Questo lavoro è stato sostenuto dalla "Société Française d'Anesthésie et de Réanimation" (Parigi, Francia), dalla "Fondation d'entreprises Genavie" (Nantes, Francia), dalla "Fédération française de cardiologie" (Francia), dalla "Agence nationale de la recherche" (20-ASTC-0032-01-hErOiSmE) (Parigi, Francia) e dalla "Direction Générale de l'Armement" (Parigi, Francia). Thomas Dupas è stato sostenuto da sovvenzioni della Direction Générale de l'Armement (DGA), Francia e della Région des Pays de la Loire durante il suo dottorato. Antoine Persello è stato sostenuto da sovvenzioni di InFlectis BioScience, Francia durante il suo dottorato. Ringraziamo l'"Agence Nationale de la Recherche" (Parigi, Francia), la "Direction Générale de l'Armement" (Parigi, Francia) e l'associazione "Sauve ton coeur" (Francia) per aver sostenuto questo lavoro. Ringraziamo la struttura centrale UTE IRS-UN (SFR Bonamy, Nantes Université, Nantes, Francia) e la struttura centrale IBISA Therassay (Nantes, Francia) per la loro assistenza e supporto tecnico.

Tutte le procedure sono state approvate ed eseguite in conformità con il comitato etico regionale (protocollo (#17858 e #32499, CEEA-Pays de la Loire, Francia) secondo la Direttiva 2010/63/UE dell'Unione Europea. La segnalazione è conforme alle attuali linee guida ARRIVE e alla Guida del National Institutes of Health (NIH) per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (NIH Pub. n. 85-23, rivista nel 2011).
1. Status etico e informazioni generali sui ratti
<ol><li>I ratti maschi di Wistar Han (Charles River, Saint-Germain-Nuelles, Francia) sono stati consegnati all'Unité Thérapeutique Expérimentale a 10 settimane di età. Alloggiare i ratti per almeno 1 settimana a temperatura standard (21-24 °C), umidità (40%-60%) e ciclo luce/buio di 12 ore con un periodo di luce a partire dalle 07:30.</li>
	<li>Fornire cibo e acqua ad libitum. Utilizzare ratti di 11-13 settimane del peso di 300-400 g per il protocollo.</li>
</ol>2. Fasi di allestimento e preparazione della sala
<ol><li>Accendere la stazione di anestesia, impostare il tappetino riscaldante a 37,5 °C e coprirlo con un telo non sterile.</li>
	<li>Sterilizzare gli strumenti chirurgici necessari per il protocollo: pinza atraumatica DeBakey (1), forbici o bisturi fini e affilati (1), pinze standard (2), portaaghi (1), forbici per micro dissezione Vannas (1), pinza (1).</li>
	<li>Preparare i cateteri per la vena giugulare e l'arteria femorale.<ol><li>Per il catetere della vena giugulare, montare un tubo in polietilene (PE) (PE50) su un ago da 23 G con la punta tagliata all'estremità.</li>
		<li>Per il catetere dell'arteria femorale, preparare quello descritto al punto 2.3.1 e collegare un tubo PE10 all'estremità del tubo PE50.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare il trasduttore di pressione e i cateteri per l'arteria femorale e la vena giugulare riempiendolo con una soluzione di Ringer lattata eparinizzata a 100 UI/mL. Posizionare una siringa da 2 ml contenente la soluzione di Ringer lattato eparinizzata a 100 UI/mL all'estremità dei cateteri e del trasduttore di pressione. Fare attenzione a non formare bolle, poiché causano difetti di segnale.</li>
	<li>Accendere il software associato al trasduttore di pressione e tararlo secondo le istruzioni del fornitore.</li>
</ol>3. Preparare il ratto per l'intervento chirurgico
<ol><li>Anestetizzare il ratto con una scatola a induzione (parametri: sevoflurano 8%, portata d'aria: 1 L/min). Dopo aver controllato la profondità dell'anestesia tramite il riflesso del pedale, mantenere l'anestesia al sevoflurano al 4%, con una portata d'aria di 0,6 L/min. L'uso di analgesici prima dell'intervento è stato evitato a causa degli effetti emodinamici di queste molecole. NOTA: Da questo passaggio, la profondità dell'anestesia viene valutata ogni 20 minuti tramite il riflesso del pedale.</li>
	<li>Pesare il ratto, posizionarlo in posizione di decubito dorsale su un tappetino riscaldante e depilarlo nelle regioni inguinali e del collo.</li>
	<li>Disinfettare le aree depilate con soluzioni alternate di iodio povidone al 10% e al 4% (3 volte ciascuna) utilizzando garze non sterili.</li>
	<li>Applicare una goccia di unguento oftalmico sugli occhi dell'animale per evitare che si secchi.</li>
	<li>Posizionare il ratto su un tappetino riscaldante sul tavolo chirurgico (decubito dorsale). Posizionare la sonda rettale lubrificata per controllare la temperatura del ratto. Mantenere l'anestesia al sevoflurano al 4%, con una portata d'aria di 0,6 L/min.</li>
	<li>Sostituire i guanti con quelli sterili, posizionare il telo sterile sul ratto e tagliarlo nelle regioni inguinali e del collo.</li>
</ol>4. Incannulamento della vena giugulare
<ol><li>Localizzare la regione giugulare nella regione inferiore destra del collo, sopra la clavicola, mediante pulsazione visibile. Utilizzando la pinza atraumatica DeBakey, afferra delicatamente la pelle, quindi pratica un'incisione precisa usando forbici sottili e affilate o un bisturi.</li>
	<li>Applicare una goccia di anestetico locale (lidocaina 2%) sull'area incisa. Taglia delicatamente il tessuto con una pinza standard.</li>
	<li>Individua la vena giugulare e liberala delicatamente dal suo compartimento muscolare con una pinza standard. Posizionare un filo di sutura di seta 4/0 e legare saldamente il lato distale (verso la testa). Utilizzare la sutura con i portaaghi per tendere la vena giugulare.</li>
	<li>Posizionare una sutura 4/0 sul lato prossimale (verso il cuore) e preparare un nodo da chirurgo senza stringerlo. Praticare una piccola incisione nella vena giugulare utilizzando le forbici da micro dissezione Vannas.</li>
	<li>Dopo aver afferrato con cura la parete venosa con una piccola pinza, inserire il catetere PE50 nella vena giugulare a mano o con una pinza standard. In questa fase, utilizzare una garza sterile per asciugare eventuali gocce di sangue, che potrebbero fuoriuscire dalla vena.</li>
	<li>Far avanzare leggermente il catetere (0,5 cm) e verificarne il corretto posizionamento in vena prelevando una piccola quantità di sangue e quindi reiniettandolo (il sangue nella cannula indica che si trova nella vena). Stringere il nodo precedentemente preparato per fissare il catetere.</li>
	<li>Lasciare il catetere in posizione, collegato a una siringa preriempita con soluzione di Ringer lattato, e coprire l'area incisa con una garza sterile inumidita.</li>
</ol>5. Incannulamento dell'arteria femorale
<ol><li>Usa la pinza atraumatica DeBakey per afferrare la pelle del triangolo di Scarpa della gamba sinistra e fai un'incisione con forbici fini e affilate o un bisturi. Applicare una goccia di anestetico locale (lidocaina 2%) sull'area incisa. Dilacerare delicatamente il tessuto con una pinza standard.</li>
	<li>Individua la triade femorale (arteria, vena e nervo). Passare una pinza sotto la triade e, utilizzando la seconda pinza standard, separare molto delicatamente l'arteria dal nervo e dalla vena femorale. NOTA: L'arteria è più piccola, rosa e pulsante. Questo è un passaggio fondamentale; La vena e l'arteria sono fragili e possono rompersi facilmente.</li>
	<li>Posizionare una sutura 4/0 e legare l'arteria femorale distalmente (lato gamba). Prendi la sutura con i portaaghi per mettere in tensione l'arteria femorale. Posizionare una sutura 4/0 sul lato prossimale (lato cuore) e preparare un nodo senza chiuderlo. Clamp l'arteria (posizionare il clamp a monte della sutura laterale prossimale).</li>
