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Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of <em>Arabidopsis thaliana</em>

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts  from different plant tissues was first ...

Cornell University

&#x4F53;&#x5916;&#x57F9;&#x517B;&#x7684;&#x830E;&#x5C16;&#x7684;&#x56DB;&#x4E2A;&#x8461;&#x8404; (&#x8461;&#x8404;) &#x54C1;&#x79CD;&#x548C;&#x4E00;&#x4E2A;&#x5947;&#x5F02;&#x679C; (&#x7315;&#x7334;&#x6843;) &#x54C1;&#x79CD;&#x6DF1;&#x4F4E;&#x6E29;&#x4FDD;&#x5B58;&#x4F7F;&#x7528;&#x5C01;&#x88C5;&#x8131;&#x6C34;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;&#x76F4;&#x63A5;&#x4ECE;&#x6DF1;&#x4F4E;&#x6E29;&#x4FDD;&#x5B58;&#x7684;&#x830E;&#x5C16;&#x518D;&#x751F;&#x690D;&#x682A;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4; DNA &#x63D0;&#x53D6;&#x548C;&#x4F7F;&#x7528; RAPD &#xFF08;&#x968F;&#x673A;&#x6269;&#x589E;&#x591A;&#x6001; DNA) &#x6280;&#x672F;&#x5206;&#x6790;&#x3002;&#x83B7;&#x5F97;&#x7684; RAPD &#x914D;&#x7F6E;&#x6587;&#x4EF6;&#x662F;&#x9AD8;&#x5EA6;&#x53EF;&#x91CD;&#x73B0;&#xFF0C;&#x672A;&#x53D1;&#x73B0;&#x5DEE;&#x5F02;&#x4E4B;&#x95F4;&#x83B7;&#x5F97;&#x7684;&#x690D;&#x682A;&#x518D;&#x751F;&#x4ECE;&#x63A7;&#x4EF6;&#x548C;&#x6DF1;&#x4F4E;&#x6E29;&#x4FDD;&#x5B58;&#x7684; DNA &#x56FE;&#x6848;&#x8BD5;&#x7BA1;&#x82D7;&#x3002;RAPD &#x6280;&#x672F;&#x56E0;&#x6B64;&#x4F3C;&#x4E4E;&#x662F;&#x8BC4;&#x4EF7;&#x6DF1;&#x4F4E;&#x6E29;&#x4FDD;&#x5B58;&#x7684;&#x6750;&#x6599;&#xFF0C;&#x53EF;&#x4EE5;&#x4F7F;&#x7528;&#x51BB;&#x7ED3;&#x7684;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x5B8C;&#x6210;&#x540E;&#x7684;&#x8FC5;&#x901F;&#x548C;&#x6709;&#x6548;&#x5730;&#x5C06;&#x8865;&#x5145;&#x5176;&#x4ED6;&#x9057;&#x4F20;&#x7A33;&#x5B9A;&#x6027;&#x8BC4;&#x4EF7;&#x65B9;&#x6CD5;&#x7684;&#x9057;&#x4F20;&#x7A33;&#x5B9A;&#x6027;&#x7684;&#x5FEB;&#x901F;&#x3001; &#x7B80;&#x5355;&#x548C;&#x9AD8;&#x6548;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;

&#x4ECE;&#x518D;&#x751F;&#x690D;&#x682A;&#x9057;&#x4F20;&#x7A33;&#x5B9A;&#x6027;&#x8BC4;&#x4F30;&#x6DF1;&#x4F4E;&#x6E29;&#x4FDD;&#x5B58;&#x4F53;&#x5916;&#x57F9;&#x517B;&#x7684;&#x8461;&#x8404;&#x548C;&#x7315;&#x7334;&#x6843;&#x830E;&#x5C16; rapd&#x3002;

In vitro cultured shoot-tips of four grape (Vitis vinifera) cultivars and one kiwi (Actinidia deliciosa) cultivar were cryopreserved using the encapsulation-dehydration method. Genomic DNA of plantlets regenerated directly from cryopreserved shoot-tips was extracted and analyzed using the RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) technique. The RAPD profiles obtained were highly reproducible and no differences were found between the DNA patterns obtained with plantlets regenerated from control and cryopreserved plantlets. The RAPD technique therefore appears to be a fast, simple and efficient method for evaluating genetic stability of cryopreserved material, which can be used rapidly after the completion of a freezing experiment and will efficiently complement other genetic stability evaluation methods.

Genetic stability assessments of plantlets regenerated from cryopreserved in vitro cultured grape and kiwi shoot-tips using RAPD.

Apex cultiv&eacute;s in vitro de quatre raisins (Vitis vinifera) vari&eacute;t&eacute;s et cultivars d&#39;un kiwi (Actinidia deliciosa) ont &eacute;t&eacute; cryoconserv&eacute;s &agrave; l&#39;aide de la m&eacute;thode d&#39;encapsulation-d&eacute;shydratation. L&#39;ADN g&eacute;nomique de plantules r&eacute;g&eacute;n&eacute;r&eacute;es directement &agrave; partir de m&eacute;rist&egrave;mes cryoconserv&eacute;s ont &eacute;t&eacute; extraites et analys&eacute;es &agrave; l&#39;aide de la technique RAPD (l&#39;ADN polymorphe amplifi&eacute; au hasard). Les profils RAPD obtenus &eacute;taient hautement reproductibles et aucune des diff&eacute;rences entre les profils d&#39;ADN obtenus avec des plantules r&eacute;g&eacute;n&eacute;r&eacute;es &agrave; partir de contr&ocirc;le et cryoconserv&eacute;s plantules. La technique RAPD semble donc &ecirc;tre une m&eacute;thode rapide, simple et efficace pour &eacute;valuer la stabilit&eacute; g&eacute;n&eacute;tique du mat&eacute;riel cryoconserv&eacute;, qui peut &ecirc;tre utilis&eacute; rapidement apr&egrave;s la fin d&#39;une exp&eacute;rience de cong&eacute;lation et viendra compl&eacute;ter efficacement les autres m&eacute;thodes d&#39;&eacute;valuation de la stabilit&eacute; g&eacute;n&eacute;tique.

