Gli autori desiderano ringraziare il supporto tecnico e finanziario fornito dalla Stazione Sperimentale Agricola dell'Università della Georgia. Inoltre, gli autori desiderano ringraziare Samuel Ogundipe, il Dr. Ronald Pegg e il Dr. Joon Hyuk Suh per il loro aiuto nell'analisi dei campioni di processo.

I reagenti, i materiali di consumo e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.
1. Costruzione e integrazione del bioreattore e del sistema di estrazione liquido-liquido
<ol><li>Preparare la soluzione di estrazione in fase organica e il serbatoio.<ol><li>Preparare 2 L di soluzione di estrazione in fase organica sciogliendo 60 g di ossido di triottilfosfina (TOPO) in olio minerale utilizzando una piastra di agitazione magnetica e un agitatore.</li>
		<li>Aggiungere la soluzione di estrazione in un serbatoio di vetro da 2 L (ad es. bottiglia Schott).</li>
		<li>Posizionare il serbatoio su una piastra di agitazione magnetica (Figura 1A). La velocità di miscelazione consigliata durante il funzionamento continuo LLE è di 150-250 giri/min.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare un tappo a tre porte per il serbatoio della soluzione di estrazione.<ol><li>Collegare un tubo pescante alla prima porta che funga da porta di uscita che fornisce la soluzione di estrazione alla membrana di estrazione diretta (FEM) (Figura 1B).</li>
		<li>Fissare una seconda porta che funga da porta di ritorno per la soluzione di estrazione dalla membrana di estrazione all'indietro (BEM) (Figura 1C).</li>
		<li>Aggiungere una terza porta, aperta all'atmosfera, per smorzare le fluttuazioni di pressione causate dalla pompa a membrana.</li>
	</ol></li>
	<li>Collegare la pompa a membrana alle membrane di estrazione.<ol><li>Posizionare un azionamento della pompa a velocità variabile da 100 giri/min dotato di una testa della pompa a membrana in politetrafluoroetilene (PTFE) adiacente al serbatoio (Figura 1D).</li>
		<li>Collegare la porta di uscita del serbatoio della soluzione di estrazione (Figura 1A) all'ingresso della pompa a membrana e quindi l'uscita della pompa a membrana all'ingresso lato mantello alla base del FEM (Figura 1B) utilizzando il tubo flessibile della pompa (ad es. taglia 16, 18).</li>
		<li>Collegare l'uscita lato mantello nella parte superiore del FEM all'ingresso lato mantello alla base del BEM (Figura 1C) utilizzando un tubo flessibile della pompa (ad es. taglia 18).</li>
		<li>Collegare l'uscita lato mantello nella parte superiore del BEM alla porta di ritorno sul serbatoio della soluzione di estrazione (Figura 1A) utilizzando un tubo flessibile della pompa (ad es. misura 16, 18). NOTA: Questo componente del sistema trasferisce gli MCFA estratti dal brodo di fermentazione nel FEM alla soluzione di stripping nel BEM.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare la soluzione di strippaggio in fase acquosa e il serbatoio.<ol><li>Preparare 3,25 L di soluzione di strippaggio in fase acquosa prelevando una soluzione di acido borico 0,5 M e regolandola a pH 9 utilizzando NaOH.</li>
		<li>Versare la soluzione in un serbatoio di vetro da 3,5 L con un'ancoretta magnetica.</li>
		<li>Posizionare il serbatoio su una piastra di agitazione magnetica (Figura 1E).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare un tappo a quattro porte per il serbatoio della soluzione di stripping.<ol><li>Collegare un tubo pescante alla prima porta che funga da porta di uscita che fornisce la soluzione di strippaggio al BEM.</li>
		<li>Applicare una seconda porta comprendente un raccordo a Y per (1) fungere da porta di ritorno della soluzione di strippaggio dal BEM e (2) fungere da flusso di trascinamento per le aggiunte di NaOH dal sistema di controllo del pH.</li>
		<li>Aggiungere una terza porta, aperta all'atmosfera, per tenere conto dell'aumento di volume causato dalle aggiunte di NaOH e dall'accumulo di MCFA.</li>
		<li>Fornire una quarta porta per alloggiare la sonda di pH del regolatore di pH.</li>
	</ol></li>
	<li>Installare un sistema di controllo del pH nel serbatoio della soluzione di stripping.<ol><li>Integrare un sistema di controllo del pH con un set point di pH 9 con il serbatoio della soluzione di stripping (Figura 1F). Utilizzare 5 M NaOH come soluzione base con il regolatore di pH per contrastare gli MCFA raccolti.</li>
		<li>Inserire la sonda di pH attraverso la porta del serbatoio della soluzione di strippaggio e sospenderla nella soluzione di stripping. NOTA: Questo sistema di controllo del pH non richiede una soluzione acida.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare le porte di connessione del bioreattore.<ol><li>Designare due porte, una porta di uscita e una porta di ritorno, sul bioreattore per il collegamento con il sistema di estrazione liquido-liquido (LLE) (Figura 1G, H).</li>
		<li>Collegare un tubo pescante alla porta di uscita. Il brodo ricco di MCFA verrà pompato dal bioreattore alla porta di uscita nel sistema LLE. NOTA: Il brodo entra prima nel filtro a membrana a fibra cava prima delle membrane di estrazione per rimuovere le cellule e altri solidi per evitare incrostazioni.</li>
		<li>Inserire un raccordo a T sulla porta di ritorno per ricevere: (1) brodo impoverito MCFA riciclato dal FEM e (2) retentato contenente cellule dal filtro a membrana a fibra cava.</li>
	</ol></li>
	<li>Installare il filtro a membrana a fibra cava.<ol><li>Posizionare un azionamento della pompa a velocità variabile da 300 giri/min adiacente al bioreattore (Figura 1I).</li>
		<li>Fissare la membrana idrofila a fibra cava (Figura 1J) a un supporto ad anello sopra la pompa peristaltica.</li>
		<li>Impilare due teste della pompa peristaltiche sull'azionamento della pompa, grandi (ad es. taglia 17) e piccole (ad es. taglia 16). NOTA: La testa della pompa più grande è collegata al filtro a membrana a fibra cava per garantire che la portata del permeato sia maggiore della portata che alimenta il FEM. Se così non fosse, il permeato verrebbe consumato più velocemente di quanto viene prodotto, provocando la formazione di un vuoto.</li>
		<li>Collegare la porta di uscita del bioreattore all'ingresso della testa della pompa grande utilizzando un tubo flessibile della pompa (ad es. taglia 17).</li>
		<li>Collegare l'uscita della testa della pompa grande al filtro a membrana idrofila a fibra cava all'ingresso del tubo lato tubo alla base del filtro utilizzando un tubo flessibile della pompa (ad es. taglia 17).</li>
		<li>Tappare la porta superiore del filtro sul lato del guscio per impedire l'afflusso d'aria. NOTA: Il brodo ricco di MCFA (contenente cellule) scorrerà attraverso i tubi a fibra cava e tornerà al bioreattore. Il brodo limpido (privo di cellule) passerà attraverso la membrana idrofila in polietersulfone (PES) da 0,2 μm e si raccoglierà sul lato del guscio del filtro.</li>
	</ol></li>
	<li>Collegare il FEM.<ol><li>Fissare il primo modulo a membrana idrofobica a fibra cava (FEM) a un supporto ad anello sopra la pompa (Figura 1B).</li>
		<li>Collegare il filtro a membrana idrofila a fibra cava (Figura 1J) all'uscita lato mantello all'ingresso della testa della pompa piccola utilizzando un tubo flessibile della pompa (ad es. dimensioni 16, 18).</li>
		<li>Collegare l'uscita della piccola testa della pompa al FEM all'ingresso lato tubo alla base del modulo utilizzando un tubo flessibile della pompa (ad es. taglia 16, 18).</li>
		<li>Collegare il manometro (Figura 1K) e la valvola limitatrice di flusso (Figura 1L) all'uscita lato tubo del FEM utilizzando un raccordo di accoppiamento e un raccordo a T.</li>
		<li>Collegare l'uscita lato tubo del FEM alla porta di ritorno del bioreattore utilizzando un tubo flessibile della pompa (ad es. taglia 18). NOTA: Questo componente del sistema trasferisce gli MCFA dal brodo di fermentazione limpido alla soluzione di estrazione e quindi restituisce il brodo limpido al bioreattore.</li>
	</ol></li>
	<li>Collegare il BEM.<ol><li>Posizionare un azionamento della pompa a velocità variabile da 300 giri/min dotato di una testa della pompa peristaltica (ad es. taglia 16) adiacente al bioreattore (Figura 1M).</li>
		<li>Fissare il secondo modulo a membrana idrofobica a fibra cava a un supporto ad anello sopra la pompa peristaltica (Figura 1C).</li>
		<li>Collegare la porta di uscita del serbatoio della soluzione di strippaggio all'ingresso della pompa peristaltica e l'uscita della pompa all'ingresso lato tubo alla base del BEM utilizzando un tubo flessibile della pompa (ad es. taglia 16, 18).</li>
		<li>Collegare il manometro e la valvola limitatrice di flusso all'uscita lato tubo del BEM utilizzando un raccordo di accoppiamento e un raccordo a T.</li>