	<li>Incidere l'arteria femorale trasversalmente con le forbici da micro dissezione Vannas (un piccolo volume di sangue dovrebbe fluire dall'arteria). Utilizzando una pinza standard, afferrare delicatamente la parete dell'arteria e incannulare l'arteria femorale con il catetere (PE10 terminato), tenendolo con una pinza.</li>
	<li>Sbloccare delicatamente per verificare la presenza di perdite, quindi controllare il segnale di pressione (convalida che il catetere si trovi nell'arteria femorale) e verificare che il sangue non rifluisca nel catetere (segno di perdita dalle valvole/trasduttore di pressione).</li>
	<li>Se il segnale è buono (valori attesi: pressione arteriosa sistolica: 120 mmHg, pressione arteriosa diastolica: 80 mmHg) e non ci sono segni di perdite, far avanzare leggermente il catetere (0,5 cm) e stringere il nodo del chirurgo precedentemente preparato.</li>
	<li>Eparinizzare l'animale a 100 UI/kg e applicare una garza sterile inumidita sull'area incisa. Dopo l'intervento chirurgico, mantenere l'anestesia al 3% di sevoflurano a una portata d'aria di 0,6 L/min.</li>
</ol>6. Protocollo di shock emorragico (Figura 1)
<ol><li>Fase 1: Stabilizzazione (5 min).<ol><li>Dopo l'eparinizzazione, attendere 10 minuti affinché i valori di pressione si stabilizzino. Effettuare una registrazione di 5 minuti per i valori emodinamici basali.</li>
	</ol></li>
	<li>Fase 2: Dissanguamento (5 min): NOTA: Questa fase corrisponde alla fase a volume fisso del modello.<ol><li>Prelevare 5 ml di sangue dall'arteria femorale in 5 minuti (500 μL/30 s) utilizzando una siringa da 1 ml (valori attesi: pressione arteriosa sistolica: 45 mmHg, pressione arteriosa diastolica: 30 mmHg).</li>
		<li>Preparare una miscela di soluzione di Ringer lattato al 50% con il 50% di sangue raccolto a temperatura ambiente. Mettere la miscela in una siringa da 2 ml e posizionarla all'estremità della cannula della vena giugulare.</li>
	</ol></li>
	<li>Fase 3: Shock emorragico (75 min) NOTA: Questa fase è la fase a pressione fissa del modello.<ol><li>Mantenere la pressione arteriosa media a una media di 35 mmHg. Quando la pressione arteriosa media è superiore o uguale a 38 mmHg, prelevare 200 μL di sangue attraverso l'arteria femorale (media su n = 12 ratti: 10,2 mL).</li>
		<li>Se la pressione arteriosa media scende al di sotto di 32 mmHg, iniettare 200 μL di una miscela di soluzione di Ringer 50% sangue e 50% lattato attraverso la vena giugulare (media su n = 12 ratti: 0,90 mL).</li>
		<li>Misurare il lattato nel sangue periferico su una goccia di sangue dall'estremità della coda utilizzando la punta di un ago (26 G) dopo aver preparato sterile la coda con una garza al termine della fase di shock emorragico.</li>
	</ol></li>
	<li>Fase 4: Rianimazione con fluidi per via endovenosa (20 min)<ol><li>Rianimare con una soluzione di Ringer lattato a temperatura ambiente (RT) a 10 ml/kg per 20 minuti (portata di 10,5 ml/h per un ratto da 350 g) con una siringa da 20 ml attraverso il catetere giugulare con una pompa a siringa.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Fine dell'intervento chirurgico e recupero e follow-up post-chirurgico
<ol><li>Bloccare la vena giugulare e l'arteria femorale e rimuovere il catetere. Navi legittime. Controllare attentamente che non fuoriesca sangue.</li>
	<li>Aggiungere una goccia di anestetico locale sulle aree incise. Sutura le aree incise con punti sottocutanei e cutanei utilizzando sutura sterile 5-0. Disinfettare con soluzione di iodio povidone al 10%.</li>
	<li>Iniettare per via sottocutanea buprenorfina (0,05 mg/kg, 0,3 mL/kg) utilizzando una siringa da 1 mL con ago da 26 G.</li>
	<li>Attendere che il ratto si svezzi dall'anestesia mentre monitora la temperatura. Quando mostra segni di risveglio (vibrisse che si muovono, movimenti delle zampe), rimuovi la sonda rettale e posiziona il ratto nella sua gabbia su un tappetino riscaldante. 10 minuti dopo, riporta il ratto nella sua stanza d'alloggio.</li>
	<li>Somministrare buprenorfina per via sottocutanea (0,05 mg/kg, 0,3 mL/kg) ogni 8 ore.</li>
	<li>Valutare la frequenza respiratoria, il comportamento, la temperatura e il lattato nel sangue 16 ore dopo l'induzione dello shock emorragico, come descritto al punto 6.3.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66523/66523fig01.jpg"> Figura 1: Modello di shock emorragico misto di ratto. Creato con BioRender.com <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66523/66523fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
8. 24 ore dopo l'induzione dello shock emorragico
<ol><li>Anestetizzare l'animale come descritto al punto 3.1. Posizionare l'animale sul tavolo operatorio e inserire la sonda rettale come descritto al punto 3.5. Preparare il catetere per l'incannulamento dell'arteria carotide come descritto per la vena giugulare nei passaggi 2.3 e 2.4.</li>
	<li>Usa la pinza atraumatica DeBakey per afferrare la pelle e praticare un'incisione al centro del collo con forbici fini e affilate o un bisturi. Applicare una goccia di anestetico locale (lidocaina 2%).</li>
	<li>Dilacerare delicatamente il tessuto con una pinza standard. Separare le ghiandole salivari, quindi aprire il muscolo tracheale per rivelare gli anelli tracheali.</li>
	<li>Prendi l'arteria carotide sinistra e separala dal nervo con una pinza standard (è molto probabile che la respirazione dell'animale acceleri). Legare l'arteria carotide distalmente (lato della testa) con filo di seta 4/0.</li>
	<li>Posizionare un filo di sutura sul lato prossimale (lato cuore) e preparare un nodo da chirurgo senza chiuderlo. Clamp l'arteria (posizionare il clamp a monte della sutura laterale prossimale).</li>
	<li>Incidere l'arteria carotide con le forbici da micro dissezione Vannas (un piccolo volume di sangue dovrebbe fluire dall'arteria). Utilizzando una pinza standard, afferrare delicatamente la parete dell'arteria per allargare l'apertura e incannulare l'arteria carotide con il catetere in dotazione, tenendolo con una pinza.</li>
	<li>Sbloccare e controllare il segnale di pressione per confermare il posizionamento del catetere e verificare che il sangue non rifluisca nel catetere (segno di perdita dalle valvole/trasduttore di pressione).</li>
	<li>Se il segnale è buono e non ci sono perdite, far avanzare leggermente il catetere (0,5 cm) e stringere e fissare il nodo del chirurgo precedentemente preparato.</li>
	<li>Eparinizzare l'animale a 100 UI/kg e applicare un impacco sterile inumidito sull'incisione.</li>
	<li>Dopo l'intervento chirurgico, mantenere l'anestesia utilizzando sevoflurano al 3% a una velocità del flusso d'aria di 0,6 L/min.</li>
	<li>Attendere 10 minuti per registrare i valori emodinamici delle 24 ore (valori attesi: pressione arteriosa sistolica: 120 mmHg, pressione arteriosa diastolica: 60 mmHg).</li>
	<li>Per valutare i marcatori plasmatici del danno d'organo, prelevare 1 mL di sangue dall'arteria carotide e centrifugare a 1600 x g per 10 minuti. Aliquotare e conservare il plasma per ulteriori analisi.</li>
	<li>Sacrificare il ratto subito dopo aver misurato i valori emodinamici a 24 ore e raccogliere il sangue. NOTA: Il metodo di eutanasia deve essere adattato ai parametri specifici o ai campioni che verranno raccolti in seguito. Il gruppo fittizio viene sottoposto solo a intervento chirurgico (sezioni 1-5, 7 e 8) senza la procedura di shock emorragico (sezione 6). Gli animali sono stati assegnati in modo casuale dallo sperimentatore tra i gruppi sham e shock emorragico. Solo lo sperimentatore era a conoscenza dell'assegnazione del gruppo nelle diverse fasi dell'esperimento.</li>
</ol>