&Eacute;valuations de la stabilit&eacute; g&eacute;n&eacute;tique des plantules r&eacute;g&eacute;n&eacute;r&eacute;es &agrave; partir de cryopr&eacute;serv&eacute;s in vitro culture raisin et kiwi-apex &agrave; l&#39;aide de RAPD.

Genetische Stabilit&#xE4;t Einsch&#xE4;tzungen der Pfl&#xE4;nzchen aus kryokonservierten in vitro kultivierten Trauben und Kiwi Shoot-Tipps mit RAPD regeneriert.

Coltivate in vitro sparare-suggerimenti di uva (Vitis vinifera) quattro cultivar e cultivar di un kiwi (Actinidia deliciosa) sono stati crioconservati utilizzando il metodo di incapsulamento-disidratazione. DNA genomico delle barbatelle rigenerati direttamente da crioconservati shoot-consigli &egrave; stato estratto e analizzato usando la tecnica RAPD (casuale Amplified Polymorphic DNA). I profili RAPD ottenuti erano altamente riproducibili e non sono state riscontrate differenze tra i modelli di DNA ottenuti con barbatelle rigenerato dal controllo e crioconservati barbatelle. La tecnica RAPD sembra quindi essere un metodo veloce, semplice ed efficace per valutare la stabilit&agrave; genetica del materiale crioconservato, che pu&ograve; essere utilizzato rapidamente dopo il completamento di un esperimento di congelamento e andr&agrave; ad integrare in modo efficiente altri metodi di valutazione della stabilit&agrave; genetica.

Valutazioni di stabilit&agrave; genetica delle barbatelle rigenerati da crioconservati in vitro colte uva e kiwi shoot-consigli mediante RAPD.

4 &#x30D6;&#x30C9;&#x30A6; &#xFF08;&#x30D6;&#x30C9;&#x30A6;&#x30D6;&#x30C9;&#x30A6;&#xFF09; &#x54C1;&#x7A2E;&#x304A;&#x3088;&#x3073; 1 &#x3064;&#x306E;&#x30AD;&#x30A6;&#x30A4; &#xFF08;&#x30AD;&#x30A6;&#x30A4; &#x30D5;&#x30EB;&#x30FC;&#x30C4;&#x679C;&#x5B9F;) &#x54C1;&#x7A2E;&#x306E; in vitro &#x57F9;&#x990A;&#x30B7;&#x30E5;&#x30FC;&#x30C8; &#x30D2;&#x30F3;&#x30C8; &#x30AB;&#x30D7;&#x30BB;&#x30EB;&#x5316;&#x8131;&#x6C34;&#x6CD5;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x51CD;&#x7D50;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x76F4;&#x63A5;&#x51CD;&#x7D50;&#x4FDD;&#x5B58;&#x306E;&#x64AE;&#x5F71;&#x30D2;&#x30F3;&#x30C8;&#x304B;&#x3089;&#x518D;&#x751F;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x690D;&#x7269;&#x4F53;&#x306E;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0; DNA &#x62BD;&#x51FA;&#x3057;&#x3001;RAPD (&#x30E9;&#x30F3;&#x30C0;&#x30E0;&#x5897;&#x5E45;&#x30DD;&#x30EA;&#x30E2;&#x30FC;&#x30D5;&#x30A3;&#x30C3;&#x30AF; DNA) &#x306E;&#x624B;&#x6CD5;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x3066;&#x5206;&#x6790;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5F97;&#x3089;&#x308C;&#x305F; RAPD &#x30D7;&#x30ED;&#x30D5;&#x30A1;&#x30A4;&#x30EB;&#x304C;&#x518D;&#x73FE;&#x6027;&#x306E;&#x9AD8;&#x3044;&#x3055;&#x308C;&#x3001;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C8;&#x30ED;&#x30FC;&#x30EB;&#x304B;&#x3089;&#x518D;&#x751F;&#x6210;&#x3057;&#x3001;&#x51CD;&#x7D50;&#x4FDD;&#x5B58;&#x57F9;&#x990A;&#x3067;&#x5F97;&#x3089;&#x308C;&#x305F; DNA &#x30D1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30F3;&#x9593;&#x306B;&#x76F8;&#x9055;&#x306F;&#x898B;&#x3064;&#x304B;&#x308A;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3067;&#x3057;&#x305F;&#x5E7C;&#x690D;&#x7269;&#x4F53;&#x3002;RAPD &#x6CD5;&#x306F;&#x3001;&#x3057;&#x305F;&#x304C;&#x3063;&#x3066;&#x51CD;&#x7D50;&#x5B9F;&#x9A13;&#x306E;&#x5B8C;&#x4E86;&#x5F8C;&#x6025;&#x901F;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3067;&#x304D;&#x3001;&#x4ED6;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x7684;&#x5B89;&#x5B9A;&#x6027;&#x306E;&#x8A55;&#x4FA1;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3092;&#x88DC;&#x5B8C;&#x3059;&#x308B;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306B;&#x51CD;&#x7D50;&#x4FDD;&#x5B58;&#x3057;&#x305F;&#x6750;&#x6599;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x7684;&#x5B89;&#x5B9A;&#x6027;&#x8A55;&#x4FA1;&#x306E;&#x9AD8;&#x901F;&#x3001;&#x30B7;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EB;&#x304B;&#x3064;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306A;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x8868;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x907A;&#x4F1D;&#x7684;&#x5B89;&#x5B9A;&#x6027;&#x306E;&#x8A55;&#x4FA1;&#x304B;&#x3089;&#x518D;&#x751F;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x690D;&#x7269;&#x4F53;&#x306E;&#x51CD;&#x7D50;&#x4FDD;&#x5B58;&#x306E; in vitro &#x57F9;&#x990A;&#x3076;&#x3069;&#x3046;&#x3001;&#x30AD;&#x30A6;&#x30A4;&#x64AE;&#x5F71;-&#x30D2;&#x30F3;&#x30C8; rapd &#x6CD5;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

