Lo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (81960226,81760223); la Fondazione di Scienze Naturali della Provincia dello Yunnan (202001AS070045,202301AY070001-011)

Il protocollo sperimentale è stato approvato dall'Animal Ethics and Use Committee della Kunming Medical University (kmmu20220945). Per il presente studio sono stati utilizzati ratti Sprague-Dawley (SD) di entrambi i sessi, 300-350 g.
1. Induzione del modello SAH
<ol><li>Anestetizzare i ratti usando il 2% di isoflurano e il 100% di ossigeno. Mantenere l'anestesia somministrando un'anestesia inalatoria continua con isoflurano (1%-3%). Fissare la testa del ratto con un apparecchio stereotassico (vedi Tabella dei materiali).</li>
	<li>Creare il modello SAH attenendosi alla procedura riportata di seguito.<ol><li>Inserire un ago per microiniezione nella cisterna soprasellare. Quindi, iniettare sangue autologo dall'arteria caudale del ratto (senza anticoagulante) nella cisterna soprasellare utilizzando una pompa a siringa (vedere Tabella dei materiali).</li>
		<li>Impiantare un ago per microiniezione nel ventricolo cerebrale laterale destro utilizzando le coordinate menzionate: bregma, −0,8 mm; laterale, 1,4 mm; profondità, 4 mm9. Per i gruppi SAH, iniettare 0,2 mL di sangue dell'arteria caudale di ratto. Per i gruppi fittizi, somministrare lo stesso volume di soluzione fisiologica isotonica (Figura 1A).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparazione e stabilizzazione della fetta di cervello
<ol><li>Anestetizzare in profondità i ratti usando l'inalazione di isoflurano al 2%. Dopo la decapitazione, estrarre l'intero cervello e immergerlo in liquido cerebrospinale artificiale ghiacciato (ACSF). NOTA: Utilizzare soluzioni ACSF appena preparate con la seguente composizione: 134 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 29 mM NaHCO3, 1,1 mM NaH 2 PO4, 1,5 mM MgSO4, 2,5 mM CaCl2e 10,11 mM D-Glucosio (vedere la tabella dei materiali). Mantenere un pH compreso tra 7,3 e 7,4.</li>
	<li>Utilizzare un vibratomo (vedere la tabella dei materiali) per preparare fette di cervello acuto con uno spessore di 200 μm dai ratti SD in ACSF ghiacciato aerato con il 5% di CO 2 e il 95% di O 2 (Figura 2).</li>
	<li>Posizionare le fette di cervello acuto spesse 200 μm in una camera di conservazione su una rete di nylon immersa in ACSF. Equilibrare la soluzione ACSF con il 95% di O 2 e il 5% di CO2 mantenendo un intervallo di temperatura di 35-37 °C. Lasciare che le fette di cervello si stabilizzino per 2 ore, dando loro il tempo di adattarsi (Figura 3).</li>
</ol>3. Marcatura dei periciti in fette di cervello acuto con TO-PRO-3
NOTA: I periciti provenienti da fette di cervello acuto sono stati marcati in fluorescenza utilizzando il tracciante TO-PRO-310.
<ol><li>Aggiungere il colorante fluorescente TO-PRO-3 all'ACSF, ottenendo una concentrazione finale di 1 μM. Incubare le fette di cervello acuto a temperatura ambiente in un ambiente buio con l'ACSF contenente TO-PRO-3 per 20 minuti. NOTA: Ricordarsi di indossare guanti in lattice durante la manipolazione di TO-PRO-3 per protezione.</li>
