Prima di iniziare il test, dobbiamo fare in modo che i seguenti reagenti sono correttamente preparati: <ol><li> A 50 mM tampone fosfato di potassio, pH 7,5. Preparare con 11,4 mg / ml di fosfato di potassio bibasico, triidrato in acqua purificata e la regolazione del pH con HCl 1M. Questa soluzione è posizionato a 37 ° C prima dell&#39;uso. </li><li> Un 0,65% peso / volume soluzione di caseina, preparato miscelando 6,5 mg / ml di caseina nel buffer 50 mM fosfato di potassio. Gradualmente aumentato la temperatura della soluzione con delicata agitazione a 80-85 ° C per circa 10 minuti fino a una dispersione omogenea è raggiunto. E &#39;molto importante non far bollire la soluzione. Il pH è quindi regolata, se necessario, con NaOH e HCl. </li><li> A 110 mM soluzione di acido tricloroacetico, preparata diluendo un magazzino 1:55 6.1N con acqua purificata. L&#39;acido tricloroacetico è un acido forte e deve essere maneggiato con cura. </li><li> 0.5 mM Folin &amp; Ciolcaltea, o reagente fenolo Folin, che è la soluzione che reagisce con tirosina per generare un cambiamento misurabile colore che saranno direttamente collegati con l&#39;attività delle proteasi. Reagente Folin fenolo è un acido e deve essere maneggiato con cura. </li><li> A mm 500 carbonato di sodio soluzione, preparata con 53 mg / ml di carbonato di sodio anyhydrous in acqua purificata. Una soluzione diluente enzima, che è composto da 10 mM tampone di acetato di sodio con calcio acetato 5mm, pH 7,5, a 37 ° C. Questa soluzione è quello che usiamo per sciogliere i campioni della proteasi solidi o soluzioni diluite enzima. </li><li> 1,1 mm L-tirosina soluzione madre standard. Preparati con 0,2 mg / ml L-tirosina in acqua depurata e riscaldata dolcemente fino alla tirosina si dissolve. Come con la caseina, non bollire questa soluzione. Lasciare che la L-tirosina standard per raffreddare a temperatura ambiente. Questa soluzione sarà diluita ulteriormente per rendere la nostra curva standard. </li><li> Proteasi soluzione. Immediatamente prima dell&#39;uso, sciogliere proteasi in soluzione diluente enzimatica preparata al punto 6. </li></ol> Se necessario, utilizzare un campione solido proteasi di attività predeterminate, che viene disciolto utilizzando un diluente enzima di 0,1-0,2 unità / ml. Questa soluzione serve come controllo positivo per il test di controllo qualità e la convalida per i calcoli che si esibiranno per determinare l&#39;attività enzimatica. Impostazione del saggio della proteasi e Curve standard <ol><li> Per iniziare questo saggio, trovano fiale adatto che conterrà circa 15 ml. Per ogni enzima che sarà testato, 4 flaconcini sono necessari. Un flaconcino sarà usato come un vuoto, e tre altri saranno utilizzati per attività di analisi di tre diluizioni della proteasi. Tre diluizioni sono utili per la verifica dei calcoli finale contro l&#39;altro. <ol><li> Per ogni serie di quattro fiale, aggiungere 5mls della nostra soluzione di caseina 0,65%. Lasciate che equilibrano in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per circa 5 minuti. </li><li> Aggiungi variando volumi di soluzione enzimatica che sarà testato per tre fiale campione del test, ma non il vuoto. Mescolare agitando e incubare per 37 ° C per dieci minuti esatti. L&#39;attività della proteasi e liberazione consequenziali di tirosina durante questo periodo di incubazione è quello che sarà misurato e confrontato tra i campioni di prova. </li></ol></li><li> Dopo questa incubazione di 10 minuti, aggiungere i 5 ml di reagente TCA a ciascuna provetta per arrestare la reazione. Quindi, aggiungere un volume adeguato di soluzione enzimatica a ciascuna provetta, anche il vuoto, in modo che il volume finale della soluzione enzimatica in ogni tubo è di 1 ml. Questo viene fatto per conto del valore di assorbanza dello stesso enzima e per garantire che il volume finale di ogni tubo è uguale. Incubare le soluzioni a 37 ° C per 30 minuti. Durante questa incubazione di 30 minuti, si consiglia di impostare il diluizioni tirosina standard. Usa 6 flaconi dram (fiale DRAM possono essere sostituiti con tubi in polipropilene) che può facilmente contenere 8 ml. Per i sei fiale, aggiungere il 1,1 mm soluzioni tirosina magazzino di serie con i seguenti volumi in ml: 0,05, 0,10, 0,20, 0,40, 0,50. Non aggiungere alcun tipo di tirosina al vuoto. Abbassare gli standard possono essere necessari per campioni impuri che darà piccolo cambiamento di colore. Una volta che la soluzione di tirosina standard è stato aggiunto, aggiungere un volume adeguato di acqua depurata a ciascuno degli standard per portare il volume a 2 ml. </li><li> Dopo l&#39;incubazione di 30 minuti, filtrare ciascuna delle soluzioni di test e il vuoto usando una siringa da 0,45 um polietersulfone filtro. La filtrazione è necessario per rimuovere eventuale insoluto dai campioni. <ol><li> Aggiungere la filtrazione 2 mls dei campioni di prova e nel bianco filtrato a 4 flaconcini DRAM che può contenere almeno 8 