4 &#xD3EC;&#xB3C4; (&#xC655; vinifera) &#xC7AC;&#xBC30; &#xD55C; &#xD0A4; &#xC704; (Actinidia deliciosa) &#xD488;&#xC885;&#xC758; &#xCCB4; &#xC678; &#xBC30;&#xC591;&#xB41C; &#xCD2C;&#xC601; &#xD301; &#xCEA1;&#xC290;&#xD654; &#xD0C8;&#xC218; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; cryopreserved &#xD588;&#xB2E4;. Cryopreserved &#xCD2C;&#xC601;-&#xD301;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC9C1;&#xC811; &#xC7AC;&#xC0DD;&#xC131; plantlets&#xC758; &#xAC8C;&#xB188; DNA &#xCD94;&#xCD9C; &#xB41C; &#xBC0F; RAPD (&#xBB34;&#xC791;&#xC704; &#xC99D;&#xD3ED; &#xB41C; &#xB2E4; &#xD615;&#xD0DC; DNA) &#xAE30;&#xBC95;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xBD84;&#xC11D;. &#xC5BB;&#xC740; RAPD &#xD504;&#xB85C;&#xD544; &#xB192;&#xC740; &#xC7AC;&#xD604; &#xB418;&#xC5C8;&#xACE0; plantlets &#xCEE8;&#xD2B8;&#xB864;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0DD;&#xC131; &#xD558; &#xACE0; cryopreserved&#xC73C;&#xB85C; &#xC5BB;&#xC740; DNA &#xD328;&#xD134; &#xC0AC;&#xC774; &#xCC28;&#xC774;&#xAC00; &#xBC1C;&#xACAC; plantlets. RAPD &#xAE30;&#xBC95; &#xB530;&#xB77C;&#xC11C; &#xB0C9;&#xB3D9; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC744; &#xC644;&#xB8CC; &#xD55C; &#xD6C4; &#xC2E0;&#xC18D; &#xD558; &#xAC8C; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC73C;&#xBA70; &#xB2E4;&#xB978; &#xC720;&#xC804;&#xC801; &#xC548;&#xC815;&#xC131; &#xD3C9;&#xAC00; &#xBC29;&#xBC95; &#xBCF4;&#xC644; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xD558;&#xB294; cryopreserved &#xC18C;&#xC7AC;&#xC758; &#xC720;&#xC804;&#xC801; &#xC548;&#xC815;&#xC131;&#xC744; &#xD3C9;&#xAC00; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD55C; &#xBE60;&#xB974;&#xACE0;, &#xAC04;&#xB2E8; &#xD558; &#xACE0; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC778; &#xBC29;&#xBC95;&#xC774; &#xB420; &#xB4EF;&#xD558;&#xB2E4;.

&#xC720;&#xC804;&#xC801; &#xC548;&#xC815;&#xC131; &#xD3C9;&#xAC00;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC7AC;&#xC0DD;&#xC131; plantlets&#xC758; &#xCCB4; &#xC678; &#xBC30;&#xC591;&#xB41C; &#xD3EC;&#xB3C4; &#xD0A4; &#xC704; &#xCD2C;&#xC601;-&#xD301; cryopreserved RAPD&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC;.

&Aacute;pices cultivadas in vitro de cuatro uvas (Vitis vinifera) cultivares y cultivar un kiwi (Actinidia deliciosa) cryopreserved utilizando el m&eacute;todo de encapsulaci&oacute;n-deshidrataci&oacute;n. ADN gen&oacute;mico de pl&aacute;ntulas regeneradas de &aacute;pices criopreservados extrajeron y analizaron mediante la t&eacute;cnica de RAPD (DNA polim&oacute;rfica de amplificado al azar). Los perfiles RAPD obtenidos fueron altamente reproducibles y no se encontraron diferencias entre los patrones de ADN obtenidos con pl&aacute;ntulas regeneradas a partir de control y criopreserva pl&aacute;ntulas. Por lo tanto, la t&eacute;cnica de RAPD parece ser un m&eacute;todo r&aacute;pido, simple y eficiente para evaluar la estabilidad gen&eacute;tica del material criopreservado, que puede ser utilizado r&aacute;pidamente despu&eacute;s de la terminaci&oacute;n de un experimento de congelaci&oacute;n y eficientemente complementar&aacute; otros m&eacute;todos de evaluaci&oacute;n de la estabilidad gen&eacute;tica.

Las evaluaciones de la estabilidad gen&eacute;tica de las pl&aacute;ntulas regeneradas a partir de criopreservaci&oacute;n in vitro cultivados uva y kiwi-&aacute;pices utilizando RAPD.