	<li>Trasferire il filtro a rete di nylon, che trasporta le fette di cervello, dalla camera di carico a una camera di risciacquo a piastre a 6 pozzetti (vedi Tabella dei materiali). Lasciare che le fette di cervello rimangano nella camera di risciacquo per 10 minuti (Figura 4D). NOTA: Questa fase di risciacquo termina il processo di colorazione, riduce l'etichettatura di fondo e previene le macchie non specifiche.</li>
	<li>Risciacquare i preparati per un totale di 15 minuti utilizzando una soluzione di ACSF bilanciata con una miscela di 5% CO 2 e 95% O2 . Questa fase di risciacquo arresta l'assorbimento del colorante e riduce al minimo l'etichettatura di fondo (Figura 4C).</li>
</ol>4. Colorazione dei periciti non vitali della microcircolazione cerebrale in fette di cervello acuto
<ol><li>Incubare fette di cervello precaricate con TO-PRO-3 a 37 °C con isolectina B4 coniugata ad Alexa Fluor 488 (FITC-ISOB4; 5 μg/mL, vedere la tabella dei materiali) per 30 minuti in un ambiente buio. Dopo l'incubazione, sciacquare le fette di cervello per 15 minuti in ACSF (Figura 4E).</li>
	<li>Incubare le fette di cervello in ACSF gassate con il 5% di CO 2 e il 95% di O2 come di consueto. Aggiungere ioduro di propidio (PI) a una concentrazione di 37 μM a entrambe le soluzioni a 37 °C. Questo etichetterà i periciti cerebrali non vitali. Incubare i preparati in questa soluzione di ACSF per 60 minuti al buio (Figura 4F).</li>
	<li>Successivamente, risciacquare i preparati per 15 minuti con soluzioni ACSF per arrestare l'assorbimento del colorante e ridurre al minimo l'etichettatura di fondo.</li>
</ol>5. Imaging di periciti cerebrali vitali e non vitali in fette cerebrali acute
<ol><li>Trasferire delicatamente le fette di cervello in piastre confocali con fondo di vetro (vedere Tabella dei materiali) utilizzando pipette Pasteur in plastica. Riempire le piastre con una soluzione di ACSF precedentemente bilanciata con il 5% di CO 2 e il 95% di O2 . Usa una rete di ferro per fissare le fette di cervello di ratto in posizione.</li>
	<li>Trasferire le piastre confocali con fondo di vetro sul tavolino di un microscopio confocale. Posizionare la fetta di cervello acuto sul fondo del piatto e perfonderla9 con una soluzione di ACSF bilanciata con una miscela di 95% O 2 e 5% CO2 durante l'imaging al microscopio confocale (Figura 5A e Figura 5Ab').</li>
	<li>Visualizza le cellule di parete della microvascolarizzazione corticale cerebrale utilizzando un obiettivo 40x. Acquisisci pile di immagini utilizzando un software compatibile (vedi Tabella dei materiali). Utilizzare filtri appropriati per IB4 (eccitazione/emissione 460 nm/520 nm), PI (eccitazione/emissione 545 nm/595 nm) e TO-PRO-3 (eccitazione/emissione 606 nm/666 nm) (Figura 5D). NOTA: Acquisire immagini con i seguenti dettagli: obiettivo DIC N1 da 40×, 3 × 12 bit: 512 × 512 pixel (0,22 × 0,22 mm), calibrazione: 0,42 μm/px.</li>
	<li>Identificare la microvascolarizzazione cerebrale e i periciti in base alla loro rete e morfologia. Individua una regione specifica contenente una rete di microvascolarizzazione cerebrale su ogni fetta di cervello e acquisisci immagini.</li>
	<li>Annotare attentamente la posizione dell'imaging per garantire l'uniformità nelle acquisizioni successive (Figura 5B,C). Per ulteriori elaborazioni e analisi, utilizzare un software di analisi delle immagini (ImageJ) e un software di fotoritocco (vedere la tabella dei materiali).</li>
</ol>