ml. Lo stesso tipo di fiala in cui sono stati preparati gli standard può essere utilizzato. </li><li> Per tutti i flaconi contenenti gli standard e vuoto standard, aggiungere 5mls di carbonato di sodio. Per ottenere i migliori risultati, aggiungere 1 ml di reattivo di Folin immediatamente dopo. </li><li> Aggiungi carbonato di sodio per regolare ogni goccia di pH creato con l&#39;aggiunta di reagente di Folin ha. </li><li> Aggiungi carbonato di sodio per i campioni di prova e test vuoto. Queste soluzioni diventa opaco dopo l&#39;aggiunta di carbonato di sodio. Aggiungere il reagente di Folin, che reagiscono soprattutto con tirosina libero. </li><li> Mescolare le fiale dram agitando e incubare a 37 ° C per 30 minuti. </li></ol> Dopo questa incubazione, si dovrebbe notare che le norme hanno una gradazione di colore correlazione con la quantità di tirosina aggiunta: la più alta concentrazione di tirosina che appaiono più scure. Si può notare anche modificare sensibilmente il colore nei nostri campioni di prova. 2mls di queste soluzioni sono filtrate con un 0,45 polietersulfone siringa filtro in cuvette adatto. Ora che il test viene eseguito, si può procedere allo spettrofotometro per registrare i nostri valori di assorbanza. </li></ol> Misurare l&#39;assorbanza e calcolo attività enzimatica <ol><li> L&#39;assorbanza dei campioni si misura con uno spettrofotometro utilizzando una lunghezza d&#39;onda di 660 nm. Il percorso della luce è impostato su 1 cm. Registrare i valori di estinzione di tali norme, vuoto standard, i campioni di prova diversi, e prova in bianco. Una volta che tutti i dati sono stati raccolti, la curva standard può essere creato. Al fine di generare la curva, la differenza di assorbanza tra il bianco standard e standard devono essere calcolati. Questo è il valore di assorbanza attribuibile alla quantità di tirosina nelle soluzioni standard. Dopo questo semplice calcolo, creare la curva standard utilizzando un programma grafico per tracciare la variazione di assorbanza dei nostri standard sull&#39;asse Y, contro l&#39;importo in micromoli per ciascuno dei nostri 5 standard sull&#39;asse X. <table style="width: 416px; height: 118px;" border="0"><tbody><tr><th style="text-align:center"> Volume standard di tirosina </th><th style="text-align:center"> uMoles Tirosina </th></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,05 </td><td style="text-align:center"> 0,055 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,10 </td><td style="text-align:center"> 0,111 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,20 </td><td style="text-align:center"> 0,221 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,40 </td><td style="text-align:center"> 0,442 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,50 </td><td style="text-align:center"> 0,553 </td></tr></tbody></table></li><li> Dopo i punti dati sono stati inseriti, generare una retta di regressione e l&#39;equazione pendenza corrispondente. Trovare la variazione di assorbanza nei campioni analizzati calcolando la differenza tra l&#39;assorbanza campione da analizzare e l&#39;assorbanza del bianco prova. Inserimento del valore di assorbanza per uno dei campioni di prova nell&#39;equazione pendenza e risolvere comporterà la micromoli di tirosina liberato durante questa reazione proteolitica particolare. Per ottenere l&#39;attività dell&#39;enzima in unità per / ml, eseguire il seguente calcolo: (Equivalenti tirosina umole rilasciato) x (11) Unità / ml = enzima __________________________________________ (1) x (10) x (2) 11 = il volume totale (in millilitri) di test 10 = Tempo di test (in minuti) secondo la definizione di unità 1 = Volume di enzimi (in millilitri) di enzima usato 2 = volume (in millilitri) utilizzati nella determinazione colorimetrica Prenda il numero di equivalenti micromoli tirosina rilasciato ottenuto dall&#39;equazione pendenza e moltiplicarlo per il volume totale del test in MLS, che nel nostro caso è 11mls. Dividere questo valore per tre quantità di altri: il tempo del test, che abbiamo corso per 10 minuti, il volume di enzima utilizzato nel test, che è stato variato (usiamo 1ml), il volume di millilitri utilizzati nel rilevamento colorimetrico, che può differiscono in base alla cuvetta. Abbiamo usato 2 ml. </li><li> Micromoli di tirosina divise da tempo nella misurazione minuto i rendimenti di attività della proteasi chiamata &quot;unità&quot;. Siamo in grado di annullare le unità di misura del volume nel numeratore e denominatore, lasciando un measurment di attività enzimatica in termini di unità / ml. Al fine di determinare l&#39;attività in un campione della proteasi solida diluito in diluente enzima, dividiamo la nostra attività in unità / ml per la concentrazione di solidi utilizzati in questo saggio originariamente in mg / ml., Lasciandoci con l&#39;attività in termini di unità / mg . Unità / ml di enzima Unità / mg solido = _____________________ mg solidi / ml di enzima </li></ol>