(Ds) &#x53CC;&#x94FE; RNA &#x5E72;&#x6270; (RNAi) &#x5E7F;&#x6CDB;&#x5E94;&#x7528;&#x4E8E;&#x690D;&#x7269;&#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x529F;&#x80FD;&#x5206;&#x6790;&#x548C;&#x901A;&#x8FC7;&#x751F;&#x6210;&#x8868;&#x793A; dsRNA &#x5728;&#x8DB3;&#x5E95;&#x7684;&#x7A33;&#x5B9A;&#x690D;&#x682A;&#x3002;&#x8FD9;&#x9879;&#x7814;&#x7A76;&#x8868;&#x660E;&#x4E5F;&#x53EF;&#x4EE5;&#x5229;&#x7528; RNAi &#x6765;&#x5BA1;&#x67E5;&#x5728;&#x539F;&#x751F;&#x8D28;&#x4F53;&#x4E2D;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x529F;&#x80FD;&#x3002;&#x539F;&#x751F;&#x8D28;&#x4F53;&#x662F;&#x53E6;&#x5916;&#x7684;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#xFF0C;&#x56E0;&#x4E3A;&#x6709;&#x6548;&#x89E6;&#x53D1; RNAi &#x57FA;&#x56E0;&#x6C89;&#x9ED8;&#x53D6;&#x51B3;&#x4E8E;&#x4E0D;&#x4EC5;&#x6D88;&#x8017;&#x57FA;&#x56E0;&#x8A8A;&#x672C;&#x4E5F;&#x5C31;&#x76F8;&#x5E94;&#x7684;&#x591A;&#x80BD;&#x7684;&#x66F4;&#x66FF;&#x7387;&#x3002;&#x672C;&#x6587;&#x6240;&#x8FF0;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x6D4B;&#x8BD5;&#x5982;&#x679C;&#x77AC;&#x6001; RNAi &#x5728;&#x539F;&#x751F;&#x8D28;&#x4F53;&#x4E2D;&#x7684;&#x4F1A;&#x5BFC;&#x81F4;&#x6D88;&#x8017;&#x7684;&#x6709;&#x9488;&#x5BF9;&#x6027;&#x7684;&#x591A;&#x80BD;&#x548C;&#x539F;&#x751F;&#x8D28;&#x4F53;&#x5177;&#x6709;&#x6709;&#x9650;&#x7684;&#x5BFF;&#x547D;&#xFF0C;&#x56E0;&#x4E3A;&#x5982;&#x679C; RNAi &#x6316;&#x7A7A;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x529F;&#x80FD;&#x8BC4;&#x4F30;&#x65B9;&#x6CD5;&#x5C06;&#x662F;&#x53EF;&#x884C;&#x7684;&#x539F;&#x751F;&#x8D28;&#x4F53;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5C55;&#x793A;&#x8FD9;&#x539F;&#x751F;&#x8D28;&#x4F53;&#x8F6C;&#x67D3;&#x7684;&#x4F53;&#x5916;&#x5408;&#x6210;&#x7684; dsRNA&#xFF0C;&#x5BF9;&#x62DF;&#x5357;&#x82A5; (&#x62DF;&#x5357;&#x82A5;) beta &#x6C34;&#x5408;&#x9176; (ECS1)&#xFF0C;&#x5BFC;&#x81F4; ECS1 &#x8A8A;&#x672C;&#x3001; ECS1 &#x591A;&#x80BD;&#xFF0C;&#x51CF;&#x5C11;&#x4E86; 72%&#x548C;&#x8C37;&#x80F1;&#x7518;&#x80BD;&#x542B;&#x91CF;&#x4E0B;&#x964D;&#x4E86; 60%&#x7684; 95%&#x6D88;&#x8017;&#x7684;&#x8C37;&#x80F1;&#x7518;&#x80BD;&#x7684;&#x5408;&#x6210;&#x4E2D;&#x7684;&#x5173;&#x952E;&#x9176;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7ED3;&#x679C;&#x4E0E;&#x5BF9;&#x62DF;&#x5357;&#x82A5;&#x5E7C;&#x82D7;&#x8F74;&#x627F; ECS1 &#x7684; cad2-1 &#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x7B49;&#x4F4D;&#x57FA;&#x56E0;&#x5206;&#x6790;&#x540E;&#x83B7;&#x5F97;&#x76F8;&#x82E5;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x4E5F;&#x540C;&#x65F6;&#x6539;&#x5584; RNAi &#x7684;&#x51E0;&#x4E2A;&#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x5931;&#x6D3B;&#x7684;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x3002;&#x6700;&#x540E;&#xFF0C;&#x56E0;&#x4E3A;&#x6211;&#x4EEC;&#x5206;&#x79BB;&#x539F;&#x751F;&#x8D28;&#x4F53;&#x7684;&#x5206;&#x79BB;&#x7EC4;&#x7EC7; d 14 &#x5C81;&#x800C;&#x4E0D;&#x662F; 1 &#x4E2A;&#x6708;&#x5C81;&#x6210;&#x719F;&#x690D;&#x7269;&#x7684;&#x5E7C;&#x82D7;&#xFF0C;&#x672C;&#x6587;&#x63CF;&#x8FF0;&#x7684;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x662F;&#x8FC5;&#x901F; (&#x56E0;&#x4E3A;&#x5B83;&#x53EA;&#x63A5;&#x53D7;&#x4ECE;&#x64AD;&#x79CD;&#x79CD;&#x5B50;&#x5230;&#x529F;&#x80FD;&#x7814;&#x7A76; 20 d)&#x3001; &#x9002;&#x5408;&#x7528;&#x4E8E;&#x5206;&#x6790;&#x591A;&#x4E2A;&#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x540C;&#x65F6;&#xFF0C;&#x548C;&#x72EC;&#x7ACB;&#x6210;&#x690D;&#x7269;&#x8868;&#x8FBE;&#x8F7D;&#x4F53;&#x7684;&#x514B;&#x9686; dsRNAs&#x3002;&#x56E0;&#x6B64;&#xFF0C;RNAi &#x5728;&#x539F;&#x751F;&#x8D28;&#x4F53;&#x4E2D;&#x8865;&#x5145;&#x4E86;&#x73B0;&#x6709;&#x7684;&#x9057;&#x4F20;&#x5DE5;&#x5177;&#xFF0C;&#x56E0;&#x4E3A;&#x5B83;&#x5141;&#x8BB8;&#x5FEB;&#x901F;&#x3001; &#x4F4E;&#x6210;&#x672C;&#x548C;&#x7A7A;&#x95F4;&#x6548;&#x7387;&#x7684;&#x521D;&#x6B65;&#x7B5B;&#x9009;&#x548C;&#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x9009;&#x62E9;&#x968F;&#x540E; planta &#x7814;&#x7A76;&#x4E2D;&#x3002;