Visualizzazione della contrattilità del pericito cerebrale dopo l'emorragia subaracnoidea

<ol>
	<li>Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+microvascular+pericytes+in+health+and+disease.">Brain microvascular pericytes in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 122 (1), 1-9 (2011).</li><li>Dore-Duffy, P., Cleary, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+properties+of+pericytes.">Morphology and properties of pericytes.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 686, 49-68 (2011).</li><li>Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+control+of+CNS+capillary+diameter+by+pericytes.">Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes.</a> Nature. 443 (7112), 700-704 (2006).</li><li>Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+a+pericyte.">What is a pericyte.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 451-455 (2016).</li><li>Yemisci, M., Gursoy-Ozdemir, Y., Vural, A., Can, A., Topalkara, K., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericyte+contraction+induced+by+oxidative-nitrative+stress+impairs+capillary+reflow+despite+successful+opening+of+an+occluded+cerebral+artery.">Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery.</a> Nature Medicine. 15 (9), 1031-1037 (2009).</li><li>Korte, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noradrenaline+released+from+locus+coeruleus+axons+contracts+cerebral+capillary+pericytes+via+&#945;2+adrenergic+receptors.">Noradrenaline released from locus coeruleus axons contracts cerebral capillary pericytes via &#945;2 adrenergic receptors.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2023).</li><li>Hirunpattarasilp, C., Barkaway, A., Davis, H., Pfeiffer, T., Sethi, H., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperoxia+evokes+pericyte-mediated+capillary+constriction.">Hyperoxia evokes pericyte-mediated capillary constriction.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 42 (11), 2032-2047 (2022).</li><li>Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+to+study+pericyte+contractility+and+responses+to+ischaemia+in+vitro+using+electrical+impedance.">Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).</li><li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+TRPM4+Activity+in+cerebral+artery+myocytes+contributes+to+cerebral+blood+flow+reduction+after+subarachnoid+hemorrhage+in+rats.">Increased TRPM4 Activity in cerebral artery myocytes contributes to cerebral blood flow reduction after subarachnoid hemorrhage in rats.</a> Neurotherapeutics: The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 16 (3), 901-911 (2019).</li><li>Mai-Morente, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericyte+mapping+in+cerebral+slices+with+the+far-red+fluorophore+TO-PRO-3.">Pericyte mapping in cerebral slices with the far-red fluorophore TO-PRO-3.</a> Bio-protocol. 11 (22), e4222 (2021).</li><li>Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nuclear+fluorescent+dye+identifies+pericytes+at+the+neurovascular+unit.">A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit.</a> Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationale+for+the+real-time+and+dynamic+cell+death+assays+using+propidium+iodide.">Rationale for the real-time and dynamic cell death assays using propidium iodide.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (4), 399-405 (2010).</li><li>Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TO-PRO-3+iodide:+A+novel+HeNe+laser-excitable+DNA+stain+as+an+alternative+for+propidium+iodide+in+multiparameter+flow+cytometry.">TO-PRO-3 iodide: A novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry.</a> Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).</li><li>Lacar, B., Herman, P., Platel, J. C., Kubera, C., Hyder, F., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+progenitor+cells+regulate+capillary+blood+flow+in+the+postnatal+subventricular+zone.">Neural progenitor cells regulate capillary blood flow in the postnatal subventricular zone.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (46), 16435-16448 (2012).</li><li>Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nuclear+fluorescent+dye+identifies+pericytes+at+the+neurovascular+unit.">A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit.</a> Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).</li><li>Hezel, M., Ebrahimi, F., Koch, M., Dehghani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propidium+iodide+staining:+a+new+application+in+fluorescence+microscopy+for+analysis+of+cytoarchitecture+in+adult+and+developing+rodent+brain.">Propidium iodide staining: a new application in fluorescence microscopy for analysis of cytoarchitecture in adult and developing rodent brain.</a> Micron (Oxford, England). 43 (10), 1031-1038 (2012).</li><li>Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+perivascular+astroglial+sheath+provides+a+complete+covering+of+the+brain+microvessels:+An+electron+microscopic+3D+reconstruction.">The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: An electron microscopic 3D reconstruction.</a> Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Sono state sviluppate tecniche di imaging confocale ad alta risoluzione per la visualizzazione dei periciti cerebrali vitali, dei periciti cerebrali non vitali e della microvascolarizzazione in fette di cervello. Nelle fette acute di cervello di ratto, il processo comporta la marcatura iniziale dei periciti con TO-PRO-311, seguita da cellule endoteliali microvascolari con IB412; successivamente, l'identificazione dei periciti deceduti viene condotta utilizzando PI. Questo p...