Incannulamento vascolare con induzione di shock emorragico nei ratti

<ol>
	<li>Cannon, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemorrhagic+Shock.">Hemorrhagic Shock.</a> New Eng J Med. 378 (4), 370-379 (2018).</li><li>Fox, E. E., Holcomb, J. B., Wade, C. E., Bulger, E. M., Tilley, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Earlier+endpoints+are+required+for+hemorrhagic+shock+trials+among+severely+injured+patients.">Earlier endpoints are required for hemorrhagic shock trials among severely injured patients.</a> Shock. 47 (5), 567-573 (2017).</li><li>Frink, M., Andruszkow, H., Zeckey, C., Krettek, C., Hildebrand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+trauma+models:+an+update.">Experimental trauma models: an update.</a> J Biomed Biotechnol. 2011, 797383 (2011).</li><li>Hauser, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+of+traumatic,+hemorrhagic+shock.">Preclinical models of traumatic, hemorrhagic shock.</a> Shock. 24, 24-32 (2005).</li><li>Kemming, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+we+continue+research+in+splenectomized+dogs?+Mycoplasma+haemocanis:+Old+problem+-+new+insight.">Can we continue research in splenectomized dogs? Mycoplasma haemocanis: Old problem - new insight.</a> Eur Sur Res. 36 (4), 198-205 (2004).</li><li>Carroll, R. G., Iamsa, S. G., Pryor, W. H., Allison, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+hemorrhage:+A+clinically+relevant+canine+model+of+hemorrhagic+shock.">Single hemorrhage: A clinically relevant canine model of hemorrhagic shock.</a> Resuscitation. 16 (2), 119-126 (1988).</li><li>Cheung, A. T., Duong, P. L., Driessen, B., Chen, P. C., Jahr, J. S., Gunther, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+function,+oxygenation+and+microvascular+correlation+during+treatment+of+hemorrhagic+shock+with+blood+substitutes.">Systemic function, oxygenation and microvascular correlation during treatment of hemorrhagic shock with blood substitutes.</a> Clin Hemorheol Microcirc. 34 (1-2), 325-334 (2006).</li><li>. Hemorrhage and hemorrhagic shock in swine: A review Available from: <a target="_blank" href="https://apps.dtic.mil/sti/citations/ADA221297">https://apps.dtic.mil/sti/citations/ADA221297</a> (1990)</li><li>Lomas-Niera, J. L., Perl, M., Chung, C. -. S., Ayala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shock+and+hemorrhage:+an+overview+of+animal+models.">Shock and hemorrhage: an overview of animal models.</a> Shock. 24, 33-39 (2005).</li><li>Redl, H., Bahrami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+animal+models:+baboons+for+trauma,+shock,+and+sepsis+studies.">Large animal models: baboons for trauma, shock, and sepsis studies.</a> Shock. 24, 88-93 (2005).</li><li>Marques-Bonet, T., Cheng, Z., She, X., Eichler, E. E., Navarro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+distribution+of+intraspecific+and+interspecific+sequence+divergence+of+human+segmental+duplications+relative+to+human/chimpanzee+chromosomal+rearrangements.">The genomic distribution of intraspecific and interspecific sequence divergence of human segmental duplications relative to human/chimpanzee chromosomal rearrangements.</a> BMC Genom. 9, 384 (2008).</li><li>Schlag, G., Redl, H. R., Till, G. O., Davies, J., Martin, U., Dumont, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-L-selectin+antibody+treatment+of+hemorrhagic-traumatic+shock+in+baboons.">Anti-L-selectin antibody treatment of hemorrhagic-traumatic shock in baboons.</a> Crit Care Med. 27 (9), 1900 (1999).</li><li>F&#252;l&#246;p, A., Tur&#243;czi, Z., Garbaisz, D., Hars&#225;nyi, L., Szij&#225;rt&#243;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+of+hemorrhagic+shock:+A+review.">Experimental models of hemorrhagic shock: A review.</a> Eur Surg Res. 50 (2), 57-70 (2013).</li><li>Zingarelli, B., Ischiropoulos, H., Salzman, A. L., Szab&#243;, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+by+mercaptoethylguanidine+of+the+vascular+and+energetic+failure+in+haemorrhagic+shock+in+the+anesthetised+rat.">Amelioration by mercaptoethylguanidine of the vascular and energetic failure in haemorrhagic shock in the anesthetised rat.</a> Eur J Pharmacol. 338 (1), 55-65 (1997).</li><li>Gonzalez, R. J., Moore, E. E., Ciesla, D. J., Nieto, J. R., Johnson, J. L., Silliman, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-hemorrhagic+shock+mesenteric+lymph+activates+human+pulmonary+microvascular+endothelium+for+in+vitro+neutrophil-mediated+injury:+the+role+of+intercellular+adhesion+molecule-1.">Post-hemorrhagic shock mesenteric lymph activates human pulmonary microvascular endothelium for in vitro neutrophil-mediated injury: the role of intercellular adhesion molecule-1.</a> J Trauma. 54 (2), 219-223 (2003).</li><li>Hoppen, R. A., Corso, C. O., Grezzana, T. J. M., Severino, A., Dal-Pizzol, F., Ritter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertonic+saline+and+hemorrhagic+shock:+hepatocellular+function+and+integrity+after+six+hours+of+treatment.">Hypertonic saline and hemorrhagic shock: hepatocellular function and integrity after six hours of treatment.</a> Acta Cir Bras. 20 (6), 414-417 (2005).</li><li>Rupani, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+disruption+of+the+unstirred+mucus+layer+and+intestinal+restitution+in+loss+of+gut+barrier+function+after+trauma+hemorrhagic+shock.">Relationship between disruption of the unstirred mucus layer and intestinal restitution in loss of gut barrier function after trauma hemorrhagic shock.</a> Surgery. 141 (4), 481-489 (2007).</li><li>Cai, B., Dong, W., Sharpe, S., Deitch, E. A., Ulloa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+inflammatory+responses+in+experimental+models+of+hemorrhage.">Survival and inflammatory responses in experimental models of hemorrhage.</a> J Surg Res. 169 (2), 257-266 (2011).</li><li>Esiobu, P., Childs, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rat+model+of+hemorrhagic+shock+for+studying+vascular+hyperpermeability.">A rat model of hemorrhagic shock for studying vascular hyperpermeability.</a> Methods Mol Biol. 1717, 53-60 (2018).</li><li>Sordi, R., Chiazza, F., Patel, N. S. A., Doyle, R. A., Collino, M., Thiemermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preconditioning'+with+low+dose+lipopolysaccharide+aggravates+the+organ+injury+/+dysfunction+caused+by+hemorrhagic+shock+in+rats.">Preconditioning' with low dose lipopolysaccharide aggravates the organ injury / dysfunction caused by hemorrhagic shock in rats.</a> PLoS One. 10 (4), 0122096 (2015).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+shock+index+and+mortality+rate+of+emergency+patients.">Modified shock index and mortality rate of emergency patients.</a> World J Emerg Med. 3 (2), 114-117 (2012).</li><li>Sahu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shock+index+as+a+marker+for+mortality+rates+in+those+admitted+to+the+medical+intensive+care+unit+from+the+emergency+department.">Shock index as a marker for mortality rates in those admitted to the medical intensive care unit from the emergency department.</a> Cureus. 12 (4), e7903 (2020).</li><li>Zou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucosamine+improves+cardiac+function+following+trauma-hemorrhage+by+increased+protein+O-GlcNAcylation+and+attenuation+of+NF-&#954;B+signaling.">Glucosamine improves cardiac function following trauma-hemorrhage by increased protein O-GlcNAcylation and attenuation of NF-&#954;B signaling.</a> Am J Physiol Heart Circ Phy. 296 (2), H515-H523 (2009).</li><li>N&#246;t, L. G., Marchase, R. B., F&#252;l&#246;p, N., Brocks, C. A., Chatham, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucosamine+administration+improves+survival+rate+after+severe+hemorrhagic+shock+combined+with+trauma+in+rats.">Glucosamine administration improves survival rate after severe hemorrhagic shock combined with trauma in rats.</a> Shock. 28 (3), 345 (2007).</li><li>N&#246;t, L. G., Brocks, C. A., V&#225;mhidy, L., Marchase, R. B., Chatham, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+O-linked+&#946;-N-acetylglucosamine+levels+on+proteins+improves+survival,+reduces+inflammation+and+organ+damage+24+hours+after+trauma-hemorrhage+in+rats.">Increased O-linked &#946;-N-acetylglucosamine levels on proteins improves survival, reduces inflammation and organ damage 24 hours after trauma-hemorrhage in rats.</a> Crit Care Med. 38 (2), 562-571 (2010).</li><li>Patel, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+macrophage+migration+inhibitory+factor+activity+attenuates+haemorrhagic+shock-induced+multiple+organ+dysfunction+in+rats.">Inhibition of macrophage migration inhibitory factor activity attenuates haemorrhagic shock-induced multiple organ dysfunction in rats.</a> Front Immunol. 13, 886421 (2022).</li><li>Patel, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Bruton's+tyrosine+kinase+activity+attenuates+hemorrhagic+shock-induced+multiple+organ+dysfunction+in+rats.">Inhibition of Bruton's tyrosine kinase activity attenuates hemorrhagic shock-induced multiple organ dysfunction in rats.</a> Ann Surg. 277 (3), e624-e633 (2023).</li><li>Curcio, L., D'Orsi, L., De Gaetano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+mathematical+models+of+hemorrhagic+shock.">Seven mathematical models of hemorrhagic shock.</a> Comput Math Methods Med. 2021, e6640638 (2021).</li><li>R&#246;nn, T., Lendemans, S., de Groot, H., Petrat, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+severe+hemorrhagic+shock+in+rats.">A new model of severe hemorrhagic shock in rats.</a> Comp Med. 61 (5), 419-426 (2011).</li><li>Hussmann, B., Lendemans, S., de Groot, H., Rohrig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+replacement+with+Ringer-lactate+is+detrimental+in+severe+hemorrhagic+shock+but+protective+in+moderate+hemorrhagic+shock:+studies+in+a+rat+model.">Volume replacement with Ringer-lactate is detrimental in severe hemorrhagic shock but protective in moderate hemorrhagic shock: studies in a rat model.</a> Crit Care. 18 (1), 5 (2014).</li><li>Mihara, R., Takasu, A., Maemura, K., Minami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+severe+hemorrhagic+shock+at+a+mean+arterial+pressure+of+40+mmHg+does+not+lead+to+brain+damage+in+rats.">Prolonged severe hemorrhagic shock at a mean arterial pressure of 40 mmHg does not lead to brain damage in rats.</a> Acute Med Surg. 5 (4), 350-357 (2018).</li><li>Vincent, J. -. L., De Backer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulatory+shock.">Circulatory shock.</a> N Engl J Med. 369 (18), 1726-1734 (2013).</li><li>Halbgebauer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemorrhagic+shock+drives+glycocalyx,+barrier+and+organ+dysfunction+early+after+polytrauma.">Hemorrhagic shock drives glycocalyx, barrier and organ dysfunction early after polytrauma.</a> J Crit Care. 44, 229-237 (2018).</li><li>Chipman, A. M., Jenne, C., Wu, F., Kozar, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contemporary+resuscitation+of+hemorrhagic+shock:+What+will+the+future+hold.">Contemporary resuscitation of hemorrhagic shock: What will the future hold.</a> Am J Surg. 220, 580-588 (2020).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti noti o relazioni personali che possano aver influenzato il lavoro riportato in questo articolo. I dati a sostegno dei risultati di questo studio sono disponibili presso gli autori corrispondenti su ragionevole richiesta.