		<li>Collegare l'uscita lato tubo nella parte superiore del BEM alla porta di ritorno del serbatoio della soluzione di strippaggio utilizzando un tubo flessibile della pompa (ad es. taglia 16, 18). NOTA: Questo componente del sistema trasferisce gli MCFA dalla soluzione di estrazione alla soluzione di strippaggio nel BEM e quindi restituisce la soluzione di strippaggio al suo serbatoio.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Avvio del funzionamento del sistema di estrazione liquido-liquido
<ol><li>Adescare e far circolare le linee di fase acquosa.<ol><li>Accendere la pompa peristaltica/BEM della soluzione di strippaggio (Figura 1M) e impostare la velocità della pompa per ottenere una portata costante tra 25-250 mL·min-1. Il BEM può ospitare una gamma relativamente ampia di portate. Iniziare inizialmente con una portata prudentemente elevata per garantire un'estrazione sufficiente dell'MCFA. La portata può essere ridotta in modo incrementale in un secondo momento durante il funzionamento per prolungare la durata dell'attrezzatura della pompa e dei tubi. NOTA: La velocità del flusso non deve essere così bassa da consentire un accumulo di MCFA nel brodo del bioreattore (vedere Risultati rappresentativi).</li>
		<li>Chiudere lentamente la valvola a spillo all'uscita sul lato guscio del BEM (Figura 1C) per stabilire una contropressione di ~5 psig.</li>
		<li>Accendere il bioreattore/pompa peristaltica FEM (Figura 1I) e impostare la velocità della pompa per ottenere una portata costante tra 25-250 mL·min-1. Il FEM può ospitare una gamma relativamente ampia di portate. Iniziare inizialmente con una portata prudentemente elevata per garantire un'estrazione sufficiente dell'MCFA. La portata può essere ridotta in modo incrementale in un secondo momento durante il funzionamento per prolungare la durata dell'attrezzatura della pompa e dei tubi. NOTA: La velocità del flusso non deve essere così bassa da consentire un accumulo di MCFA nel brodo del bioreattore (vedere la sezione Risultati rappresentativi).</li>
		<li>Chiudere lentamente la valvola a spillo all'uscita del FEM sul lato del guscio (Figura 1B) per stabilire una contropressione di ~5 psig.</li>
		<li>Controllare visivamente le linee di ritorno per garantire un flusso costante e che le linee siano state adescate.</li>
		<li>Verificare che il brodo limpido sia raccolto all'interno del lato del guscio del filtro a membrana a fibra cava (Figura 1J). NOTA: Ci vorranno diverse ore per riempire il FEM e stabilire un flusso costante tra il filtro a membrana a fibra cava e il FEM. La velocità del flusso non deve essere così bassa da consentire un accumulo di MCFA nel brodo del bioreattore (vedere la sezione Risultati rappresentativi).</li>
	</ol></li>
	<li>Adescare e far circolare le linee di fase organiche.<ol><li>Accendere la pompa a membrana della soluzione di estrazione in fase organica (Figura 1D) e impostare la velocità della pompa per ottenere una portata costante tra 5,0-50 mL·min-1. Iniziare inizialmente con una portata conservativamente bassa per ridurre al minimo la pressione nell'estrazione in fase organica e ridurre al minimo il rischio di cross-over. Se necessario, la portata può essere aumentata in modo incrementale in un secondo momento durante il funzionamento per migliorare l'efficienza di estrazione</li>
		<li>Attendi che il FEM e il BEM siano pieni.</li>
		<li>Controllare visivamente la porta di ritorno sul serbatoio della soluzione di estrazione per garantire un flusso costante.</li>
		<li>Verificare che nessuna soluzione in fase organica attraversi le linee della soluzione di strippaggio o del brodo di fermentazione. Se si verifica un cross-over, si possono vedere piccole goccioline della fase organica. In tal caso, diminuire la velocità della pompa a membrana e aumentare leggermente la contropressione al FEM o al BEM, a seconda dei casi. Non superare i 10 psig. NOTA: Per evitare l'incrocio della membrana, è importante stabilire il flusso e la contropressione all'interno delle linee di fase acquosa prima di adescare le linee di fase organica.</li>
	</ol></li>
	<li>Estrarre continuamente gli MCFA dal bioreattore.<ol><li>Il sistema LLE dovrebbe essere completamente operativo. Consentire al sistema di funzionare continuamente durante il funzionamento del bioreattore.</li>
		<li>Misurare quotidianamente le concentrazioni di MCFA nel bioreattore per garantire un'estrazione sufficiente di MCFA. Se si verificano concentrazioni elevate di MCFA nel bioreattore, ciò di solito indica velocità di flusso insufficienti del brodo di fermentazione attraverso il FEM. Può anche indicare una diminuzione del flusso della membrana a causa di incrostazioni e necessità di manutenzione (vedere passaggio 2.6). NOTA: Le concentrazioni di SCFA e MCFA possono essere misurate tramite gascromatografia secondo il metodo descritto da Ge et al.11.</li>
	</ol></li>
	<li>Monitorare l'accumulo di MCFA nel serbatoio della soluzione di stripping.<ol><li>Misurare quotidianamente la concentrazione di MCFA all'interno della soluzione di strippaggio durante il ciclo batch. Il sistema LLE trasferisce continuamente gli MFCA dal bioreattore alla soluzione di stripping, aumentando la concentrazione di MCFA nel tempo. Il processo può essere eseguito per periodi prolungati per produrre titoli MCFA elevati. Il tasso di produzione volumetrica degli MCFA (mM C·L-1·d-1) può essere stimato utilizzando l'equazione 111. NOTA: Tasso di produzione volumetrico = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66956/66956eq01.jpg" style="margin: auto;"> (Eq. 1) dove: Cb,n= concentrazione di MCFA nel brodo di fermentazione il giorno n, mM C Cs,n= concentrazione di MCFA nella soluzione di strippaggio il giorno n, mM C Cs,n-1= concentrazione di MCFA nella soluzione di strippaggio il giorno n-1, mM C Vs,n= Volume della soluzione di strippaggio il giorno n, L Vb,n= Volume di brodo di fermentazione (volume del bioreattore) il giorno n, L HRTn= Tempo di ritenzione idraulica del bioreattore il giorno n, d Tn= Giorno n, d Tn-1= Giorno n-1, d</li>
		<li>Per garantire un funzionamento stabile, calcolare periodicamente la velocità di estrazione (mM C·d-1) del sistema LLE misurando la variazione della concentrazione di MCFA tra i punti temporali di misurazione e applicando l'equazione 211. NOTA: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66956/66956eq02.jpg" style="margin: auto;"> (Eq. 2) dove: Cs,n= concentrazione di MCFA nella soluzione di strippaggio il giorno n, mM C Cs,n-1= concentrazione di MCFA nella soluzione di strippaggio il giorno n-1, mM C Vs,n= Volume della soluzione di strippaggio il giorno n, L Tn= Giorno n, d Tn-1= Giorno n-1, d</li>
		<li>Per mantenere un'adeguata velocità di trasferimento dalla soluzione di estrazione, sostituire la soluzione di strippaggio con un nuovo lotto prima che la concentrazione di MCFA raggiunga l'80% di saturazione. NOTA: La solubilità massima dell'acido n-caproico è di 10,3 g· L-1 a 25 °C e quello dell'acido n-caprilico è 0,67 g· L-1 a 25 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Sostituire la soluzione di stripping.<ol><li>Spegnere la pompa a membrana (Figura 1D).</li>
		<li>Spegnere la pompa peristaltica della soluzione di strippaggio (Figura 1M).</li>
		<li>Utilizzare il tubo clamps per clamp l'ingresso lato tubo e l'uscita lato tubo del BEM.</li>
		<li>Spegnere il sistema di controllo del pH e rimuovere il tappo del serbatoio della soluzione di strippaggio mantenendo i collegamenti delle porte attaccati (se possibile).</li>
		<li>Rimuovere il serbatoio della soluzione di strippaggio (Figura 1E).</li>
		<li>Sostituire il serbatoio della soluzione di strippaggio con un nuovo lotto di soluzione acquosa di acido borico 0,5 M regolata a pH 9 utilizzando NaOH (vedere il passaggio 1.4). Riattaccare il tappo al serbatoio.</li>
		<li>Rimuovere il tubo clamps dall'ingresso lato tubo e dall'uscita lato tubo del BEM.</li>
		<li>Accendere la pompa peristaltica della soluzione di strippaggio (Figura 1M), seguita dalla pompa a membrana (Figura 1D). Il funzionamento del sistema è ora ripristinato.</li>
	</ol></li>
	<li>Manutenzione della membrana.<ol><li>Rimuovere il FEM e il BEM dal sistema LLE una volta ogni tre mesi per la pulizia. Tre mesi è una frequenza di pulizia stimata in modo prudente. NOTA: A seconda dell'applicazione, gli utenti possono pulire le membrane più o meno frequentemente. I segni di una diminuzione delle prestazioni della membrana sono descritti nella sezione Risultati rappresentativi. Durante la manutenzione, le pompe e il regolatore di pH devono essere spenti. Le istruzioni per la pulizia devono essere fornite dal produttore della membrana.</li>
		<li>Drenare i liquidi dal sistema LLE in contenitori separati, iniziando con le linee di soluzione di estrazione in fase organica, seguite dalle linee di brodo di fermentazione e dalle linee di soluzione di stripping.</li>
		<li>Una volta pulite e reinstallate le membrane, rimettere i liquidi nei rispettivi serbatoi.</li>
		<li>Riavviare il sistema LLE utilizzando l'approccio descritto sopra (vedere i passaggi 2.1-2.2).</li>
	</ol></li>
</ol>