I periciti cerebrali, che si distinguono per le loro sottili protuberanze e corpi cellulari sporgenti, circondano il microcircolo 1,2. Mentre l'aumento del flusso sanguigno cerebrale è prevalentemente guidato dalla dilatazione capillare, le arterie più piccole mostrano tassi di dilatazione più lenti3. La contrattilità dei periciti esercita un'influenza sul diametro dei capillari e sulla morfologia dei periciti, influenzando la dinamica vascolare4. La contrazione dei periciti cerebrali porta alla costrizione capillare e, in scenari patologici, una contrazione eccessiva può ostacolare il flusso eritrocitario5. Vari fattori, tra cui la noradrenalina rilasciata dal locus coeruleus, possono indurre la contrazione dei periciti cerebrali all'interno dei capillari6. Con un ruolo regolatore nel flusso sanguigno cerebrale, i periciti mostrano la sintesi di 20-HETE, fungendo da sensore di ossigeno durante l'iperossia7. La contrazione dei periciti cerebrali innescata dallo stress ossidativo-nitrativo influisce negativamente sui capillari5. Nonostante le indagini sia in vivo che ex vivo sulla contrazione dei periciti cerebrali8, persistono conoscenze limitate per quanto riguarda l'imaging dei periciti cerebrali vitali e non vitali all'interno di fette di cervello.
Fondamentalmente, l'imaging post-fissazione tissutale dei periciti cerebrali compromette la loro vitalità e la successiva valutazione della contrattilità. Inoltre, in scenari come i disturbi neurologici (ad esempio, l'emorragia subaracnoidea - SAH), la marcatura transgenica dei periciti cerebrali non riesce a distinguere tra periciti vitali e non vitali, come confermato dal nostro studio preliminare sulla morte dei periciti cerebrali indotta da SAH9. 
Per superare queste sfide, abbiamo impiegato TO-PRO-3 per marcare i periciti vivi, mentre quelli deceduti sono stati colorati con ioduro di propidio (PI). Abbiamo utilizzato tecnologie di imaging confocale ad alta risoluzione per visualizzare i periciti cerebrali vitali e non vitali nelle fette di cervello, preservando l'attività della fetta durante l'imaging. Questo articolo ha lo scopo di presentare un metodo riproducibile per l'imaging di periciti cerebrali vitali e non vitali in fette di cervello, fungendo da prezioso strumento per sondare l'impatto dei periciti cerebrali sulla microcircolazione cerebrale dopo SAH.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>ABC biochemistry</td>
			<td>ABC703006</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Adobe Illustrator CS6 16.0.0</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>MIAOJIE</td>
			<td>225 mm x 273 mm</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal imaging software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS-Elements 4.10.00</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N-SIM/C2si</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas tank (5% CO2, 95% O2)</td>
			<td>PENGYIDA</td>
			<td>40L</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Confocal Dishes</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FCFC020-10pcs</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue</td>
			<td>EVOBOND</td>
			<td>KH-502</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice machine</td>
			<td>XUEKE</td>
			<td>IMS-20</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>Image J</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhalation anesthesia system</td>
			<td>SCIENCE</td>
			<td>QAF700</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin B 4-FITC</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>L2895&#8211;2MG</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7447&#8211;40&#8211;7</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647&#8211;14&#8211;5</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10049&#8211;21&#8211;5</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>NEST Biotechnology</td>
			<td>318314</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Scientific Industries Inc</td>
			<td>Model 203</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium (Iodide)</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>HY-D0815/CS-7538</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic apparatus</td>
			<td>SCIENCE</td>
			<td>QA</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard PUMP</td>
			<td>PUMP 11 ELITE Nanomite</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic water bath</td>
			<td>OLABO</td>
			<td>HH-2</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging vital and non-vital brain pericytes in brain slices following subarachnoid hemorrhage