In questo articolo, abbiamo descritto per la prima volta un modello rappresentativo di shock emorragico basato su un mix tra i modelli a pressione fissa e a volume fisso. Abbiamo dimostrato che 24 ore dopo l'induzione dello shock, il nostro modello è associato ad un'alterazione dei parametri emodinamici e del metabolismo.
A causa della sua complessa fisiopatologia, lo studio dello shock emorragico richiede l'utilizzo di modelli animali integrati. Infatti, gli approcci in vitro non possono imitare tutti i percorsi coinvolti in questa malattia. Il risveglio degli animali dopo il protocollo di shock emorragico è un passaggio che garantisce una migliore replicazione della situazione clinica. A causa della difficoltà di svegliare gli animali, pochissimi studi hanno incluso questa fase. I rari studi che svegliano gli animali li sacrificano in tempi brevi (2 ore o 6 ore), il che non riflette pienamente ciò che sta accadendo per i pazienti 16,18,23,24. Nonostante lo sviluppo di modelli di shock emorragico, solo pochi studi hanno valutato i parametri (infiammazione, apoptosi, disfunzione d'organo) 24 h dopo l'induzione dello shock, evidenziando così la difficoltà di questo tipo di protocollo 25,26,27. Lo sviluppo di modelli informatici e matematici ha rivoluzionato la ricerca. Sono stati sviluppati numerosi modelli matematici di shock emorragico, ma la maggior parte di questi modelli non tiene conto dell'intera gamma di scambi di fluidi corporei durante lo shock emorragico e richiede miglioramenti prima della potenziale applicabilità clinica28. Ad oggi, una delle sfide principali è lo sviluppo di un modello animale che imiti il più fedelmente possibile la patologia nell'uomo.
In letteratura è descritto un gran numero di modelli di shock emorragico che si differenziano per approcci vascolari, volumi di sangue prelevati o pressione mirata13. Più in generale, i modelli di shock emorragico possono essere classificati in 3 gruppi: emorragia a volume fisso, emorragia a pressione fissa ed emorragia incontrollata. La standardizzazione e la riproducibilità con l'emorragia a volume fisso sono difficili e spiegate dal rapporto volume ematico/peso corporeo, che diminuisce linearmente con il peso del ratto. L'emorragia a pressione fissa è molto utilizzata, spiegando così che le impostazioni (pressione mirata, durata dello shock) sono molto variabili da uno studio all'altro, rendendo difficile la trasposizione dei risultati da un modello all'altro. È anche importante sottolineare che la compromissione emodinamica, che svolge un ruolo fondamentale nella fisiopatologia dello shock emorragico, non viene valutata sistematicamente, il che potrebbe aumentare la discrepanza nei risultati tra gli studi. Infine, il modello dell'emorragia incontrollata, sebbene clinicamente rilevante, solleva questioni di riproducibilità ed etica. Al fine di conciliare il più possibile rilevanza clinica, standardizzazione e riproducibilità, abbiamo sviluppato un modello misto con fasi sia a volume fisso che a pressione fissa.
Nel modello qui descritto, la temperatura e la frequenza respiratoria non vengono modificate 24 ore dopo l'intervento. Ciò può essere spiegato dal fatto che la chirurgia viene eseguita in condizioni sterili, limitando così la risposta pro-infiammatoria. Lo shock emorragico è definito come un'insufficienza circolatoria acuta dovuta a perdita di sangue associata a un calo della pressione sanguigna. Come nell'uomo, questo modello di shock emorragico provoca una diminuzione della pressione arteriosa media, in particolare a causa di una diminuzione della pressione arteriosa diastolica. È interessante notare che, come descritto in precedenza, la frequenza cardiaca è invariata dopo la fase di rianimazione in questo modello di shock emorragico 29,30,31. Il calo della pressione arteriosa media è probabilmente associato a una ridotta perfusione d'organo, che porta a disfunzione multiviscerale, che può essere illustrata dall'aumento di vari marcatori plasmatici nel nostro modello (creatininemia, troponina T cardiaca, ASAT e ALAT). L'interruzione dell'apporto di ossigeno porta al metabolismo anaerobico, che provoca un aumento della lattatemia32. Come descritto in precedenza, questo modello di shock emorragico porta ad un aumento dei livelli di lattato nel sangue30. Questo aumento potrebbe essere associato all'ischemia causata a livello dell'arteria femorale. Tuttavia, considerando che gli animali del gruppo fittizio hanno una lattemia fisiologica e sono stati sottoposti alla stessa procedura chirurgica del gruppo shock emorragico, sembrerebbe che questo aumento sia legato al protocollo di shock emorragico. Nel loro insieme, tutti questi dati confermano che il protocollo descritto in questo studio consente lo sviluppo di un nuovo modello rilevante di shock emorragico nel ratto.
Il limite di questo modello è l'uso dell'eparina, fondamentale per ridurre la naturale coagulazione del sangue quando viene a contatto con materiali plastici come le cannule. Tuttavia, l'uso di eparina può influire sulla coagulopatia associata allo shock emorragico traumatico33. Questo studio coinvolge animali maschi sani di età compresa tra 11 e 13 settimane. Considerando che il sesso, l'età e le comorbidità (ipertensione, diabete, ecc.) possono influire sui risultati, sarebbe rilevante valutare il loro impatto nel nostro modello. Nel protocollo, la fase di rianimazione viene eseguita tramite un'iniezione di Ringer Lactate, un cristalloide che potrebbe favorire la coagulopatia e l'edema tissutale34. Sebbene l'uso di emoderivati sia ottimale, questi sono scarsi e deperibili e potrebbe essere difficile avere una scorta sufficiente di sangue di ratto per l'intero protocollo. I modelli di shock emorragico per la rianimazione basati su emoderivati e cristalloidi/colloidi sono due approcci complementari.
I punti di forza di questo modello sono 1) la sua elevata riproducibilità (illustrata dalla bassa variabilità dei risultati), 2) la sua facilità di applicazione (la maggior parte degli strumenti sono classici e sono noti approcci vascolari) e 3) la sua rilevanza clinica, in particolare a causa del risveglio animale e della disfunzione multi-viscerale. Sulla base del punteggio comportamentale descritto nel File supplementare 1, sono stati stabiliti dei punti limite. Il sacrificio sarà discusso se si raggiunge un punteggio superiore a 9, secondo la tabella allegata. Se viene raggiunto un punteggio di 11, l'animale verrà sistematicamente soppresso. In questo studio, nessuno degli animali ha raggiunto un punteggio superiore a 8 e, pertanto, nessuno è stato escluso dallo studio. Questo potrebbe spiegare perché il modello qui descritto è associato a un tasso di mortalità 3 volte inferiore a quello dell'altro studio di 24 ore (16% vs. 47%)25.
La fase critica del modello è la fase di shock emorragico. È importante rispettare l'intervallo di pressione di 32-38 mmHg. Infatti, abbiamo osservato che il mantenimento di pressioni arteriose medie al di sotto di 32 mmHg ha comportato un rapido e brusco calo della pressione. Al contrario, il mantenimento di una pressione superiore a 38 mmHg non fornisce un modello sufficientemente vicino alla realtà clinica. Queste osservazioni sono in accordo con l'intervallo di pressione arteriosa media mirato in altri modelli13.
In conclusione, abbiamo dimostrato che il modello di shock emorragico di ratto descritto in questo studio è clinicamente rilevante e potrebbe essere utile sia nella comprensione dei meccanismi fisiopatologici attraverso l'identificazione di nuovi attori/percorsi biologici, sia nell'identificazione di nuove strategie terapeutiche testando diverse molecole candidate.