Produzione sostenibile di MCFA tramite allungamento della catena ed estrazione liquido-liquido

<ol>
	<li>Palomo-Briones, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-neutral+ph+increased+n-caprylate+production+in+a+microbiome+with+product+inhibition+of+methanogenesis.">Near-neutral ph increased n-caprylate production in a microbiome with product inhibition of methanogenesis.</a> Chem Eng J. 446, 137170 (2022).</li><li>Wang, J., Yin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+production+of+medium-chain+carboxylates+through+chain+elongation:+An+overview.">Biological production of medium-chain carboxylates through chain elongation: An overview.</a> Biotechnol Adv. 55, 107882 (2022).</li><li>Watanabe, S., Tsujino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+medium-chain+triglycerides+in+foods.">Applications of medium-chain triglycerides in foods.</a> Front Nutr. 9, 802805 (2022).</li><li>Meijaard, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+environmental+impacts+of+palm+oil+in+context.">The environmental impacts of palm oil in context.</a> Nat Plants. 6 (12), 1418-1426 (2020).</li><li>Meijaard, E., Abrams, J. F., Juffe-Bignoli, D., Voigt, M., Sheil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coconut+oil,+conservation+and+the+conscientious+consumer.">Coconut oil, conservation and the conscientious consumer.</a> Curr Bio. 30 (13), R757-R758 (2020).</li><li>Angenent, L. T., Magdalena, J. A., Jeon, B. S., Usack, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eco-mimicry+opens+new+doors+for+bioprocess+engineers.">Eco-mimicry opens new doors for bioprocess engineers.</a> Joule. 4 (10), 2074-2077 (2020).</li><li>Shahab, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+heterogeneous+microbial+consortium+producing+short-chain+fatty+acids+from+lignocellulose.">A heterogeneous microbial consortium producing short-chain fatty acids from lignocellulose.</a> Science. 369 (6507), eabb1214 (2020).</li><li>Magdalena, J. A., Angenent, L. T., Usack, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+measurement,+application,+and+effect+of+oxygen+in+microbial+fermentations:+Focusing+on+methane+and+carboxylate+production.">The measurement, application, and effect of oxygen in microbial fermentations: Focusing on methane and carboxylate production.</a> Fermentation. 8 (4), 138 (2022).</li><li>Agler, M. T., Spirito, C. M., Usack, J. G., Werner, J. J., Angenent, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+highly+specific+and+productive+process+for+n-caproic+acid+production:+Applying+lessons+from+methanogenic+microbiomes.">Development of a highly specific and productive process for n-caproic acid production: Applying lessons from methanogenic microbiomes.</a> Water Sci Technol. 69 (1), 62-68 (2013).</li><li>Gildemyn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upgrading+syngas+fermentation+effluent+using+Clostridium+kluyveri+in+a+continuous+fermentation.">Upgrading syngas fermentation effluent using Clostridium kluyveri in a continuous fermentation.</a> Biotechnol Biofuels. 10 (1), 83 (2017).</li><li>Ge, S., Usack, J. G., Spirito, C. M., Angenent, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+n-caproic+acid+production+from+yeast-fermentation+beer+in+an+anaerobic+bioreactor+with+continuous+product+extraction.">Long-term n-caproic acid production from yeast-fermentation beer in an anaerobic bioreactor with continuous product extraction.</a> Env Sci Technol. 49 (13), 8012-8021 (2015).</li><li>Saboe, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+recovery+of+bio-based+carboxylic+acids.">In situ recovery of bio-based carboxylic acids.</a> Green Chem. 20 (8), 1791-1804 (2018).</li><li>Kaur, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+extraction+for+in-situ+carboxylate+recovery+from+mixed+culture+fermentation.">Reactive extraction for in-situ carboxylate recovery from mixed culture fermentation.</a> Biochem Eng J. 160, 107641 (2020).</li><li>Carvajal-Arroyo, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+extraction+of+medium-chain+carboxylic+acids+at+a+semi-pilot+scale.">Production and extraction of medium-chain carboxylic acids at a semi-pilot scale.</a> Chem Eng J. 416, 127886 (2021).</li><li>Choi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+biphasic+extractive+fermentation+for+hexanoic+acid+production+from+sucrose+by+Megasphaera+elsdenii+NCIMB+702410.">In situ biphasic extractive fermentation for hexanoic acid production from sucrose by Megasphaera elsdenii NCIMB 702410.</a> Appl Biochem Biotechnol. 171 (5), 1094-1107 (2013).</li><li>Grootscholten, T., Steinbusch, K., Hamelers, H., Buisman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+medium+chain+fatty+acid+productivity+using+chain+elongation+by+reducing+the+hydraulic+retention+time+in+an+upflow+anaerobic+filter.">Improving medium chain fatty acid productivity using chain elongation by reducing the hydraulic retention time in an upflow anaerobic filter.</a> Bioresour Technol. 136, 735-738 (2013).</li><li>Grootscholten, T., Dal Borgo, F. K., Hamelers, H., Buisman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+chain+elongation+in+mixed+culture+acidification+reactors+by+addition+of+ethanol.">Promoting chain elongation in mixed culture acidification reactors by addition of ethanol.</a> Biomass Bioenergy. 48, 10-16 (2013).</li><li>Cermak, S. C., Evangelista, R. L., Kenar, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distillation+of+natural+fatty+acids+and+their+chemical+derivatives.">Distillation of natural fatty acids and their chemical derivatives.</a> Distillation-Advances from Modeling to Applications Chapter. 5, 109-142 (2012).</li><li>Agler, M. T., Spirito, C. M., Usack, J. G., Werner, J. J., Angenent, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chain+elongation+with+reactor+microbiomes:+Upgrading+dilute+ethanol+to+medium-chain+carboxylates.">Chain elongation with reactor microbiomes: Upgrading dilute ethanol to medium-chain carboxylates.</a> Energy Environ Sci. 5 (8), 8189-8192 (2012).</li></ol>

Non vi è alcun conflitto di interessi.