I periciti sono cellule murali cruciali situate all'interno della microcircolazione cerebrale, fondamentali per modulare attivamente il flusso sanguigno cerebrale attraverso aggiustamenti della contrattilità. Convenzionalmente, la loro contrattilità viene misurata osservando i cambiamenti morfologici e i cambiamenti del diametro capillare nelle vicinanze in circostanze specifiche. Tuttavia, la fissazione post-tissutale, la valutazione della vitalità e la conseguente contrattilità dei periciti cerebrali vengono compromessi. Allo stesso modo, l'etichettatura genetica dei periciti cerebrali non è in grado di distinguere tra periciti vitali e non vitali, in particolare in condizioni neurologiche come l'emorragia subaracnoidea (SAH), dove la nostra indagine preliminare convalida la morte dei periciti cerebrali. È stato messo a punto un protocollo affidabile per superare questi vincoli, consentendo l'etichettatura fluorescente simultanea di periciti cerebrali funzionali e non funzionali nelle sezioni cerebrali. Questo metodo di marcatura consente la visualizzazione al microscopio confocale ad alta risoluzione, marcando contemporaneamente la microvascolarizzazione della fetta di cervello. Questo protocollo innovativo offre un mezzo per valutare la contrattilità dei periciti cerebrali, il suo impatto sul diametro capillare e sulla struttura dei periciti. Lo studio della contrattilità dei periciti cerebrali all'interno del contesto SAH fornisce una comprensione approfondita dei suoi effetti sulla microcircolazione cerebrale.

Brain pericytes, distinguished by their slender protuberances and protruding cell bodies, encircle the microcirculation1,2. While cerebral blood flow augmentation is predominantly driven by capillary dilation, smaller arteries exhibit slower rates of dilation3. Pericyte contractility exerts influence over capillary diameter and pericyte morphology, impacting vascular dynamics4. Contraction of brain pericytes leads to capillary constriction, and in pathological scenarios, excessive contraction may impede erythrocyte flow5. Various factors, including norepinephrine released from the locus coeruleus, can induce brain pericyte contraction within capillaries6. With a regulatory role in cerebral blood flow, pericytes exhibit 20-HETE synthesis, serving as an oxygen sensor during hyperoxia7. Oxidative-nitrative stress-triggered contraction of brain pericytes detrimentally affects capillaries5. Despite both in vivo and ex vivo investigations into brain pericyte contraction8, limited knowledge persists regarding the imaging of viable and non-viable brain pericytes within brain slices.
Crucially, post-tissue fixation imaging of brain pericytes compromises their vitality and subsequent contractility assessment. Moreover, in scenarios such as neurological disorders (e.g., subarachnoid hemorrhage - SAH), transgenic labeling of brain pericytes fails to differentiate between viable and non-viable pericytes, as confirmed by our preliminary SAH-induced brain pericyte death study9. 
To surmount these challenges, we employed TO-PRO-3 to label live pericytes, while deceased ones were stained with propidium iodide (PI). We used high-resolution confocal imaging technologies to visualize viable and non-viable brain pericytes in brain slices while preserving slice activity during imaging. This article aims to present a reproducible method for imaging viable and non-viable brain pericytes in brain slices, serving as a valuable tool to probe the impact of brain pericytes on cerebral microcirculation post SAH.

Autore in primo piano: Imaging dei periciti post-emorragia subaracnoidea nei roditori 

Imaging di periciti cerebrali vitali e non vitali in fette di cervello dopo emorragia subaracnoidea

Our study showed a significant increase in pericytes deaths. So starting at a sick horse after SAH, it demonstrated a positive correlation between the number of low vital parasites and the time elapsed after SAH. Imaging vital and the non-vital brain parasites in brain slices following SAH and the parasite isolation techniques, have advanced the research in my field.Currently, it's quite difficult to fully distinguish between dead parasites and dead endothelial cells. Our study find contraction-dependent apoptosis in parasites after SAH. We have developed a very reliable protocol, which enables the fluorescent labeling, both functional and a non-functional brain parasite in brain sections, and the same time.