Lo shock emorragico (HS) è uno stato di shock caratterizzato da una significativa perdita di volume sanguigno, con conseguente disossia tissutale. L'HS è una patologia complessa che associa cambiamenti emodinamici e metabolici insieme a risposte pro e anti-infiammatorie. Circa 1,9 milioni di decessi in tutto il mondo sono attribuiti all'emorragia e alle sue conseguenzeogni anno 1. Le attuali linee guida per la cura riguardano principalmente la somministrazione di liquidi per via endovenosa (integrata o meno con molecole vasoattive) e l'ossigenoterapia. Tuttavia, questi trattamenti sono sintomatici e possono essere inefficaci, il che spiega perché la mortalità associata all'HS rimane elevata2. Ciò giustifica l'importanza di identificare nuovi meccanismi molecolari e cellulari e, quindi, trattamenti per ridurre la mortalità.
I modelli animali consentono di decifrare i meccanismi fisiopatologici coinvolti nelle malattie e di testare nuove strategie terapeutiche. In letteratura esistono numerosi modelli animali di shock emorragico. Questi modelli differiscono non solo per le specie utilizzate, ma anche per i mezzi di induzione dell'HS (ad esempio, pressione fissa vs. volume fisso) (Tabella 1, Tabella 2)3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. Inoltre, i protocolli variano all'interno dello stesso tipo di modello (ad esempio, tempo di emorragia, pressione arteriosa media mirata) (Tabella 3)14,15,16,17,18,19,20. Considerando l'ampia varietà di modelli di shock emorragico esistenti e la complessità della replicazione della situazione clinica, lo studio preclinico di questa patologia rimane limitato. Lo sviluppo di un modello di shock emorragico riproducibile, standardizzabile e facile da implementare è nell'interesse di tutti. Ciò faciliterebbe il confronto tra i vari studi e quindi svelerebbe la complessa fisiopatologia dello shock emorragico. Lo scopo di questo protocollo è stato quello di sviluppare un nuovo modello clinicamente rilevante di shock emorragico nei ratti utilizzando due fasi successive di emorragia a volume fisso seguite da una fase fissa di bassa pressione sanguigna.
Tabella 1: Specie utilizzate come modello per lo shock emorragico 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66523/Table%201.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 2: I diversi tipi di shock emorragico13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66523/Table%202.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 3: Esempio della diversità dei modelli sperimentali di shock emorragico nei ratti indotto da un protocollo di pressione fissa. Riassunto dei parametri per diversi modelli sperimentali di shock emorragico. I vasi mostrati in rosso sono le arterie e quelli mostrati in blu sono le vene. Per la rianimazione si utilizza come riferimento il volume di sangue prelevato (sangue: rianimazione con un volume identico a quello del sangue prelevato durante lo shock; x2: rianimazione con un volume doppio di quello del sangue prelevato durante lo shock; x4: rianimazione con un volume quattro volte superiore a quello del sangue prelevato durante lo shock). MAP: pressione arteriosa media; RL: Ringer lattato 14,15,16,17,18,19,20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66523/Table%203.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>MDSS01SE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 mL syringe</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SS*02SE1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>MDSS20ESE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia induction chamber</td>
			<td>TEMSEGA</td>
			<td>HUBBIV4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Microlance 3 23 G needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>300800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Microlance 3 26 G needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>304300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood pressure transducer</td>
			<td>emka TECHNOLOGIES</td>
			<td>BP_T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprecare</td>
			<td>Axience</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1 mL vial, buprenorphine 0.3 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DE BAKEY, Atraumatic Vascular Forceps</td>
			<td>ALLGAIER instrumente medical</td>
			<td>09-543-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dermal Betadine 10%</td>
			<td>Mylan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>125 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps - Curved / Serrated</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11065-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8</td>
			<td>GraphPad by Dotmatics</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating mats</td>
			<td>TEMSEGA</td>
			<td>OPT/THERM_MATELASSTEREORATS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium</td>
			<td>PANPHARMA&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5 mL bottle, 5,000 UI/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IOX2 software</td>
			<td>emka TECHNOLOGIES</td>
			<td>IOX_BASE_4c + IOX_FULLCARDIO_4a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors - ToughCut</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>Fresenius</td>
			<td>N/A</td>
			<td>10 mL bootle, 8.11 mg, lidocaine hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniHub-V3.2</td>
			<td>TEMSEGA</td>
			<td>PF006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria 201/A Vessel Clamp - Straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18320-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non sterile compresses</td>
			<td>Raffin</td>
			<td>70189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non sterile drape</td>
			<td>Dutscher&#160;</td>
			<td>30786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olsen-Hegar Needle Holder with Scissors&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing PE10</td>
			<td>PHYMEP</td>
			<td>BTPE-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing PE50</td>
			<td>PHYMEP</td>
			<td>BTPE-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rats</td>
			<td>Charles Rivers</td>
			<td>-</td>
			<td>Male WISTAR HAN (10 weeks)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectal probe</td>
			<td>TEMSEGA</td>
			<td>SONDE_TEMP_RATS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer Lactates</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>964175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scrub Betadine 4%</td>
			<td>Mylan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>125 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sevoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>N/A</td>
			<td>250 mL bottle, gas 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sevoflurane Vaporizer</td>
			<td>TEMSEGA</td>
			<td>SEVOTEC3NSELEC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StatStrip lactate test strips</td>
			<td>Nova Biomedical</td>
			<td>47486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StatStrip Xpress lactate Meter</td>
			<td>Nova Biomedical</td>
			<td>47486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile compresses</td>
			<td>Laboratoire SYLAMED</td>
			<td>211S05-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile drape</td>
			<td>M&#246;lnlycke</td>
			<td>800330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriles gloves</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>MSG7275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Optilene</td>
			<td>3097141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture for vessels</td>
			<td>SMI</td>
			<td>8150046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Vial m&#233;dical</td>
			<td>16010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>usbAMP</td>
			<td>emka TECHNOLOGIES</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaseline</td>
			<td>Cooper</td>
			<td>N/A</td>
			<td>10 mL vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin A Dulcis (ALLERGAN)</td>
			<td>Allergan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>10 g tube, Retinol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