Gli MCFA prodotti biologicamente si trovano comunemente in miscele insieme a vari composti organici, tra cui SCFA e alcoli2. Di conseguenza, è necessario un processo di separazione selettiva per recuperarli e utilizzarli in modo efficace. Il sistema LLE qui sviluppato estrae selettivamente gli MCFA da queste miscele in modo continuo, conservando SCFA e alcoli. Questa funzionalità rende il sistema LLE particolarmente adatto per applicazioni di fermentazione, come l'allungamento della catena microbica, dove MCFA, SCFA e alcoli costituiscono i metaboliti primari8. In particolare, il sistema LLE consente al processo di allungamento della catena di procedere rimuovendo gli MCFA, impedendo l'inibizione del prodotto1, lasciando gli SCFA e i reagenti alcolici nel brodo di fermentazione per la successiva conversione biologica. Il sistema LLE può essere personalizzato per altre applicazioni modificando la specifica soluzione di estrazione. Ad esempio, l'estrazione continua degli SCFA prodotti durante la fermentazione potrebbe essere ottenuta utilizzando lo stesso sistema LLE rimuovendo il TOPO dalla miscela di soluzione di estrattore.
Pertanto, l'importanza del metodo LLE risiede nel fornire una tecnica di estrazione MCFA più robusta per queste applicazioni di bioprocesso e biotecnologia rispetto ad altri metodi. L'estrazione bifasica in situ con liquidi non miscibili è un altro approccio all'estrazione di MCFA dal brodo di fermentazione15. Tuttavia, questo approccio è relativamente inefficiente. Tra la fase acquosa (cioè il brodo di fermentazione) e la fase organica si formano strati di emulsione, limitando fortemente le velocità di trasferimento di massa. La minima miscelazione del fluido interfacciale tra gli strati di fase limita anche il trasferimento di massa. Un altro svantaggio è che le cellule microbiche sono a diretto contatto con la fase organica, causando trascinamento, inibizione e morte cellulare15. Infine, l'estrazione bifasica in situ richiede una manutenzione frequente per rimuovere e sostituire la fase organica.
L'applicazione di alti tassi di diluizione all'interno del bioreattore è un altro metodo per evitare l'inibizione del prodotto16. Alti tassi di diluizione possono raggiungere un'elevata produttività mantenendo alte concentrazioni di reagenti nel bioreattore. Tuttavia, questo approccio è svantaggioso perché contribuisce al dilavamento della biomassa, alla generazione di grandi volumi di effluenti e alle elevate perdite di substrato (ad esempio, SCFA e alcoli), con conseguenti basse rese. Questi svantaggi possono essere mitigati utilizzando la biomassa immobilizzata e il riciclaggio degli effluenti, ma questi interventi si aggiungono alla complessità del sistema17. Infine, la concentrazione di MCFA nel flusso di prodotti è diluita, rendendo l'MCFA inefficiente e costoso.
Un nuovo approccio di estrazione potrebbe comportare la distillazione continua degli MCFA con un'unica membrana di estrazione diretta che separa fisicamente la fase organica e quella acquosa, trattenendo e proteggendo così la biomassa microbica. Gli MCFA verrebbero estratti selettivamente nella fase organica e quindi distillati. Il raffinato potrebbe essere continuamente riciclato nella membrana di estrazione. La distillazione continua, tuttavia, è tecnicamente impegnativa, soprattutto in laboratorio, e può causare il deterioramento o la perdita dell'estrattore chimico durante il funzionamento a lungo termine. La distillazione può anche causare la degradazione termica della fase organica e dei prodotti MCFA18.
Il processo LLE evita molti degli svantaggi associati a questi approcci alternativi incorporando diverse caratteristiche critiche e fasi di elaborazione. In primo luogo, il filtro a membrana idrofila a fibra cava ha il duplice scopo di proteggere le cellule della biomassa (i biocatalizzatori) dall'esposizione alla soluzione estrattore nel FEB, fornendo al contempo un filtrato chiaro ricco di MCFA che riduce le incrostazioni e l'accumulo di solidi nel sistema LLE. In secondo luogo, per evitare il cross-over del liquido, abbiamo incorporato valvole a spillo per creare una contropressione sul lato del tubo di ciascun contattore a membrana. Questa precauzione mantiene un leggero gradiente di pressione transmembrana, impedendo la fuoriuscita indesiderata del solvente organico idrofobo dal lato del guscio al lato acquoso del tubo nel FEM e nel BEM. Inoltre, i flussi di liquido sono configurati per fluire in parallelo dalla base alla sommità del FEM e del BEM per evitare l'intrappolamento di bolle di gas che potrebbero accumularsi all'interno dei moduli a membrana, riducendo l'efficienza di trasferimento e causando il carry-over. Inoltre, questo metodo utilizza una pompa a membrana con una testa pompante in PTFE chimicamente resistente per pompare la soluzione estrattore corrosiva contenente MCFA, salvaguardando il sistema dalla corrosione e dai guasti che potrebbero compromettere il processo di estrazione. Infine, la soluzione di stripping alcalino a pH controllato mantiene un gradiente di pH che consente il trasferimento continuo di MCFA attraverso il sistema LLE ad alte velocità dal bioreattore al serbatoio della soluzione di stripping, dove gli MCFA si deprotonano e si accumulano ad alti titoli, facilitando il recupero del prodotto a valle.
Questo metodo LLE è appropriato per l'estrazione continua di MCFA da bioreattori su scala di laboratorio (fino a un volume di lavoro di 6 L) ed è stato convalidato per il funzionamento a lungo termine in diversi studi 1,9,11,19. Il metodo LLE può essere applicato anche per applicazioni su larga scala14 (ad esempio, bioreattori su scala pilota), ma richiede membrane e apparecchiature per la movimentazione dei fluidi su scala proporzionale. Tuttavia, il metodo presenta alcune limitazioni, principalmente nell'area della manutenzione e della complessità del sistema. Poiché il processo è progettato per funzionare in modo continuo, i moduli a membrana e le pompe devono essere sottoposti a manutenzione frequentemente, con conseguenti notevoli tempi di fermo. Un altro svantaggio è che la soluzione di strippaggio richiede quantità relativamente grandi di NaOH e acido borico. Inoltre, gli MCFA sono corrosivi e causano il deterioramento di alcuni componenti del sistema LLE nel tempo. Ad esempio, i connettori in plastica e l'alloggiamento della membrana possono diventare fragili, richiedendo la sostituzione durante il funzionamento. Infine, la rete di movimentazione dei fluidi nel sistema LLE è complessa e coinvolge molti punti di connessione che possono sviluppare perdite. La maggior parte di queste limitazioni e inconvenienti, tuttavia, sono tipici dei processi di separazione continua a membrana e dovrebbero essere previsti.
Nel complesso, questo protocollo LLE offre un approccio robusto ed efficiente per l'estrazione selettiva di MCFA, che ha implicazioni per l'avanzamento della ricerca in diversi campi. Il metodo potrebbe trovare molte applicazioni rilevanti nel campo della fermentazione di precisione per il recupero in situ di prodotti metaboliti extracellulari durante la fermentazione. L'LLE potrebbe essere un'alternativa a basso costo agli approcci convenzionali di lavorazione a valle (DSP), come la centrifugazione post-corsa, la micro e ultrafiltrazione o le estrazioni con solvente eseguite in lotti. In effetti, la DSP rappresenta spesso un importante fattore di costo nei processi di fermentazione industriale. L'estrazione continua del prodotto mediante LLE può anche consentire fermentazioni continue, migliorando notevolmente la produttività delle operazioni e l'efficienza in termini di esecuzione rispetto agli approcci batch convenzionali o alimentati. Inoltre, la ricerca futura potrebbe studiare mezzi di estrazione diversi dai solventi organici, come i solventi eutettici profondi o i liquidi ionici. Infine, il sistema LLE descritto in questo protocollo era destinato a scopi sperimentali in un ambiente di laboratorio; Pertanto, c'è ancora un notevole spazio per studi di ottimizzazione per ridurre il fabbisogno energetico, l'area della membrana e le rese e i tassi di estrazione complessivi.