&#x5EFA;&#x7ACB;&#x5728;&#x539F;&#x751F;&#x8D28;&#x4F53;&#x4E2D;&#x7684; RNA &#x5E72;&#x6270;&#x6280;&#x672F;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x4E00;&#x79CD;&#x53CD;&#x5411;&#x9057;&#x4F20;&#x57FA;&#x56E0;&#x529F;&#x80FD;&#x5206;&#x6790;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;

Double-stranded (ds)RNA interference (RNAi) is widely used for functional analysis of plant genes and is achieved via generating stable transformants expressing dsRNA in planta. This study demonstrated that RNAi can also be utilized to examine gene functions in protoplasts. Because protoplasts are nongrowing cells, effective RNAi-triggered gene silencing depends not only on a depletion of gene transcripts but also on turnover rates of corresponding polypeptides. Herein, we tested if transient RNAi in protoplasts would result in the depletion of a targeted polypeptide and, because protoplasts have a limited life span, if functional assays of RNAi knockout genes would be feasible in protoplasts. We showed that protoplasts transfection with an in vitro-synthesized dsRNA against Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) beta-glutamylcysteine synthase (ECS1), a key enzyme in the synthesis of glutathione, resulted in a 95% depletion of ECS1 transcript, a 72% decrease of ECS1 polypeptide, and a 60% drop in glutathione content. These results were comparable with those obtained upon analysis of Arabidopsis seedlings bearing the cad2-1 mutant allele of ECS1. We also improved the procedure for RNAi inactivation of several genes simultaneously. Finally, because we isolated protoplasts from tissues of 14-d-old seedlings instead of 1-month-old mature plants, the described procedure is rapid (as it only takes 20 d from seed planting to functional studies), suitable for analyzing multiple genes in parallel, and independent of cloning dsRNAs into plant expression vectors. Therefore, RNAi in protoplasts complements existing genetic tools, as it allows rapid, cost- and space-efficient initial screening and selection of genes for subsequent in planta studies.

Establishing RNA interference as a reverse-genetic approach for gene functional analysis in protoplasts.

Double brin (ds) l&#x26;#39;interf&#xE9;rence ARN (ARNi) est largement utilis&#xE9; pour l&#x26;#39;analyse fonctionnelle des g&#xE8;nes de plantes et est r&#xE9;alis&#xE9; par la g&#xE9;n&#xE9;ration des transformants stables exprimant ARNdb in planta. Cette &#xE9;tude a d&#xE9;montr&#xE9; que l&#x26;#39;ARNi peut &#xE9;galement &#xEA;tre utilis&#xE9;e pour examiner les fonctions des g&#xE8;nes dans des protoplastes. Parce que protoplastes sont nongrowing cellules, efficace gene silencing RNAi d&#xE9;clench&#xE9; d&#xE9;pend non seulement de l&#x26;#39;&#xE9;puisement des transcrits de g&#xE8;nes, mais aussi sur les taux de chiffre d&#x26;#39;affaires de polypeptides correspondants. Ici, nous avons test&#xE9; si transitoire ARNi dans les protoplastes se traduirait par l&#x26;#39;&#xE9;puisement d&#x26;#39;un polypeptide cible et, parce protoplastes ont une dur&#xE9;e de vie limit&#xE9;e, si les tests fonctionnels des g&#xE8;nes knock-out ARNi serait faisable dans les protoplastes. Nous avons montr&#xE9; que la transfection de protoplastes avec un synth&#xE9;tis&#xE9; in vitro contre les ARNdb Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) b&#xEA;ta-synthase glutamylcyst&#xE9;ine (ECS1), une enzyme cl&#xE9; dans la synth&#xE8;se du glutathion, a provoqu&#xE9; une diminution de 95% des ECS1 transcription, une diminution de 72% des ECS1 polypeptide, et une chute de 60% de la teneur en glutathion. Ces r&#xE9;sultats &#xE9;taient comparables &#xE0; ceux obtenus sur l&#x26;#39;analyse des plants d&#x26;#39;Arabidopsis portant l&#x26;#39;all&#xE8;le CAD2-1 mutante de ECS1. Nous avons &#xE9;galement am&#xE9;lior&#xE9; la proc&#xE9;dure pour l&#x26;#39;inactivation des g&#xE8;nes ARNi plusieurs simultan&#xE9;ment. Enfin, parce que nous avons isol&#xE9; des protoplastes &#xE0; partir de tissus de 14-d-plantules au lieu de 1-month-old plantes matures, la proc&#xE9;dure d&#xE9;crite est rapide (car il ne prend que 20 jours &#xE0; partir de plantation des semences &#xE0; des &#xE9;tudes fonctionnelles), adapt&#xE9;e &#xE0; l&#x26;#39;analyse des g&#xE8;nes multiples en parall&#xE8;le, et ind&#xE9;pendante de ARNdb clonage dans des vecteurs d&#x26;#39;expression de plantes. Par cons&#xE9;quent, l&#x26;#39;ARNi dans les protoplastes compl&#xE8;te les outils de la g&#xE9;n&#xE9;tique, car il permet rapidement, le co&#xFB;t et l&#x26;#39;espace-efficace de d&#xE9;pistage initial et la s&#xE9;lection des g&#xE8;nes pour la suite dans les &#xE9;tudes planta.