developing a clinically relevant hemorrhagic shock model in rats

Negli ultimi decenni, lo sviluppo di modelli animali ha permesso di comprendere meglio diverse patologie e di individuare nuovi trattamenti. Lo shock emorragico, cioè l'insufficienza d'organo dovuta alla rapida perdita di un grande volume di sangue, è associato a una fisiopatologia molto complessa che coinvolge diverse vie. Numerosi modelli animali esistenti di shock emorragico si sforzano di replicare ciò che accade negli esseri umani, ma questi modelli hanno limiti in termini di rilevanza clinica, riproducibilità o standardizzazione. Lo scopo di questo studio è stato quello di perfezionare questi modelli per sviluppare un nuovo modello di shock emorragico. In breve, lo shock emorragico è stato indotto nei ratti maschi Wistar Han (11-13 settimane di età) da un dissanguamento controllato responsabile di un calo della pressione arteriosa media. La fase successiva di 75 minuti è stata quella di mantenere una pressione arteriosa media bassa, compresa tra 32 mmHg e 38 mmHg, per innescare le vie fisiopatologiche dello shock emorragico. La fase finale del protocollo ha imitato la cura del paziente con la somministrazione di liquidi per via endovenosa, soluzione di lattato Ringer, per aumentare la pressione sanguigna. I punteggi relativi al lattato e al comportamento sono stati valutati 16 ore dopo l'inizio del protocollo, mentre i parametri emodinamici e i marcatori plasmatici sono stati valutati 24 ore dopo l'infortunio. Ventiquattro ore dopo l'induzione dello shock emorragico, la pressione arteriosa e diastolica media è diminuita nel gruppo shock emorragico (p < 0,05). La frequenza cardiaca e la pressione arteriosa sistolica sono rimaste invariate. Tutti i marcatori di danno d'organo sono aumentati con lo shock emorragico (p < 0,05). I punteggi di lattatemia e comportamentali sono aumentati rispetto al gruppo sham (p < 0,05). In conclusione, abbiamo dimostrato che il protocollo qui descritto è un modello rilevante di shock emorragico che può essere utilizzato in studi successivi, in particolare per valutare il potenziale terapeutico di nuove molecole.

Hemorrhagic shock (HS) is a state of shock characterized by significant blood volume loss, resulting in tissue dysoxia. HS is a complex pathology that associates hemodynamic and metabolic changes along with pro- and anti-inflammatory responses. Approximately 1.9 million deaths worldwide are attributed to the hemorrhage and its consequences each year1. Current guidelines for care primarily involve intravenous fluid administration (supplemented or not with vasoactive molecules) and oxygen therapy. However, these treatments are symptomatic and can be ineffective, which explains why the HS-associated mortality remains high2. This justifies the importance of identifying new molecular and cellular mechanisms and, thus, treatments to reduce mortality.
Animal models allow for deciphering the pathophysiological mechanisms involved in diseases and testing new therapeutic strategies. Numerous animal models of hemorrhagic shock exist in the literature. These models differ not only in the species used but also in the means of inducing HS (e.g., fixed pressure vs. fixed volume) (Table 1, Table 2)3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. Also, protocols vary within the same type of model (e.g., time of hemorrhage, targeted mean arterial pressure) (Table 3)14,15,16,17,18,19,20. Considering the wide variety of existing hemorrhagic shock models and the complexity of replicating the clinical situation, the preclinical study of this pathology remains limited. The development of a reproducible, standardizable, and easy-to-implement hemorrhagic shock model is in everyone&#39;s interest. This would facilitate comparison between the various studies and thus unravel the complex pathophysiology of the hemorrhagic shock. The aim of this protocol was to develop a new clinically relevant model of hemorrhagic shock in rats using two successive phases of hemorrhage with fixed volume followed by a fixed low blood pressure phase.
Table 1: Species used as a model for hemorrhagic shock3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66523/Table 1.xlsx" target="_blank">Please click here to download this Table.</a>
Table 2: The different types of hemorrhagic shock13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66523/Table 2.xlsx" target="_blank">Please click here to download this Table.</a>
Table 3: Example of the diversity of experimental models of hemorrhagic shock in rats induced by a fixed pressure protocol. Summary of parameters for different experimental models of hemorrhagic shock. Vessels shown in red are arteries, and those shown in blue are veins. For resuscitation, the volume of blood sampled is used as a reference (blood: resuscitation with a volume identical to that of blood sampled during shock; x2: resuscitation with a volume twice that of blood sampled during shock; x4: resuscitation with a volume four times that of blood sampled during shock). MAP: Mean Arterial Pressure; RL: Ringer Lactate14,15,16,17,18,19,20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66523/Table 3.xlsx" target="_blank">Please click here to download this Table.</a>

Autore in primo piano: Sviluppo di strategie terapeutiche innovative per la ricerca sullo shock emorragico

Sviluppo di un modello di shock emorragico clinicamente rilevante nei ratti

Hemorrhagic shock is responsible for two million deaths worldwide every year. We are studying the pathological mechanism of hemorrhagic shock, with the aim of identifying new targets, and thus proposing innovative therapeutic strategies. Hemorrhagic shock is a difficult condition in its own right, combining hemodynamic alteration with metabolic damage and organ dysfunctions.The variety of experimental protocols makes its study even more complex. In this study, we propose to develop a reproductive, standardized, and clinically relevant rat model of hemorrhagic shock. We hope that this model of hemorrhagic shock can become one of the standard models for future study.The use of a standard model would facilitate advances in the field, not least because it would make it possible to compare results between different teams working on hemorrhagic shock.