Gli acidi grassi a catena media (MCFA) sono sostanze chimiche di alto valore che comprendono lunghezze di catena che vanno da sei (C6) a dodici (C12) atomi di carbonio. Gli MCFA hanno applicazioni industriali negli alimenti, nei mangimi per animali, nei prodotti farmaceutici, nei cosmetici, nelle fragranze, negli agenti antimicrobici e nella sintesi chimica 1,2,3. Attualmente, la maggior parte degli MCFA deriva da olio di palma e di cocco proveniente dal sud-est asiatico e dal Sud America 4,5. Il grave danno ecologico associato alla produzione di olio di palma e di cocco è ben riconosciuto dalle parti interessate e dal pubblico in generale. I ricercatori stanno esplorando approcci biologici (ad esempio, fermentazioni di precisione e in coltura aperta) per generare MCFA in modo più sostenibile utilizzando substrati di basso valore o rifiuti organici come materia prima 6,7. Un modo sostenibile per produrre MCFA è l'upcycling dei flussi di rifiuti organici utilizzando un processo chiamato allungamento della catena microbica (CE). Questo bioprocesso di fermentazione secondaria è simile alla digestione anaerobica in quanto sfrutta la versatilità dei microbiomi anaerobici a coltura aperta, ma invece di promuovere la formazione di metano, i sistemi CE sopprimono deliberatamente la via metanogenica. In un microbioma in cui il carbonio non può essere ridotto al massimo a CH4, né l'H2 mantenuto al di sotto di 10-4 atm dagli archaea che consumano idrogeno, la reazione di ossidazione β che normalmente scomporrebbe i carbossilati a catena più lunghi in acetato (ad esempio, C6 → C4 → C2) può essere invertita (ad esempio, C2 → C4 → C6, ecc.), purché un composto ridotto (ad esempio, donatore di elettroni) come etanolo o lattato8. In questo metabolismo, la molecola di acido grasso che subisce l'allungamento funge da accettore di elettroni. Pertanto, invece di generare un prodotto con una lunghezza di carbonio di uno (CH4) come nella digestione anaerobica, il processo CE genera MCFA con lunghezze di carbonio comprese tra sei e otto. Un mercato ampio e in crescita è pronto a ricevere queste piattaforme chimiche ecologiche. Tuttavia, finora, il processo CE non ha dimostrato di produrre MCFA con lunghezze di carbonio superiori a otto atomi di carbonio a tassi apprezzabili.
L'estrazione efficiente di questi MCFA è importante non solo per il recupero del prodotto desiderato, ma anche per prevenire l'inibizione del prodotto e spingere il microbioma verso la produzione di più MCFA1. All'aumentare della concentrazione di MCFA, il metabolismo dell'MCFA viene inibito e diventa meno termodinamicamente favorevole. Rimuovendo continuamente gli MCFA, i tassi di produzione vengono mantenuti. Inoltre, poiché gli SCFA fungono da sottostrutture per il processo di allungamento della catena, non devono essere rimossi dal brodo di fermentazione. Le miscele di estratti mirate dovrebbero estrarre selettivamente i prodotti MCFA dai brodi di fermentazione contenenti SCFA.
In questo caso, viene dimostrato un approccio robusto e pratico per estrarre continuamente MCFA dal brodo di fermentazione contenente SCFA utilizzando un sistema di estrazione liquido-liquido (LLE) comprendente un estrattore idrofobo a membrana a fibra cava in polipropilene, una soluzione di estratto organico selettivo (ossido di triottilfosfina [TOPO]9,10,11) e un estrattore a membrana a fibra cava all'indietro. A monte del sistema LLE è installato un filtro di protezione delle celle per trattenere la biomassa e mitigare le incrostazioni della membrana. Gli MCFA vengono estratti in avanti, nella loro forma protonata, dal brodo di fermentazione acquoso (tipicamente con un set point di pH <5,8) in una soluzione di estratto organico (cioè 3% TOPO (p/v) in olio minerale) e quindi estratti all'indietro in una soluzione di stripping alcalino (pH = 9), dove depronano e si concentrano a titoli elevati per la lavorazione a valle. I particolari set point di pH sono essenziali perché determinano il gradiente di concentrazione tra ogni fase del processo LLE, garantendo un trasferimento netto di MCFA dal brodo di fermentazione alla soluzione di stripping. LLE che utilizza membrane di estrazione in avanti e all'indietro raggiunge alti tassi di estrazione riducendo al minimo la co-estrazione di alcoli e SCFA. L'adiuvante a solvente organico, TOPO, consente la formazione di complessi MCFA. Questi complessi sono più solubili nelle fasi organiche rispetto all'acqua, con conseguente elevata selettività MCFA. Il processo LLE evita anche i numerosi svantaggi associati agli approcci esistenti, che saranno discussi nella sezione Discussione. L'implementazione a lungo termine utilizzando questo approccio LLE è stata dimostrata in diversi studi 9,10,11. Sebbene questo approccio sia particolarmente adatto per applicazioni che coinvolgono la produzione di MCFA tramite l'allungamento della catena microbica, è utile anche in altre applicazioni che richiedono la separazione selettiva di composti con proprietà chimiche simili perché il sistema di estrazione organica può essere personalizzato.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 L Media Bottle</td>
			<td>Duran</td>
			<td>218018658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 L Media Bottle</td>
			<td>Duran</td>
			<td>218016957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid, 99.5%,&#160;</td>
			<td>ThermoScientific (Fisher Scientific)</td>
			<td>327132500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophilic MINIKROS 20CM 0.2UM PES 1MM 1.5TC X 3/4TC</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>N02-P20U-10-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L/S Variable-Speed Pump Drive; 100 rpm</td>
			<td>MasterFlex (VWR)</td>
			<td>MFLX07528-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L/S Variable-Speed Pump Drive; 300 rpm</td>
			<td>MasterFlex (VWR)</td>
			<td>MFLX07528-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Mineral Oil, NF (4 Liters) (CAS: 8042-47-5)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C761Z18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liqui-Cel 2.5x8 X50 membrane CO2, PP Housing Viton O-rings (0.5-3 gpm (0.1-0.7 m3/h)), 1/4-in FNPT connections</td>
			<td>3M</td>
			<td>LC-02508X50-G453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer, 20 L Capacity, 110 V</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-04661-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Tygon, Size 14</td>
			<td>MasterFlex (VWR)</td>
			<td>MFLX06402-14</td>
			<td>Specific tubing size will depend on application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Tygon, Size 16</td>
			<td>MasterFlex (VWR)</td>
			<td>MFLX06402-16</td>
			<td>Specific tubing size will depend on application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Tygon, Size 17</td>
			<td>MasterFlex (VWR)</td>
			<td>MFLX06402-17</td>
			<td>Specific tubing size will depend on application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Tygon, Size 18</td>
			<td>MasterFlex (VWR)</td>
			<td>MFLX06402-18</td>
			<td>Specific tubing size will depend on application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterFlex L/S Standard Pump Head for Precision Tubing L/S 14, Polycarbonate Housing, CRS Rotor</td>
			<td>MasterFlex (VWR)</td>
			<td>MFLX07014-20</td>
			<td>Specific pump head size will depend on application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterFlex L/S Standard Pump Head for Precision Tubing L/S 14, Polycarbonate Housing, CRS Rotor</td>
			<td>MasterFlex (VWR)</td>
			<td>MFLX07014-20</td>
			<td>Specific pump head size will depend on application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterFlex L/S Standard Pump Head for Precision Tubing L/S 16, Polycarbonate Housing, CRS Rotor</td>
			<td>MasterFlex (VWR)</td>
			<td>MFLX07016-20</td>
			<td>Specific pump head size will depend on application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterFlex L/S Standard Pump Head for Precision Tubing L/S 17, Polycarbonate Housing, CRS Rotor</td>
			<td>MasterFlex (VWR)</td>
			<td>MFLX07017-20</td>
			<td>Specific pump head size will depend on application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterFlex L/S Standard Pump Head for Precision Tubing L/S 18, Polycarbonate Housing, CRS Rotor</td>
			<td>MasterFlex (VWR)</td>
			<td>MFLX07018-20</td>
			<td>Specific pump head size will depend on application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterFlex PTFE-diaphragm pump head, 10 to 100 mL/min</td>
			<td>MasterFlex (VWR)</td>
			<td>MFLX07090-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oakton 220 pH/ORP/Temperature Controller, 1/8 DIN</td>
			<td>Spectrum Laboratory Products</td>
			<td>664-12595-E1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oakton 220 pH/ORP/Temperature Controller, 1/8 DIN</td>
			<td>Spectrum Laboratory Products</td>
			<td>664-12595-E1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oakton Female BNC-to-Stripped Wire Adapter</td>
			<td>Spectrum Laboratory Products</td>
			<td>664-12592-E1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Probe with BNC Connector</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>10010-788</td>
			<td>Any pH probe with a BNC connector will suffice.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Flow-Adjustment Valve, White Polypropylene, 1/4 NPT Male x Male</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>7792K57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProConnex&#160; Fittings Kits - A</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>ACPX-KT2-01N</td>
			<td>Compatible with Hydrophilic MINIKROS Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProConnex Fittings Kits - B</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>ACPX-KT1-01N</td>
			<td>Compatible with Hydrophilic MINIKROS Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide Pellets for Analysis</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1.06498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless-Steel Pressure Gauge 0-60 psi Stainless Steel 1/4&#34; NPT 2.5&#34; Face Dial</td>
			<td>NA</td>
			<td>XJ-219</td>
			<td>Any comparable pressure gauge covering 0-60 psig range will suffice.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trioctylphosphine oxide (TOPO)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>346187-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