<ol>
	<li>Anson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Gen. Physiol. 22, 79-89 (1938).</li><li>Folin, O., Ciocalteau, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Biol. Chem. 73, 627 (1929).</li></ol>

Abbiamo appena mostrato come analizzare l&#39;attività della proteasi con Sigma universale saggio di attività della proteasi. Inoltre, questo test è utile per garantire che i nostri proteasi hanno determinato con precisione l&#39;attività prima di ricevere per i vostri esperimenti. Come avete visto, durante questa procedura, è di fondamentale importanza per ricordare al calore, sia la caseina e le soluzioni tirosina lentamente e non a bollire loro. Inoltre, è fondamentale per preparare diversi spazi sia per i vostri standard e per ogni campione che si ha.

<table><tbody><tr><td>Protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4630</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate, Dibasic, Trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>Casein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7078</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroacetic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0699</td><td></td></tr><tr><td>Folin &amp;amp; Ciocalteu&#039;s Phenol Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9252</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Carbonate, Anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate, Trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1000</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrosine, Free Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>Protease Profiler Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PP0500</td><td></td></tr><tr><td>Protease Fluorescent Detection Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PF0100</td><td></td></tr></tbody></table>

sigma's non-specific protease activity assay - casein as a substrate

Proteasi rompere i legami peptidici. Nel laboratorio, è spesso necessario misurare e / o confrontare l&#39;attività della proteasi. Sigma non-specifico saggio di attività della proteasi può essere utilizzato come una procedura standardizzata per determinare l&#39;attività della proteasi, che è quello che facciamo durante le procedure di qualità del nostro controllo. In questo saggio, la caseina agisce come substrato. Quando la proteasi stiamo testando digerisce caseina, la tirosina viene liberato insieme ad altri aminoacidi e frammenti peptidici. Reagente Folin e Ciocalteus fenolo, o Folin reagisce principalmente con tirosina liberi di produrre un cromoforo di colore blu, che è quantificabile e misurato come valore in assorbanza allo spettrofotometro. La tirosina più che viene rilasciato dalla caseina, più i cromofori sono generati e più forte è l&#39;attività della proteasi. Valori di assorbanza generata dalla attività della proteasi vengono confrontati con una curva standard, che viene generato dalla reazione quantità note di tirosina con il reagente FC di correlare i cambiamenti di assorbanza con la quantità di tirosina in micromoli. Dalla curva standard dell&#39;attività di campioni della proteasi possono essere determinati in termini di unità, che è la quantità in micromoli di equivalenti tirosina rilasciato da caseina al minuto. Per visualizzare questo articolo in cinese, <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=910">clicca qui</a>

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Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

Proteasi rompere i legami peptidici. Nel laboratorio, è spesso necessario misurare e / o confrontare l&#39;attività della proteasi. Sigma non-specifico saggio di attività della proteasi può essere utilizzato come una procedura standardizzata per determinare l&#39;attività della proteasi.

Sigma non specifiche attività di analisi della proteasi - caseina come substrato

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases.  Sigma's non-specific protease ...

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The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important for revealing protease function. The method proposed in this study determines protease specificity by measuring the molecular weight of unique substrates using Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. The substrates contain iminobiotin, while the cleaved site consists of amino acids, and the spacer consists of polyethylene glycol. The cleaved substrate will generate a unique molecular weight using a cleaved amino acid. One of the merits of this method is that it may be carried out in one pot using crude samples, and it is also suitable for assessing multiple samples. In this article, we describe a simple experimental method optimized with samples extracted from mouse lung tissue, including tissue extraction, placement of digestive substrates into samples, purification of digestive substrates under different pH conditions, and measurement of the substrates&#39; molecular weight using MALDI-TOF mass spectrometry. In summary, this technique allows for the identification of protease specificity in crude samples derived from tissue extracts using MALDI-TOF mass spectrometry, which may easily be scaled up for multiple sample processing.