Seguendo il protocollo sopra descritto, abbiamo valutato diversi parametri emodinamici 24 ore dopo l'induzione dello shock emorragico. La pressione arteriosa media basale (prima dell'inizio del protocollo di shock emorragico) è simile tra i gruppi di shock fittizio e emorragico (Figura 2A). Come previsto, la pressione arteriosa media è significativamente ridotta con il protocollo di shock emorragico, il che può essere spiegato dal calo della pressione arteriosa diastolica (Pressione arteriosa media: Sham: 92 mmHg ± 3 mmHg; HS: 82 mmHg ± 2 mmHg; Pressione arteriosa diastolica: 73 mmHg ± 3 mmHg; HS: 61 mmHg ± 2 mmHg) (Figura 2B, C). Lo shock emorragico non influisce sulla pressione arteriosa sistolica, sulla pressione del polso e sulla frequenza cardiaca (Figura 2D-F). L'indice di shock (rapporto frequenza cardiaca/pressione arteriosa sistolica) e l'indice di shock modificato (MSI) (rapporto frequenza cardiaca/pressione arteriosa media) sono due predittori di mortalità nei pazienti gravi14,15. Più alti sono i valori, maggiore è il rischio di mortalità. In questo modello, l'indice di shock non è modificato tra i due gruppi, mentre l'indice di shock modificato tende ad aumentare nello shock emorragico (MSI: Sham: 4,24 ± 0,11; HS: 4,70 ± 0,15) (Figura 2G,H).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66523/66523fig02.jpg"> Figura 2: Impatto dello shock emorragico sui parametri emodinamici. (A) Pressione arteriosa media basale, (B) pressione arteriosa media, (C) pressione arteriosa diastolica, (D) pressione arteriosa sistolica, (E) pressione del polso, (F) frequenza cardiaca, (G) indice di shock e (H) indice di shock modificato tra animali Sham e shock emorragici. I risultati sono rappresentati come media ± SEM. La significatività statistica è stata valutata mediante t-test non accoppiato. *: p < 0,05; : p < 0,001. n = 6-12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66523/66523fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
La compromissione metabolica globale durante lo shock emorragico può essere valutata mediante lattatemia. Come previsto, la latatemia è aumentata dopo il protocollo di shock emorragico e 16 ore dopo (Fine del protocollo: Sham: 1,13 mmol/L ± 0,14 mmol/L; HS: 5,98 mmol/L ± 0,39 mmol/L; H+16: Sham: 1,95 mmol/L ± 0,23 mmol/L; HS: 2,95 mmol/L ± 0,19 mmol/L) (Figura 3A, B). La temperatura e la frequenza respiratoria sono due componenti della Sindrome da Risposta Infiammatoria Sistemica (SIRS), una risposta pro-infiammatoria caratteristica dello stato di shock. Né la temperatura né la frequenza respiratoria vengono modificate tra i due gruppi 16 ore dopo l'induzione dello shock emorragico (Figura 3C, D). Abbiamo valutato l'impatto dello shock emorragico su alcuni parametri comportamentali come la postura, l'attività, ecc. (File supplementare 1). Il punteggio comportamentale è aumentato nel gruppo shock emorragico 16 ore dopo il protocollo (Sham: 0,33 ± 0,21; HS: 2,27 ± 0,69) (Figura 3E).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66523/66523fig03.jpg"> Figura 3: Impatto dello shock emorragico sulla lattatemia, sulla temperatura, sulla frequenza respiratoria e sul punteggio comportamentale. (A) Lattatemia alla fine del protocollo di shock emorragico, (B) lattatemia, (C) temperatura, (D) frequenza respiratoria e (E) punteggio comportamentale 16 ore dopo l'induzione dello shock emorragico tra animali Sham e shock emorragico. I risultati sono rappresentati come media ± SEM. La significatività statistica è stata valutata mediante t-test non accoppiato. *: p < 0,05; **: p < 0,01; : p < 0,001. n = 6-12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66523/66523fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Lo shock emorragico è associato a una disfunzione d'organo. Al fine di valutare se il modello potesse essere clinicamente rilevante, abbiamo valutato i marcatori plasmatici di danno d'organo 24 ore dopo il protocollo. La creatininemia (Sham: 19,13 μmol/L ± 0,33 μmol/L; HS: 28,88 μmol/L ± 2,69 μmol/L), la troponina cardiaca T (Sham: 9,38 ng/L ± 1,87 ng/L; HS: 35,62 ng/L ± 2,28 ng/L) e l'aspartato e l'alanina amino transferasi (ASAT: Sham: 221 UI/L ± 48 UI/L; HS: 963 UI/L ± 144 UI/L; ALAT: Sham: 36 UI/L ± 4 UI/L; HS: 323 UI/L ± 13 UI/L) che riflettono danni rispettivamente al rene, al cuore e al fegato sono tutti significativamente aumentati con lo shock emorragico (Figura 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66523/66523fig04.jpg"> Figura 4: Il modello di shock emorragico è associato a disfunzione d'organo. (A) Livelli di creatininemia, (B) troponina T cardiaca, (C) aspartato aminotransferasi e (D) alanina aminotransferasi 24 ore dopo l'induzione dello shock emorragico tra Sham e animali da shock emorragico. I risultati sono rappresentati come media ± SEM. La significatività statistica è stata valutata mediante t-test non accoppiato. *: p < 0,05; **: p < 0,01; : p < 0,001. n = 4 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66523/66523fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
File supplementare 1: Dettagli del punteggio comportamentale <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66523/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Developing Innovative Therapeutic Strategies for Hemorrhagic Shock Research at JoVE.com

Lo shock emorragico uccide 1,9 milioni di persone in tutto il mondo ogni anno. I piccoli animali sono spesso usati come modelli di shock emorragico, ma sono associati a problemi di standardizzazione, riproducibilità e significato clinico, limitandone così la rilevanza. Questo articolo descrive lo sviluppo di un nuovo modello di shock emorragico clinicamente rilevante nei ratti.

Over the recent decades, the development of animal models allowed us to better understand various pathologies and identify new treatments. Hemorrhagic ...

Lo shock emorragico è responsabile di due milioni di morti in tutto il mondo ogni anno. Stiamo studiando il meccanismo patologico dello shock emorragico, con l'obiettivo di identificare nuovi bersagli, e quindi proporre strategie terapeutiche innovative. Lo shock emorragico è una condizione difficile di per sé, che combina l'alterazione emodinamica con danni metabolici e disfunzioni d'organo.La varietà di protocolli sperimentali rende il suo studio ancora più complesso. In questo studio, proponiamo di sviluppare un modello di ratto riproduttivo, standardizzato e clinicamente rilevante di shock emorragico. Ci auguriamo che questo modello di shock emorragico possa diventare uno dei modelli standard per studi futuri.L'uso di un modello standard faciliterebbe i progressi nel campo, non da ultimo perché renderebbe possibile confrontare i risultati tra diversi team che lavorano sullo shock emorragico.

developing-a-clinically-relevant-hemorrhagic-shock-model-in-rats

Research

JoVE Journal

Medicine

Developing a Clinically Relevant Hemorrhagic Shock Model in Rats

633 Views.  Nantes Université. Lo shock emorragico è responsabile di due milioni di morti in tutto il mondo ogni anno. Stiamo studiando il meccanismo patologico dello shock emorragico, con l'obiettivo di identificare nuovi bersagli, e quindi proporre strategie terapeutiche innovative. Lo shock emorragico è una condizione difficile di per sé, che combina l'alterazione emodinamica con danni metabolici e disfunzioni d'organo.La varietà di protocolli sperimentali rende il suo studio ancora più complesso. In questo ...