continuous liquid-liquid extraction of medium-chain fatty acids from fermentation broth using hollow-fiber membranes

Gli acidi grassi a catena media (MCFA; lunghezze di carbonio: C6-C12) sono sostanze chimiche di alto valore che servono una varietà di applicazioni industriali, tra cui antimicrobici verdi, ingredienti alimentari, additivi per mangimi animali, cosmetici, profumi, prodotti farmaceutici e lipidi strutturati. Attualmente, la maggior parte degli MCFA sono prodotti da olio di palma e di cocco originario del sud-est asiatico e del Sud America. L'approccio convenzionale alla raccolta dei frutti di palma e cocco provoca notevoli danni ecologici in queste regioni. Pertanto, i ricercatori stanno sviluppando approcci biologici (ad esempio, fermentazioni di precisione e in coltura aperta) per generare MCFA in modo più sostenibile utilizzando substrati di basso valore (ad esempio, metanolo, etanolo, lattato) o rifiuti organici come materia prima. L'allungamento della catena microbica (CE) è una piattaforma di fermentazione a coltura aperta a rapida maturazione che converte gli acidi grassi a catena corta (SCFA; lunghezze di carbonio: C1-C5) in un sottoinsieme di questi MCFA a tassi rilevanti a livello industriale. Tuttavia, l'estrazione continua in situ dei prodotti MCFA è necessaria non solo per evitare l'inibizione del prodotto, ma anche per facilitare il recupero degli MCFA in forma pura e utilizzabile. L'estrazione liquido-liquido (LLE) utilizzando membrane a fibre cave e miscele di estratti mirate ha dimostrato un approccio robusto per estrarre selettivamente i prodotti MCFA da brodi di fermentazione contenenti SCFA. Qui, l'applicazione di LLE per la rimozione continua dell'MCFA è dimostrata utilizzando CE come sistema di fermentazione di riferimento e il 3% (p/v) di ossido di triottilfosfina in olio minerale come sistema estrattore. Gli acidi grassi che vanno dall'acido valerico (C5) all'acido caprilico (C8) vengono rimossi selettivamente dai brodi contenenti SCFA e concentrati ad alti titoli in una soluzione alcalina semi-batch per la lavorazione a valle.

Medium-chain fatty acids (MCFAs) are high-value building block chemicals comprising chain lengths ranging from six (C6) to twelve (C12) carbons. MCFAs have industrial applications in foods, animal feeds, pharmaceuticals, cosmetics, fragrances, antimicrobial agents, and chemical synthesis1,2,3. Currently, most MCFAs derive from palm and coconut oil sourced from Southeast Asia and South America4,5. The severe ecological damage associated with palm and coconut oil production is well-recognized by stakeholders and the general public. Researchers are exploring biological approaches (e.g., precision and open-culture fermentations) to generate MCFAs more sustainably using low-value substrates or organic wastes as feedstock6,7. One sustainable way to produce MCFAs is by upcycling organic waste streams using a process called microbial chain elongation (CE). This secondary fermentation bioprocess is similar to anaerobic digestion in that it exploits the versatility of anaerobic open-culture microbiomes, but instead of promoting methane formation, CE systems deliberately suppress the methanogenic pathway. In a microbiome where carbon cannot be maximally reduced to CH4, nor H2 maintained below 10-4 atm by hydrogen-consuming archaea, the &#946;-oxidation reaction that would normally break down longer chain carboxylates to acetate (e.g., C6 &#8594; C4 &#8594; C2) can be reversed (e.g., C2 &#8594; C4 &#8594; C6, etc.), so long as a reduced compound (i.e., electron donor) such as ethanol or lactate is supplied8. In this metabolism, the fatty acid molecule undergoing elongation serves as the electron acceptor. Thus, instead of generating a product with a carbon length of one (CH4) as in anaerobic digestion, the CE process generates MCFAs with carbon lengths ranging from six to eight. A large and growing market is ready to receive these green platform chemicals. However, thus far, the CE process has not been shown to produce MCFAs with carbon lengths exceeding eight carbons at appreciable rates.
Efficient extraction of these MCFAs is important not only for the recovery of the desired product but also to prevent product inhibition and push the microbiome toward producing more MCFAs1. As the concentration of MCFAs increases, MCFA metabolism is inhibited and becomes less thermodynamically favorable. By removing the MCFAs continuously, production rates are maintained. Also, because SCFAs serve as the substructures for the chain-elongation process, they should not be removed from the fermentation broth. Targeted extractant mixtures should selectively extract MCFA products from fermentation broths containing SCFAs.
Here, a robust and practical approach is demonstrated to continuously extract MCFAs from SCFA-containing fermentation broth using a liquid-liquid extraction (LLE) system comprising a hydrophobic, polypropylene forward hollow-fiber membrane extractor, a selective organic extractant solution (trioctylphosphine oxide [TOPO]9,10,11), and a backward hollow-fiber membrane extractor. A cell-guard filter upstream of the LLE system is installed to retain biomass and mitigate membrane fouling. The MCFAs are forward extracted, in their protonated form, from the aqueous fermentation broth (typically with a pH set point &#60;5.8) into an organic extractant solution (i.e., 3% TOPO (w/v) in mineral oil) and then backward extracted into an alkaline stripping solution (pH = 9), where they deprotonate and concentrate to high titers for downstream processing. The particular pH set points are essential because they dictate the concentration gradient between each phase of the LLE process, ensuring a net transfer of MCFAs from the fermentation broth to the stripping solution. LLE using forward and backward extraction membranes achieve high extraction rates while minimizing alcohols and SCFAs co-extraction. The organic solvent adjuvant, TOPO, enables the formation of MCFA complexes. These complexes are more soluble in organic phases than water, resulting in high MCFA selectivity. The LLE process also avoids the many disadvantages associated with existing approaches, which will be discussed in the Discussion section. Long-term implementation using this LLE approach has been demonstrated in multiple studies9,10,11. While this approach is particularly suitable for applications involving MCFA production via microbial chain elongation, it is also useful in other applications that require selective separation of compounds possessing similar chemical properties because the organic extractant system can be customized.