Here, we present a protocol to determine protease specificity in crude mouse tissue extracts using MALDI-TOF spectrometry.

La determinazione della specificità della proteasi nel Mouse tessuto estratti mediante spettrometria di massa MALDI-TOF: manipolazione di PH per causare i cambiamenti di specificità

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Ricerca

Biochimica

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using electrophoresis through a resolving gel embedded with a degradable substrate. This method differs from traditional gel zymography in that a quenched fluorogenic peptide is covalently incorporated into the resolving gel instead of full length proteins, such as gelatin or casein. Use of the fluorogenic peptides enables direct detection of proteolytic activity without additional staining steps. Enzymes within the biological samples cleave the quenched fluorogenic peptide, resulting in an increase in fluorescence. The fluorescent signal in the gels is then imaged with a standard fluorescent gel scanner and quantified using densitometry. The use of peptides as the degradable substrate greatly expands the possible proteases detectable with zymographic techniques.

Here, we present a detailed protocol for a modified zymographic technique in which fluorescent peptides are used as the degradable substrate in place of native proteins. Electrophoresis of biological samples in fluorescent peptide zymograms enables detection of a wider range of proteases than previous zymographic techniques.

Rilevazione di attività di proteasi dallo Zymography Peptide fluorescente

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Ricerca sul cancro

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often viruses exhibit cell and tissue tropism and are adapted to specific cell or tissue proteases. Moreover, these viruses can introduce mutations or insertions into their genome during replication that may affect the cleavage, and thus can contribute to adaptations to a new host. Here, we present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of peptides mimicking the cleavage site of viral fusion proteins. The technique is very flexible and can be used to investigate the proteolytic activity of a single protease on many different substrates, and in addition, it also allows exploration of the activity of multiple proteases on one or more peptide substrates. In this study, we used peptides mimicking the cleavage site motifs of the coronavirus spike protein. We tested human and camel derived Middle East Respiratory Syndrome coronaviruses (MERS-CoV) to demonstrate that single and double substitutions in the cleavage site can alter the activity of furin and dramatically change cleavage efficiency. We also used this method in combination with bioinformatics to test furin cleavage activity of feline coronavirus spike proteins from different serotypes and strains. This peptide-based method is less labor- and time intensive than conventional methods used for the analysis of proteolytic activity for viruses, and results can be obtained within a single day.

We present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of the proteolytic activity of proteases on peptides representing the cleavage site of viral fusion peptides. This method can also be used on any other amino acid motif within a protein sequence to test for the protease activity.

Un'analisi di clivaggio Peptide fluorogenico alla schermata per attività proteolitica: applicazioni per coronavirus spike l'attivazione della proteina

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

L&#39;uso del kit di rilevamento a fluorescenza della proteasi per determinare l&#39;attività della proteasi

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Biologia

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

L&#39;importanza della concentrazione della proteina corretta per Cinetica e determinazione affinità nella struttura-funzione di analisi

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Saggi qualitativi e quantitativi per il rilevamento e la caratterizzazione di proteine ​​antimicrobici

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Immunologia e infezioni

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals and starch in plants. The crystal structures of glucan phosphatase with model glucan substrates reveal distinct glucan-binding interfaces made of DSP and carbohydrate-binding domains. However, quantitative measurements of glucan-glucan phosphatase interactions with physiologically relevant substrates are fundamental to the biological understanding of the glucan phosphatase family of enzymes and the regulation of energy metabolism. This manuscript reports a Concanavalin A (ConA)-based in vitro sedimentation assay designed to detect the substrate binding affinity of glucan phosphatases against different glucan substrates.&#160;As a proof of concept, the dissociation constant (KD) of glucan phosphatase Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) and amylopectin was determined. The characterization of SEX4 mutants and other members of the glucan phosphatase family of enzymes further demonstrates the utility of this assay to assess the differential binding of protein- carbohydrate interactions. These data demonstrate the suitability of this assay to characterize a wide range of starch and glycogen interacting proteins.

This method describes a lectin-based in vitro sedimentation assay to quantify the binding affinity of glucan phosphatase and amylopectin. This co-sedimentation assay is reliable for measuring glucan phosphatase substrate binding and can be applied to various solubilized glucan substrates.