In condizioni fisiologiche normali, i periciti cerebrali generalmente non subiscono la morte cellulare. La figura 6 illustra questo fenomeno, con il giallo che indica la presenza di periciti cerebrali vitali; I periciti cerebrali non mostrano alcuna colorazione con PI, indicando la loro vitalità. Per indagare ulteriormente se i periciti rimangono attaccati alla microvascolarizzazione dopo la morte cellulare, sono stati impiegati metodi in un modello di ratto SAH e sono state condotte succes...

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L'indagine preliminare conferma che l'emorragia subaracnoidea (SAH) provoca la morte dei periciti cerebrali. La valutazione della contrattilità dei periciti post-SAH richiede la differenziazione tra periciti cerebrali vitali e non vitali. Pertanto, è stata sviluppata una procedura per etichettare i periciti cerebrali vitali e non vitali contemporaneamente nelle sezioni cerebrali, facilitando l'osservazione utilizzando un microscopio confocale ad alta risoluzione.

Pericytes are crucial mural cells situated within cerebral microcirculation, pivotal in actively modulating cerebral blood flow via contractility ...

Il nostro studio ha mostrato un aumento significativo dei decessi per periciti. Quindi, a partire da un cavallo malato dopo la SAH, ha dimostrato una correlazione positiva tra il numero di parassiti a bassa vitalità e il tempo trascorso dopo la SAH. L'imaging dei parassiti cerebrali vitali e non vitali in fette di cervello seguendo la SAH e le tecniche di isolamento dei parassiti, hanno fatto progredire la ricerca nel mio campo.Attualmente, è abbastanza difficile distinguere completamente tra parassiti morti e cellule endoteliali morte. Il nostro studio trova l'apoptosi dipendente dalla contrazione nei parassiti dopo SAH. Abbiamo sviluppato un protocollo molto affidabile, che consente la marcatura fluorescente, sia funzionale che non funzionale di un parassita cerebrale nelle sezioni cerebrali, e allo stesso tempo.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Vital and Non-vital Brain Pericytes in Brain Slices following Subarachnoid Hemorrhage

703 Views.  The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University. Il nostro studio ha mostrato un aumento significativo dei decessi per periciti. Quindi, a partire da un cavallo malato dopo la SAH, ha dimostrato una correlazione positiva tra il numero di parassiti a bassa vitalità e il tempo trascorso dopo la SAH. L'imaging dei parassiti cerebrali vitali e non vitali in fette di cervello seguendo la SAH e le tecniche di isolamento dei parassiti, hanno fatto progredire la ricerca nel mio campo.Attualmente, è abbastanza difficile distinguere completa...

Video: Autore in primo piano: Imaging dei periciti post-emorragia subaracnoidea nei roditori 

Pericytes are crucial mural cells situated within cerebral microcirculation, pivotal in actively modulating cerebral blood flow via contractility adjustments. Conventionally, their contractility is gauged by observing morphological shifts and nearby capillary diameter changes under specific circumstances. Yet, post-tissue fixation, evaluating vitality and ensuing pericyte contractility of imaged brain pericytes becomes compromised. Similarly, genetically labeling brain pericytes falls short in distinguishing between viable and non-viable pericytes, particularly in neurologic conditions like subarachnoid hemorrhage (SAH), where our preliminary investigation validates brain pericyte demise. A reliable protocol has been devised to surmount these constraints, enabling simultaneous fluorescent tagging of both functional and non-functional brain pericytes in brain sections. This labeling method allows high-resolution confocal microscope visualization, concurrently marking the brain slice microvasculature. This innovative protocol offers a means to appraise brain pericyte contractility, its impact on capillary diameter, and pericyte structure. Investigating brain pericyte contractility within the SAH context yields insightful comprehension of its effects on cerebral microcirculation.