Autore in primo piano: Ottimizzazione delle membrane a fibra cava per l'estrazione continua liquido-liquido di acidi grassi a catena media

Estrazione continua liquido-liquido di acidi grassi a catena media dal brodo di fermentazione mediante membrane a fibra cava

My research aimed to evaluate the efficiency of hollow-fiber membrane and the continuous liquid-liquid extraction of medium-chain fatty acid from fermentation broth. I seek to understand how this membrane differs from traditional techniques by optimizing the extraction process and determination of the scalability of this method for industrial use. Current experimental challenge include inefficient extraction of medium-chain fatty acid from fermentation broth, which often lead to the inhibition of the chain-elongation microbes.Traditional techniques often face issues like batch-processing limitation, high energy consumption, and high solvent usage. Our protocol offers several advantages over traditional techniques. These include high selectivity and efficiency in extracting the medium-chain fatty acids from fermentation broths which leads to reduced solvent usage and continuous operation from batch processing.Additionally, this method can easily be replicated for diverse applications.

I risultati positivi dell'estrazione di MCFA sono indicati da un accumulo costante di prodotti MCFA nella soluzione di stripping in fase acquosa alcalina (Figura 2) e da concentrazioni relativamente stabili di MCFA nel brodo di fermentazione (dati non mostrati). La Figura 2 illustra tre cicli semi-batch della soluzione di strippaggio durante il funzionamento continuo LLE. Un ciclo comprende due fasi: la fase di sostituzione del lotto (Figura 2: Giorno 24, Giorno 46 e Giorno 68) e la fase di accumulo MCFA (Figura 2: Giorni 0-24, Giorni 25-46, Giorni 47-68). Per questo particolare sistema di fermentazione e LLE, la durata del ciclo è stata di circa 20-24 giorni. Tuttavia, la durata del ciclo varia da un'applicazione all'altra, poiché dipende da molteplici fattori, tra cui il volume del bioreattore, la produttività biologica, il volume della soluzione di stripping, l'area della membrana a fibra cava e le velocità di ricircolo dei liquidi all'interno del sistema LLE. Durante un ciclo batch, la soluzione di strippaggio può cambiare colore da limpido a bruno-giallastro a causa della co-estrazione di basso livello di vari piccoli acidi organici (ad es. acido umico, acidi fulvici) presenti nel brodo di fermentazione (Figura 3). Gli esiti negativi dell'estrazione di MCFA sono indicati da un lento accumulo di prodotti MCFA nella soluzione di stripping e da elevate concentrazioni di MCFA nel brodo di fermentazione rispetto alla linea di base prestabilita.
La produttività biologica del caproato è generalmente superiore a quella del caprilato durante questi processi di fermentazione; Pertanto, è comune che il caproato si accumuli a una velocità maggiore nella soluzione di strippaggio rispetto al caprilato. Inoltre, è normale che gli SCFA, come l'acetato e il butirrato, si raccolgano nella soluzione di strippaggio in quantità inferiori, come mostrato nella Figura 2. Il TOPO nell'olio minerale ha una maggiore affinità per gli MCFA rispetto agli SCFA, il che provoca la rimozione selettiva degli MCFA. Gli studi di Saboe et al.12, Kaur et al.13, Carvajal-Arroyo et al.14 e Ge et al.11, hanno dimostrato l'elevata selettività del Topo per gli acidi grassi in molteplici applicazioni che coinvolgono soluzioni acquose. Il rapporto di partizionamento tra MCFA e SCFA durante il secondo ciclo batch è mostrato nella Figura 4. Ci si può aspettare rapporti di partizionamento MCFA:SCFA superiori a 40:1 per diversi giorni in un ciclo batch. Il rapporto di partizionamento MCFA:SCFA si stabilizzerà man mano che il processo di estrazione si avvicina a uno stato pseudo-stazionario. Se non è possibile raggiungere un rapporto >40 dopo diversi giorni, ciò suggerisce che l'estrattore TOPO si è degradato o eluito. In tal caso, è necessario preparare una nuova soluzione di estrazione (vedere il passaggio 1.1). Se il rapporto diminuisce dopo la fase di plateau, ciò suggerisce che gli MCFA si sono accumulati oltre l'80% del loro punto di saturazione. In tal caso, è necessario preparare una nuova soluzione di strippaggio (vedere il passaggio 1.4)
Una bassa efficienza di estrazione MCFA può essere causata da portate insufficienti all'interno del sistema LLE. Nella Figura 5, la velocità di pompaggio è stata ridotta nella linea di circolazione del brodo di fermentazione e della soluzione di stripping per illustrare l'impatto della diminuzione dei tassi di ricircolo del liquido sull'efficienza di estrazione dell'MCFA. L'efficienza di estrazione è definita come la percentuale di MCFA estratta nella soluzione di stripping rispetto al totale degli MCFA prodotti dal bioreattore più gli MCFA estratti dal LLE. Ci si può aspettare un'efficienza di estrazione superiore all'85% durante il normale funzionamento (Figura 5, Giorno 1-14). Quando la velocità della pompa è bassa (Figura 5, Giorno 14), l'efficienza di estrazione diminuisce in risposta. Quando viene ripristinata una velocità adeguata della pompa, possono essere necessari diversi giorni prima che l'efficienza di estrazione si riprenda. Ciò potrebbe essere causato da una riduzione della concentrazione allo stato stazionario di MCFA nella soluzione di estrazione causata dal differenziale nelle velocità di estrazione della soluzione di strippaggio (superiore) rispetto al brodo di fermentazione (inferiore).
Diversi altri fattori possono contribuire a ridurre l'efficienza di estrazione, tra cui (1) incrostazioni sulla membrana, (2) flusso di fluido limitato in ogni fase del sistema LLE a causa di blocchi, (3) formazione di sacche di gas nei contattori a membrana e (4) consentire alle concentrazioni di MCFA nella soluzione di stripping di avvicinarsi ai loro punti di saturazione. L'incrostazione della membrana è indicata da una riduzione del flusso della membrana nel tempo rispetto alle condizioni iniziali. Sebbene la formazione di biofilm sia improbabile nel FEM, possono verificarsi incrostazioni a causa dell'accumulo di detriti cellulari e altri solidi sospesi. Inoltre, mentre il BEM è asettico, il flusso può essere ostruito a causa della precipitazione di sali di acidi grassi all'interno del contattore a membrana o del tubo nel tempo. Tuttavia, la manutenzione ordinaria e la pulizia dei contattori a membrana (vedere il passaggio 2.6) dovrebbero evitare lo sviluppo di problemi di incrostazioni e precipitazione salina. A volte si formano sacche di gas sul lato superiore del guscio dei contattori a membrana a causa di un posizionamento errato. I contattori a membrana devono essere leggermente inclinati rispetto alla verticale per garantire che la porta di uscita sul lato del guscio si trovi nel punto più alto, consentendo al gas che si forma di fuoriuscire dal contattore. Il flusso del fluido nel sistema LLE è configurato per fluire dal basso verso l'alto degli appaltatori per aiutare a svuotare le sacche di gas. Infine, il trasferimento di MCFA dalla soluzione di estrazione alla soluzione di strippaggio nel BEM è diminuito a concentrazioni molto elevate di MCFA nella soluzione di strippaggio. Questo problema può essere risolto sostituendo la soluzione di strippaggio più frequentemente.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66956/66956fig01.jpg"> Figura 1: Panoramica del sistema di estrazione liquido-liquido. Un rendering schematico che mostra i principali componenti del sistema, i vari circuiti dei fluidi e le direzioni del flusso. I principali componenti del sistema sono etichettati come segue: (A) serbatoio della soluzione di estrazione in fase organica, (B) membrana a scambio diretto, (C) membrana a scambio inverso, (D) pompa a membrana della soluzione di estrazione, (E) serbatoio della soluzione di stripping in fase acquosa, (F) sistema di controllo del pH, (G) porta di uscita del bioreattore, (H) porta di ritorno del bioreattore, (I) pompa peristaltica a membrana a scambio diretto e filtro a membrana a fibra cava, (J) filtro a membrana a fibra cava, (K) manometro, (L) valvola a spillo e (M) pompa peristaltica per soluzione di stripping. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66956/66956fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66956/66956fig02.jpg"> Figura 2: Accumulo di acidi grassi nella soluzione di stripping. Dati che mostrano le concentrazioni di acidi grassi a catena corta e di acidi grassi a catena media durante tre cicli batch della soluzione di strippaggio durante l'operazione di estrazione liquido-liquido continuo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66956/66956fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66956/66956fig03.jpg"> Figura 3: Cambiamento di colore della soluzione di stripping dopo l'estrazione. Una fotografia che mostra il cambiamento di colore della soluzione di strippaggio in fase acquosa prima (cioè pre-batch) e dopo (cioè dopo il batch) di un ciclo batch. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66956/66956fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66956/66956fig04.jpg"> Figura 4: Rapporti di acidi grassi nella soluzione di stripping. Dati che mostrano il rapporto tra acidi grassi a catena media e acidi grassi a catena corta durante un ciclo batch della soluzione di strippaggio durante l'operazione di estrazione liquido-liquido continuo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66956/66956fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66956/66956fig05.jpg"> Figura 5: Effetto delle portate della membrana sull'efficienza di estrazione. Dati che mostrano l'effetto di portate insufficienti attraverso la membrana di scambio in avanti e all'indietro sull'efficienza di estrazione degli acidi grassi a catena media durante il funzionamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66956/66956fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

