system, employing the same infrastructure used for standard zebrafish facilities. Here we detail a list of standardized procedures that allow efficient killifish maintenance.

Un protocollo per laboratorio Housing di turchese Killifish (Nothobranchius furzeri)

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such as Zika, dengue and malaria. Assays for rapid, high-throughput analyses of unformulated novel chemistries against mosquito larvae and adults are presented. We describe protocols for single point-dose and dose response assays to evaluate the toxicity of small molecule chemistries to the Aedes aegypti vector of Zika, dengue and yellow fever,&#160;the malaria vector, Anopheles gambiae and the northern house mosquito, Culex quinquefasciatus, on contact and via ingestion. As an example, we evaluated the toxicity of amitriptyline, a small molecule antagonist of G protein-coupled receptors, via larval, adult topical and adult blood-feeding assay. The protocols provide a starting point to investigate insecticide potential. Results are discussed in the context of additional experiments to explore product applications and mechanisms for delivery.

Protocols are described for assessing the toxicity of chemistries to immature and adult mosquitoes for development as new classes of larvicides, adulticides and endectocides. The protocols enable high-throughput testing of multiple chemistries at single-point dose and subsequent evaluation via dose response assay to determine toxicity on contact or via ingestion.

Protocolli per testare la tossicità di romanzo chimiche insetticide per le zanzare

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing

For toxicity testing of airborne particles, air-liquid interface (ALI) exposure systems have been developed for in vitro tests in order to mimic realistic exposure conditions. This puts specific demands on the cell culture models. Many cell types are negatively affected by exposure to air (e.g., drying out) and only remain viable for a few days. This limits the exposure conditions that can be used in these models: usually relatively high concentrations are applied as a cloud (i.e., droplets containing particles, which settle down rapidly) within a short period of time. Such experimental conditions do not reflect realistic long-term exposure to low concentrations of particles. To overcome these limitations the use of a human bronchial epithelial cell line, Calu-3 was investigated. These cells can be cultured at ALI conditions for several weeks while retaining a healthy morphology and a stable monolayer with tight junctions. In addition, this bronchial model is suitable for testing the effects of repeated exposures to low, realistic concentrations of airborne particles using an ALI exposure system. This system uses a continuous airflow in contrast to other ALI exposure systems that use a single nebulization producing a cloud. Therefore, the continuous flow system is suitable for repeated and prolonged exposure to airborne particles while continuously monitoring the particle characteristics, exposure concentration, and delivered dose. Taken together, this bronchial model, in combination with the continuous flow exposure system, is able to mimic realistic, repeated inhalation exposure conditions that can be used for toxicity testing.

Described is the cell culture and exposure method of an in vitro bronchial model for realistic, repeated inhalation exposure to particles for toxicity testing.

Un modello epiteliale bronchiale interfaccia aria-liquido per un'esposizione realistica e ripetuta all'inalazione alle particelle trasportate dall'aria per i test di tossicità

For toxicity testing of airborne particles, air-liquid interface (ALI) exposure systems have been developed for in vitro tests in order to mimic realistic ...