&#xC9;tablir l&#x26;#39;interf&#xE9;rence ARN comme une approche Reverse-g&#xE9;n&#xE9;tique pour analyse fonctionnelle des g&#xE8;nes dans des protoplastes

(Ds) doppelstr&auml;ngige RNA-Interferenz (RNAi) ist weit verbreitet f&uuml;r Funktionsanalyse von Pflanzengene und &uuml;ber die Generierung von stabilen Transformants Ausdr&uuml;cken sequenzspezifischen in Planta erzielt wird. Diese Studie zeigte, dass RNAi auch genutzt werden, kann um Genfunktionen in Urformen zu untersuchen. Da Urformen nongrowing Zellen sind, h&auml;ngt die effektive RNAi-ausgel&ouml;sten gen-silencing nicht nur auf eine Entleerung der Gen-Transkripte, sondern auch von Umsatz Preise der entsprechenden Polypeptide. Hierin, testeten wir wenn transiente RNAi in Urformen der Ersch&ouml;pfung der eine gezielte Polypeptid f&uuml;hren w&uuml;rde, und weil Urformen eine begrenzte Lebensdauer haben, wenn funktionelle Assays RNAi k.o. Gene in Urformen durchf&uuml;hrbar w&auml;re. Wir haben gezeigt, dass Urformen Transfektion mit einer in Vitro synthetisiert sequenzspezifischen gegen Arabidopsis (Arabidopsis Thaliana) Beta-Glutamylcystein-Synthase (ECS1), ein Schl&uuml;sselenzym bei der Synthese von Glutathion, resultierte in einem 95 % Ersch&ouml;pfung der ECS1 Abschrift, eine Senkung der ECS1 Polypeptid 72 % und eine 60 % R&uuml;ckgang der Glutathion-Inhalt. Diese Ergebnisse waren vergleichbar mit denjenigen bei der Analyse von Arabidopsis S&auml;mlinge mit der mutant cad2-1-Allel des ECS1. Wir haben auch gleichzeitig das Verfahren f&uuml;r RNAi Inaktivierung von mehreren Genen verbessert. Da wir Urformen aus Gewebe 14 d-alte S&auml;mlinge statt 1 Monate alten Reifen Pflanzen isoliert, das beschriebene Verfahren ist schlie&szlig;lich schnelle (wie es nur 20 d aus Samen Einpflanzen, Funktionsstudien dauert), geeignet zur Analyse von mehreren Genen parallel und unabh&auml;ngig von Klonen DsRNAs in Anlage Expressionsvektoren. Daher erg&auml;nzt RNAi in Urformen vorhandenen genetischen Tools, da es schnelle, Kosten - und platzsparend ersten Screening und Auswahl von Genen, die f&uuml;r nachfolgende in Planta Studien erlaubt.

&Uuml;ber RNA-Interferenz als umgekehrt-genetischer Ansatz f&uuml;r gen-Funktionsanalyse der Urformen.

Double-stranded (ds) interferenza del RNA (RNAi) &egrave; ampiamente usato per l&#39;analisi funzionale di geni vegetali ed &egrave; raggiunto tramite generazione di stabili transformants esprimendo dsRNA in planta. Questo studio ha dimostrato che la RNAi pu&ograve; essere utilizzato anche per esaminare le funzioni del gene in protoplasti. Perch&eacute; i protoplasti sono cellule nongrowing, silenziamento genico RNAi-innescato efficacia dipende non solo una deplezione dei trascritti del gene ma anche sui tassi di turnover dei polipeptidi corrispondente. Nel presente documento, abbiamo testato se RNAi transitori in protoplasti comporterebbe l&#39;esaurimento di un polipeptide mirato e, poich&eacute; i protoplasti hanno una durata di vita limitata, se le analisi funzionale di geni knockout RNAi sarebbe fattibile in protoplasti. Abbiamo mostrato che transfezione protoplasti con un a dsRNA sintetizzato in vitro contro Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) beta-glutamilcisteina sintetasi (ECS1), un enzima chiave nella sintesi del glutatione, ha provocato un impoverimento di 95% di trascrizione ECS1, una diminuzione del 72% del polipeptide ECS1 e un calo del 60% nel contenuto di glutatione. Questi risultati sono comparabili con quelli ottenuti su analisi di Arabidopsis piantine recanti l&#39;allele mutante cad2-1 di ECS1. Abbiamo anche migliorato la procedura per RNAi inattivazione di geni diversi contemporaneamente. Infine, perch&eacute; abbiamo isolato i protoplasti dai tessuti dei semenzali 14-d-vecchio invece di piante mature 1-mese-vecchio, la procedura descritta &egrave; rapida (ci vogliono solo 20 d dal seme alla piantagione a studi funzionali), adatto per analizzare i geni multipli in parallelo e indipendente della clonazione RNAds nei vettori di espressione di pianta. Pertanto, RNAi in protoplasti integra strumenti genetici esistenti, poich&egrave; permette lo screening iniziale e spazio-efficiente, rapido e selezione dei geni per successivi studi planta.

Istituzione di interferenza del RNA come un approccio genetico-reverse per l&#39;analisi funzionale del gene in protoplasti.