The preliminary inquiry confirms that subarachnoid hemorrhage (SAH) causes brain pericyte demise. Evaluating pericyte contractility post-SAH requires differentiation between viable and non-viable brain pericytes. Hence, a procedure has been developed to label viable and non-viable brain pericytes concurrently in brain sections, facilitating observation using a high-resolution confocal microscope.

Ricerca

Neuroscienze

Induction of the Murine Subarachnoid Hemorrhage Model and Brain Slice Preparation for Fluorescent Imaging

To create the subarachnoid hemorrhage, or SAH model, insert a microinjection needle into an anesthetized rat's suprasellar cistern. With a syringe pump, inject autologous blood acquired from the rat's tail artery into the suprasellar cistern. Now implant another needle into the right lateral cerebral ventricle at the given coordinates.For the SAH models, inject 0.2 milliliters of rat tail artery blood. For the SHAM groups, inject the same volume of isotonic saline. After decapitation, extract the rat's entire brain and submerge them in ice cold artificial cerebral spinal fluid or ACSF.With a vibratome, prepare acute brain slices of 200 micrometers and ice cold equilibrated ACSF. Place the brain slices on a nylon mesh, immersed in equilibrated ACSF in a storage chamber at 35 to 37 degrees Celsius.

Induzione del modello murino di emorragia subaracnoidea e preparazione della fetta di cervello per l'imaging fluorescente

Labeling and Staining Rat Brain Pericytes for Fluorescent Imaging

To label the pericytes, add the fluorescent dye TO-PRO-3 to the artificial cerebral spinal fluid or ACSF. Now incubate the freshly sliced rat brain in the dye-laden ACSF for 20 minutes in a dark environment at room temperature. Next, transfer the nylon mesh strainer with the brain slices to a six-well plate rinsing chamber.Let the brain slices rest in the chamber for 10 minutes. To label the non-vital pericytes, incubate the TO-PRO-3 tagged brain slices in conjugated isolectin B4 at 37 degrees Celsius for 30 minutes in the dark. After incubation, rinse the brain slices in artificial cerebral spinal fluid for 15 minutes.Next, place the brain slices in ACSF gassed with 5%carbon dioxide and 95%oxygen. To this, add propidium iodide at a concentration of 37 micromolar at 37 degrees Celsius. To halt the dye uptake and minimize the background labeling, rinse the preparations for 15 minutes in ACSF.Under normal physiological conditions, brain pericytes do not experience cell death. Viable pericytes that were not stained with propidium iodide were detected. The SAH models should vital pericytes within microvasculature.Non-vital pericytes were also detected. Propidium iodide-labeled non-vital pericytes remained attached to the entire microvasculature.

Etichettatura e colorazione dei periciti cerebrali di ratto per l'imaging fluorescente

Confocal Imaging of Vital and Non-Vital Pericytes in Rat Acute Brain Slices

To begin, use a plastic Pasteur pipette to gently transfer the fluorescently stained brain slices to glass bottom confocal dishes. Fill these dishes with equilibrated ACSF. With an iron mesh, secure the rat brain slices in place.Next, place the glass bottom confocal dishes onto the stage of a confocal microscope. Position the acute brain slice at the bottom of the dish and perfuse with equilibrating ACSF during imaging. Using the 40X objective, view the wall cells of the cerebral cortical microvasculature.Next, use compatible software to capture image stacks. Identify cerebral microvasculature and pericytes based on their network and morphology, then locate a specific region containing a cerebral microvasculature network on each brain slice and capture images. Under normal physiological conditions, brain pericytes do not experience cell death.Viable pericytes that were not stained with propidium iodide were detected. The SAH models showed vital pericytes within microvasculature. Non-vital pericytes were also detected.Propidium iodide labeled non-vital pericytes"remained detached to the entire microvasculature.