È stato sviluppato un sistema di estrazione liquido-liquido (LLE) che coinvolge membrane a fibre cave per estrarre in modo continuo e selettivo gli acidi grassi a catena media (MCFA) dal brodo di fermentazione. Il sistema LLE raggiunge elevate specificità MCFA da brodi contenenti acidi grassi a catena corta e alcoli. Inoltre, gli MCFA sono concentrati in una soluzione di strippaggio per facilitare il recupero del prodotto.

Medium-chain fatty acids (MCFAs; carbon-lengths: C6-C12) are high-value platform chemicals that serve a variety of industrial applications, including ...

continuous-liquid-liquid-extraction-medium-chain-fatty-acids-from

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Continuous Liquid-Liquid Extraction of Medium-Chain Fatty Acids from Fermentation Broth Using Hollow-Fiber Membranes

539 Views.  University of Georgia. La mia ricerca mirava a valutare l'efficienza della membrana a fibra cava e l'estrazione continua liquido-liquido di acidi grassi a catena media dal brodo di fermentazione. Cerco di capire in che modo questa membrana si differenzia dalle tecniche tradizionali ottimizzando il processo di estrazione e determinando la scalabilità di questo metodo per l'uso industriale. L'attuale sfida sperimentale include l'estrazione inefficiente di acidi grassi a catena media...

Video: Autore in primo piano: Ottimizzazione delle membrane a fibra cava per l'estrazione continua liquido-liquido di acidi grassi a catena media

Medium-chain fatty acids (MCFAs; carbon-lengths: C6-C12) are high-value platform chemicals that serve a variety of industrial applications, including green antimicrobials, food ingredients, animal feed additives, cosmetics, fragrances, pharmaceuticals, and structured lipids. Currently, most MCFAs are produced from palm and coconut oil originating from Southeast Asia and South America. The conventional approach to harvesting palm and coconut fruits causes considerable ecological damage in these regions. Therefore, researchers are developing biological approaches (e.g., precision and open-culture fermentations) to generate MCFAs more sustainably using low-value substrates (e.g., methanol, ethanol, lactate) or organic wastes as feedstock. Microbial chain-elongation (CE) is a rapidly maturing open-culture fermentation platform that converts short-chain fatty acids (SCFAs; carbon lengths: C1-C5) into a subset of these MCFAs at industrially relevant rates. However, continuous in situ extraction of MCFA products is necessary not only to avoid product inhibition but also to facilitate the recovery of MCFAs in a pure and usable form.&#160;Liquid-liquid extraction (LLE) using hollow-fiber membranes and targeted extractant mixtures has proven a robust approach to selectively extract MCFA products from fermentation broths containing SCFAs. Here, the application of LLE for continuous MCFA removal is demonstrated using CE as the reference fermentation system and 3% (w/v) trioctylphosphine oxide in mineral oil as the extractant system. Fatty acids ranging from valeric acid (C5) to caprylic acid (C8) are selectively removed from SCFA-containing broths and concentrated to high titers in a semi-batch alkaline stripping solution for downstream processing.

A liquid-liquid extraction (LLE) system involving hollow-fiber membranes was developed to continuously and selectively extract medium-chain fatty acids (MCFAs) from the fermentation broth. The LLE system achieves high MCFA specificities from broths containing short-chain fatty acids and alcohols. Also, MCFAs are concentrated in a stripping solution to facilitate product recovery.

Ricerca

Bioingegneria

Constructing and Integrating the Bioreactor and the Liquid-Liquid Extraction System

To begin, prepare the organic phase extraction solution and reservoir by adding the extraction solution to a two liter glass reservoir and placing it on a magnetic stir plate. Next, position a 100 RPM variable speed pump drive with a polytetrafluoroethylene diaphragm pump head next to the reservoir. Using flexible pump tubing, connect the outflow port of the extraction solution reservoir to the diaphragm pump inlet.Then connect the pump outlet to the shell-side inlet at the base of the forward extraction membrane. Now, connect the shell-side outlet at the top of the forward extraction membrane to the shell-side inlet located at the base of the backward extraction membrane. Then connect the shell-side outlet at the top of the backward extraction membrane to the return port on the extraction solution reservoir.To prepare the aqueous phase stripping solution and reservoir, pour the solution into a four liter glass reservoir with a magnetic stir bar and place it on a magnetic stir plate. Integrate a pH control system with a set point of pH nine with the stripping solution reservoir. Insert the pH probe through the stripping solution reservoir port and suspend it in the stripping solution.To install the hollow fiber membrane filter, place a 300 RPM variable speed pump drive adjacent to the bioreactor. Affix the hydrophilic hollow fiber membrane to a ring stand above the peristaltic pump. Stack two peristaltic pump heads, large and small, on the pump drive.Now using flexible tubing, connect the outflow port at the bioreactor to the large pump head inlet. Then connect the large pump head outlet to the hydrophilic hollow fiber membrane filter at the tube-side inlet located at the base of the filter. Cap the top shell-side port of the filter to prevent the influx of air.To connect the forward extraction membrane, affix the first hydrophobic hollow fiber membrane module to a ring stand above the pump. Using flexible pump tubing, connect the hydrophilic hollow fiber membrane filter at the shell-side outlet to the small pump head inlet. Then connect the small pump head outlet to the forward extraction membrane at the tube-side inlet located at the base of the module.Now using a coupling fitting and T fitting, connect the pressure gauge and flow restriction valve to the tube-side outlet of the forward extraction membrane. Next, connect the tube-side outlet of the forward extraction membrane to the return port at the bioreactor. To connect the backward extraction membrane, place a 300 RPM variable speed pump drive adjacent to the bioreactor.Affix the second hydrophobic hollow fiber membrane module to a ring stand above the peristaltic pump. Then using flexible pump tubing, connect the stripping solution reservoir outflow port to the peristaltic pump inlet and the pump outlet to the tube-side inlet at the base of the backward extraction membrane. Afterward, using a coupling fitting and T fitting, connect the pressure gauge and flow restriction valve to the tube-side outlet of the backward extraction membrane.Using flexible pump tubing, connect the tube-side outlet at the top of the backward extraction membrane to the stripping solution reservoir return flow port.

Costruzione e integrazione del bioreattore e del sistema di estrazione liquido-liquido

Initiating the Operation of the Liquid-Liquid Extraction System for Continuous Medium Chain Fatty Acid Removal

To begin, integrate the bioreactor and liquid-liquid extraction system. Turn on the stripping solution peristaltic pump, or backward extraction membrane, and set the pump speed to achieve a constant flow rate between 25 to 250 milliliters per minute. Slowly close the needle valve at the shell-side outlet of the backward extraction membrane to establish a back pressure.Then, turn on the first hydrophobic hollow-fiber membrane module peristaltic pump, and set the pump speed to achieve a constant flow rate between 25 to 250 milliliters per minute. Afterward, slowly close the needle valve at the shell-side outlet of the first hydrophobic hollow-fiber membrane module to establish a back pressure of approximately five pounds per square inch gauge. Now, turn on the organic phase extraction solution diaphragm pump, and set the pump speed to achieve a constant flow rate between five to 50 milliliters per minute.Lastly, check the system for continuous flow. A steady accumulation of short and medium-chain fatty-acid products was observed in the alkaline aqueous phase stripping solution. A reduction in pump speed lowered the extraction efficiency.After restoring adequate pump speed, efficiency may take several days to recover.