&#x4E8C;&#x672C;&#x9396;&#xFF08;ds&#xFF09;RNA&#x5E72;&#x6E09;&#xFF08;RNAi&#xFF09;&#x306F;&#x3001;&#x5E83;&#x304F;&#x690D;&#x7269;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x89E3;&#x6790;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x3001;&#x690D;&#x7269;&#x4F53;&#x3067;dsRNA&#x3092;&#x767A;&#x73FE;&#x3059;&#x308B;&#x5B89;&#x5B9A;&#x5F62;&#x8CEA;&#x8EE2;&#x63DB;&#x4F53;&#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x9054;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x672C;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x306F;RNAi&#x306F;&#x307E;&#x305F;&#x3001;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30C8;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3092;&#x8ABF;&#x3079;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x5229;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x5B9F;&#x8A3C;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30C8;&#x306F;&#x3001;&#x7D30;&#x80DE;&#x3092;nongrowing&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x3001;&#x52B9;&#x679C;&#x7684;&#x306A;RNAi&#x306E;&#x30C8;&#x30EA;&#x30AC;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x30B5;&#x30A4;&#x30EC;&#x30F3;&#x30B7;&#x30F3;&#x30B0;&#x306F;&#x3001;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x8EE2;&#x5199;&#x7523;&#x7269;&#x306E;&#x67AF;&#x6E07;&#x306B;&#x3082;&#x5BFE;&#x5FDC;&#x3059;&#x308B;&#x30DD;&#x30EA;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E;&#x96E2;&#x8077;&#x7387;&#x3067;&#x306F;&#x306A;&#x3044;&#x3060;&#x3051;&#x306B;&#x4F9D;&#x5B58;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002; RNAi&#x306E;&#x30CE;&#x30C3;&#x30AF;&#x30A2;&#x30A6;&#x30C8;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x7684;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306F;&#x3001;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30C8;&#x3067;&#x53EF;&#x80FD;&#x306B;&#x306A;&#x308B;&#x5834;&#x5408;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30C8;&#x306F;&#x3001;&#x9650;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x5BFF;&#x547D;&#x3092;&#x6301;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x306E;&#x3067;&#x3001;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30C8;&#x306E;&#x4E00;&#x6642;&#x7684;&#x306A;RNAi&#x306F;&#x3001;&#x6A19;&#x7684;&#x30DD;&#x30EA;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E;&#x67AF;&#x6E07;&#x306B;&#x306A;&#x308B;&#x304B;&#x3069;&#x3046;&#x30C6;&#x30B9;&#x30C8;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x30B7;&#x30ED;&#x30A4;&#x30CC;&#x30CA;&#x30BA;&#x30CA;&#x306B;&#x5BFE;&#x3057;&#x3066;in vitro&#x3067;&#x5408;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x305F;dsRNA&#x3067;&#x305D;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30C8;&#x306E;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A7;&#x30AF;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x305F;&#xFF08;&#x30B7;&#x30ED;&#x30A4;&#x30CC;&#x30CA;&#x30BA;&#x30CA;&#xFF09;&#x306E;&#x3B2;-&#x30B0;&#x30EB;&#x30BF;&#x30DF;&#x30EB;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x5408;&#x6210;&#x9175;&#x7D20;&#xFF08;ECS1&#xFF09;&#x3001;&#x30B0;&#x30EB;&#x30BF;&#x30C1;&#x30AA;&#x30F3;&#x306E;&#x5408;&#x6210;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x9175;&#x7D20;&#x306F;&#x3001;ECS1&#x8EE2;&#x5199;&#x7523;&#x7269;&#x306E;95&#xFF05;&#x306E;&#x67AF;&#x6E07;&#x3092;&#x3082;&#x305F;&#x3089;&#x3057;&#x3001;72&#xFF05;&#x6E1B;&#x5C11;&#x3057;&#x30DD;&#x30EA;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;ECS1&#x3001;&#x30B0;&#x30EB;&#x30BF;&#x30C1;&#x30AA;&#x30F3;&#x542B;&#x6709;&#x91CF;&#x306E;60&#xFF05;&#x3092;&#x30C9;&#x30ED;&#x30C3;&#x30D7;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;ECS1&#x306E;cad2-1&#x5909;&#x7570;&#x5BFE;&#x7ACB;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x3092;&#x6709;&#x3059;&#x308B;&#x30B7;&#x30ED;&#x30A4;&#x30CC;&#x30CA;&#x30BA;&#x30CA;&#x5B9F;&#x751F;&#x306E;&#x5206;&#x6790;&#x6642;&#x306B;&#x5F97;&#x3089;&#x308C;&#x308B;&#x3082;&#x306E;&#x3068;&#x540C;&#x7B49;&#x3067;&#x3042;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x307E;&#x305F;&#x3001;&#x540C;&#x6642;&#x306B;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;RNAi&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x624B;&#x9806;&#x3092;&#x6539;&#x5584;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;14-D-&#x82D7;&#x306E;&#x4EE3;&#x308F;&#x308A;&#x306B;1&#x30F6;&#x6708;&#x6B73;&#x306E;&#x6210;&#x719F;&#x3057;&#x305F;&#x690D;&#x7269;&#x306E;&#x7D44;&#x7E54;&#x304B;&#x3089;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30C8;&#x3092;&#x5358;&#x96E2;&#x3057;&#x305F;&#x306E;&#x3067;&#x3001;&#x6700;&#x5F8C;&#x306B;&#x8AAC;&#x660E;&#x3059;&#x308B;&#x624B;&#x9806;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x8907;&#x6570;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x3092;&#x5206;&#x6790;&#x3059;&#x308B;&#x306E;&#x306B;&#x9069;&#x3057;&#x305F;&#x3001;&#xFF08;&#x305D;&#x308C;&#x304C;&#x552F;&#x4E00;&#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x306B;&#x690D;&#x3048;&#x308B;&#x7A2E;&#x304B;&#x3089;20 d&#x3092;&#x53D6;&#x308B;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#xFF09;&#x8FC5;&#x901F;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x4E26;&#x884C;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x690D;&#x7269;&#x767A;&#x73FE;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306B;&#x30AF;&#x30ED;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x3059;&#x308B;dsRNA&#x306E;&#x72EC;&#x7ACB;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x305D;&#x308C;&#x306F;&#x690D;&#x7269;&#x4F53;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x306F;&#x5F8C;&#x7D9A;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x8FC5;&#x901F;&#x3001;&#x4F4E;&#x30B3;&#x30B9;&#x30C8;&#x3068;&#x30B9;&#x30DA;&#x30FC;&#x30B9;&#x52B9;&#x7387;&#x306B;&#x512A;&#x308C;&#x305F;&#x521D;&#x671F;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x3068;&#x9078;&#x629E;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3057;&#x305F;&#x304C;&#x3063;&#x3066;&#x3001;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30C8;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;RNAi&#x306F;&#x3001;&#x65E2;&#x5B58;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x30C4;&#x30FC;&#x30EB;&#x3092;&#x88DC;&#x5B8C;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30C8;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x6A5F;&#x80FD;&#x89E3;&#x6790;&#x306E;&#x9006;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B66;&#x7684;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x3001;RNA&#x5E72;&#x6E09;&#x3092;&#x78BA;&#x7ACB;&#x3059;&#x308B;