Saggio di sedimentazione basato sulla concanavalina A per misurare il legame del substrato delle fosfatasi glucane

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been identified and are separated into six groups based on their structure and substrate specificity (collagenases, gelatinases, membrane type [MT-MMP], stromelysins, matrilysins, and others). MMPs play a critical role in cell invasion, cartilage degradation, tissue remodeling, wound healing, and embryogenesis. They therefore participate in both normal processes and in the pathogenesis of many diseases, such as rheumatoid arthritis, cancer, or chronic obstructive pulmonary disease1-6. Here, we will focus on MMP-2 (gelatinase A, type IV collagenase), a widely expressed MMP. We will demonstrate how to detect MMP-2 in cell culture supernatants by zymography, a commonly used, simple, and yet very sensitive technique first described in 1980 by C. Heussen and E.B. Dowdle7-10. This technique is semi-quantitative, it can therefore be used to determine MMP levels in test samples when known concentrations of recombinant MMP are loaded on the same gel11.
Solutions containing MMPs (e.g. cell culture supernatants, urine, or serum) are loaded onto a polyacrylamide gel containing sodium dodecyl sulfate (SDS; to linearize the proteins) and gelatin (substrate for MMP-2). The sample buffer is designed to increase sample viscosity (to facilitate gel loading), provide a tracking dye (bromophenol blue; to monitor sample migration), provide denaturing molecules (to linearize proteins), and control the pH of the sample. Proteins are then allowed to migrate under an electric current in a running buffer designed to provide a constant migration rate. The distance of migration is inversely correlated with the molecular weight of the protein (small proteins move faster through the gel than large proteins do and therefore migrate further down the gel). After migration, the gel is placed in a renaturing buffer to allow proteins to regain their tertiary structure, necessary for enzymatic activity. The gel is then placed in a developing buffer designed to allow the protease to digest its substrate. The developing buffer also contains p-aminophenylmercuric acetate (APMA) to activate the non-proteolytic pro-MMPs into active MMPs. The next step consists of staining the substrate (gelatin in our example). After washing the excess dye off the gel, areas of protease digestion appear as clear bands. The clearer the band, the more concentrated the protease it contains. Band staining intensity can then be determined by densitometry, using a software such as ImageJ, allowing for sample comparison.

This protocol describes an activity-based assay for detecting matrix metalloproteinases in culture supernatants or body fluids.

Rilevamento delle metalloproteinasi della matrice funzionale di zimografia

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues Using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence

Isolevuglandins (IsoLGs) are highly reactive gamma ketoaldehydes formed from H2-isoprostanes through lipid peroxidation and crosslink proteins leading to inflammation and various diseases including hypertension. Detection of IsoLG accumulation in tissues is crucial in shedding light on their involvement in the disease processes. However, measurement of IsoLGs in tissues is extremely difficult, and currently available tools, including mass spectrometry analysis, are laborious and extremely expensive. Here we describe a novel method for in situ detection of IsoLGs in tissues using alkaline phosphatase-conjugated D11 ScFv and a recombinant phage-display antibody produced in E. coli by immunofluorescent microscopy. Four controls were used for validating the staining: (1) staining with and without D11, (2) staining with bacterial periplasmic extract with the alkaline phosphatase linker, (3) irrelevant scFV antibody staining, and (4) competitive control with IsoLG prior to the staining. We demonstrate the effectiveness of the alkaline phosphatase-conjugated D11 in both human and mouse tissues with or without hypertension. This method will likely serve as an important tool to study the role of IsoLGs in a wide variety of disease processes.

This article provides a detailed methodology for the measurement of isolevuglandins in tissues by immunofluorescence using alkaline phosphatase-conjugated ScFv D11 antibody. Hypertension models in both mice and humans are used to explain the step-by-step procedures and fundamental principles associated with isolevuglandin measurement in tissue samples.

Rilevazione diretta delle isolevuglandine nei tessuti utilizzando una proteina di fusione della fosfatasi alcalina D11 scFv e immunofluorescenza

Isolevuglandins (IsoLGs) are highly reactive gamma ketoaldehydes formed from H2-isoprostanes through lipid peroxidation and crosslink proteins leading to ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen the Proteolytic Activity of Proteases

Source: Jaimes, J. A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58892">A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates an assay to screen for the proteolytic activity of proteases using fluorogenic peptides. The protease recognizes its cleavage site on the peptide, cleaving it and separating the quencher from the fluorophore, enabling its fluorescence emission. The fluorescence signal is detected and analyzed to check for the cleavage efficiency of different peptide variants.

Sigma non specifiche attività di analisi della proteasi - caseina come substrato

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