Video: Autore in primo piano: Sviluppo di strategie terapeutiche innovative per la ricerca sullo shock emorragico

Over the recent decades, the development of animal models allowed us to better understand various pathologies and identify new treatments. Hemorrhagic shock, i.e., organ failure due to rapid loss of a large volume of blood, is associated with a highly complex pathophysiology involving several pathways. Numerous existing animal models of hemorrhagic shock strive to replicate what happens in humans, but these models have limits in terms of clinical relevance, reproducibility, or standardization. The aim of this study was to refine these models to develop a new model of hemorrhagic shock. Briefly, hemorrhagic shock was induced in male Wistar Han rats (11-13 weeks old) by a controlled exsanguination responsible for a drop in the mean arterial pressure. The next phase of 75 min was to maintain a low mean arterial blood pressure, between 32 mmHg and 38 mmHg, to trigger the pathophysiological pathways of hemorrhagic shock. The final phase of the protocol mimicked patient care with an administration of intravenous fluids, Ringer Lactate solution, to elevate the blood pressure. Lactate and behavioral scores were assessed 16 h after the protocol started, while hemodynamics parameters and plasmatic markers were evaluated 24 h after injury. Twenty-four hours post-hemorrhagic shock induction, the mean arterial and diastolic blood pressure were decreased in the hemorrhagic shock group (p&#160;&#60; 0.05). Heart rate and systolic blood pressure remained unchanged. All organ damage markers were increased with the hemorrhagic shock (p &#60; 0.05). The lactatemia and behavioral scores were increased compared to the sham group (p &#60; 0.05). In conclusion, we demonstrated that the protocol described here is a relevant model of hemorrhagic shock that can be used in subsequent studies, particularly to evaluate the therapeutic potential of new molecules.

Hemorrhagic shock kills 1.9 million people worldwide every year. Small animals are frequently used as hemorrhagic shock models but are associated with issues of standardization, reproducibility, and clinical significance, thus limiting their relevance. This article describes developing a new clinically relevant hemorrhagic shock model in rats.

Ricerca

Medicina

Jugular Vein and Femoral Artery Cannulation with Hemorrhagic Shock Induction and Resuscitation in Rats

To begin, insert a lubricated rectal probe to control the temperature of the anesthetized rat during surgery. After locating the jugular region in the lower right neck region of the anesthetized rat above the clavicle, use DeBakey Atraumatic Forceps to gently grasp the skin and make a precise incision with fine sharp scissors or a scalpel. Gently slash the tissue with standard pattern forceps.Locate and gently liberate the jugular vein from its muscular compartment. Place a 4-0 silk suture thread to securely ligate the distal side of the jugular vein. Use the suture with the needle holders to tension the jugular vein.Place a 4-0 suture on the proximal side of the jugular vein and prepare a surgeon knot without tightening it. Using Vannas micro dissecting scissors, make a small incision in the jugular vein. After carefully grasping the vein wall with small forceps, insert the PE50 catheter in the jugular vein.Slightly advance the catheter, and to confirm its correct placement in the vein, draw a small amount of blood and re-inject it. Tighten the previously prepared knot to secure the catheter. Apply a drop of lidocaine to the incised area.Cover the incision with a moist sterile gauze pad. Use DeBakey Atraumatic Forceps to grasp the skin of the Scarpa triangle on the left leg, and make an incision with fine sharp scissors or a scalpel. Gently dilacerate tissue with standard pattern forceps.Locate the femoral triad and place one forceps under the triad. Then with a second standard pattern forceps, carefully separate the artery from the nerve and femoral vein. Place a 4-0 suture to ligate the femoral artery distally and take the suture with the needle holders to put the femoral artery in tension.Now place a 4-0 suture on the proximal side of the femoral artery and prepare a surgeon knot without closing it. After clamping the artery, use Vannas micro dissecting scissors to make a transverse incision in the femoral artery. Grasp the artery wall with standard pattern forceps and cannulate the femoral artery with the catheter holding it with forceps.Gently unclamp the artery and ensure that the blood is not flowing back into the catheter. If the signal is good, advance the catheter slightly into the artery and tighten the previously prepared surgeon knot. Administer heparin into the rat, and place a moistened sterile gauze pad over the incised area.After 10 minutes of stabilization, record the basal hemodynamic values for five minutes. To induce hemorrhagic shock, use a one milliliter syringe to draw five milliliters of blood from the femoral artery over five minutes. Prepare a mix of 50%lactated Ringer solution and 50%collected blood at room temperature.Place a two milliliter syringe filled with the mix at the end of the jugular vein cannula. For hemorrhagic shock maintenance, when mean arterial pressure exceeds 38 millimeters of mercury, withdraw 200 microliters of blood from the femoral artery. If pressure drops below 32 millimeters of mercury, inject 200 microliters of the 50%blood, 50%lactated Ringer's mixture through the jugular vein.After sterile preparation of the tail with a gauze pad, use the tip of the needle to draw a blood drop from the end of the tail to measure peripheral blood lactate. Finally, resuscitate the rat with a lactated Ringer solution using a 20 milliliter syringe through the jugular catheter with a syringe pump.

Incannulamento della vena giugulare e dell'arteria femorale con induzione di shock emorragico e rianimazione nei ratti

Post-Surgical Monitoring and Hemodynamic Evaluation Following Hemorrhagic Shock in Rats

After hemorrhagic shock treatment, clamp the jugular vein of the anesthetized rat. Remove the catheter from the veins. Upon ligation, ensure that there is no blood leakage from the vessels.Now use a 5-0 sterile suture to close incised areas with subcutaneous and cutaneous stitches. Disinfect the surgical area with 10%povidone iodine solution. Using a one milliliter syringe fitted with a 26 gauge needle, subcutaneously inject buprenorphine.Upon awakening, place the rat on the heating mat in its cage. After 16 hours of hemorrhagic shock induction, draw blood drop from the end of the tail to measure blood lactate. Place the anesthetized rat on the surgical table and insert the rectal probe.For carotid artery cannulation, use DeBakey atraumatic forceps to grasp the skin and make an incision in the middle of the neck with fine and sharp scissors or a scalpel. With standard pattern forceps, gently dilacerate tissue. Separate the salivary glands and open the tracheal muscle to reveal the tracheal rings.Isolate the left carotid artery from the nerve with standard pattern forceps and ligate it distally with a 4-0 silk thread. Now place the suture thread on the proximal side of the artery and prepare a surgeon's knot without closing it. After clamping, use Vannas micro dissecting scissors to incise the carotid artery.With standard operating forceps, gently grasp the artery wall to enlarge the opening and cannulate the artery with the catheter provided, holding it using forceps. Gently unclamp the artery and ensure that the blood is not flowing back into the catheter. After confirming the correct blood pressure signal, advance the catheter slightly into the artery and tighten the previously prepared surgeon knot.Basal mean arterial pressure was similar between sham and hemorrhagic shock groups 24 hours post-hemorrhagic shock induction. The mean arterial pressure significantly decreased in the hemorrhagic shock group due to a reduction in diastolic blood pressure. No changes were observed in systolic blood pressure, pulse pressure, and heart rate across groups.While the shock index remained unchanged, the modified shock index exhibited a notable increase in the hemorrhagic shock group. Lactatemia, indicative of global metabolic impairment, showed a significant increase following hemorrhagic shock, further elevating after 16 hours of hemorrhagic shock. Temperature and respiration rate, markers of systemic inflammatory response syndrome remained unchanged between groups 16 hours after hemorrhagic shock induction.Behavioral assessments demonstrated an increased behavioral score in the hemorrhagic shock group, suggesting altered postures and activities.