&#xB354;&#xBE14;-&#xC88C;&#xCD08; (ds) RNA &#xAC04;&#xC12D; (RNAi) &#xC2DD;&#xBB3C; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xAE30;&#xB2A5; &#xBD84;&#xC11D;&#xC744; &#xC704;&#xD574; &#xB110;&#xB9AC; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB418; &#xACE0; &#xC548;&#xC815;&#xC801;&#xC778; transformants planta&#xC5D0; Dsrna&#xB97C; &#xD45C;&#xD604; &#xC0DD;&#xC131;&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; &#xC774;&#xB8E8;&#xC5B4;&#xC9D1;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xC2DC;&#xC5F0; RNAi protoplasts &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xAE30;&#xB2A5; &#xAC80;&#xC0AC;&#xB3C4; &#xC774;&#xC6A9; &#xB420; &#xC218; &#xC788;&#xB2E4;. Protoplasts nongrowing &#xC138;&#xD3EC; &#xC774;&#xAE30; &#xB54C;&#xBB38;&#xC5D0;, &#xD6A8;&#xACFC;&#xC801;&#xC778; RNAi &#xC720;&#xBC1C; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xCE68;&#xBB35; &#xBFD0;&#xB9CC; &#xC544;&#xB2C8;&#xB77C; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC131;&#xC801;&#xD45C;&#xC758; &#xACE0;&#xAC08;&#xC5D0; &#xBFD0;&#xB9CC; &#xC544;&#xB2C8;&#xB77C; &#xD574;&#xB2F9; polypeptides&#xC758; &#xC774;&#xC9C1; &#xB960;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; &#xB2E4;&#xB985;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xD14C;&#xC2A4;&#xD2B8; protoplasts &#xACFC;&#xB3C4; RNAi &#xD0C0;&#xAC9F;&#xB41C; polypeptide &#xACE0;&#xAC08; &#xB420; &#xACBD;&#xC6B0; &#xBC0F; protoplasts &#xC788;&#xAE30; &#xB54C;&#xBB38;&#xC5D0; &#xC81C;&#xD55C; &#xB41C; &#xC218;&#xBA85;, RNAi &#xB179;&#xC544;&#xC6C3; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xAE30;&#xB2A5; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8; protoplasts&#xC5D0; &#xC2E4;&#xD604; &#xB420; &#xAC83; &#xC774;&#xB77C;&#xACE0; &#xD558;&#xB294; &#xACBD;&#xC6B0;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xADF8; protoplasts transfection&#xC5D0; &#xC2DC;&#xD5D8;&#xAD00; &#xD569;&#xC131; dsRNA Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) &#xBCA0;&#xD0C0;-glutamylcysteine synthase (ECS1), &#xADC0;&#xCC29;&#xB418; &#xC5C8; &#xB2E4; ECS1 &#xC0AC;&#xBCF8;, ECS1 polypeptide&#xC758; 72% &#xAC10;&#xC18C; glutathione &#xCF58;&#xD150;&#xCE20; 60% &#xAC10;&#xC18C;&#xC758; 95% &#xACE0;&#xAC08; glutathione&#xC758; &#xD569;&#xC131;&#xC758; &#xC8FC;&#xC694; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC5D0; &#xB300;&#xD574; &#xD568;&#xAED8; &#xBCF4;&#xC600;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xACB0;&#xACFC; Arabidopsis &#xBB18; &#xBCA0;&#xC5B4;&#xB9C1;&#xC758; ECS1 cad2 1 &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xCCB4; &#xB300;&#xB9BD; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xBD84;&#xC11D;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; &#xC5BB;&#xC740; &#xADF8;&#xC640; &#xBE44;&#xAD50; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xB610;&#xD55C; &#xB3D9;&#xC2DC;&#xC5D0; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; RNAi &#xBE44;&#xD65C;&#xC131;&#xD654;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC808;&#xCC28; &#xAC1C;&#xC120;. &#xB9C8;&#xC9C0;&#xB9C9;&#xC73C;&#xB85C;, 1 &#xAC1C;&#xC6D4; &#xC131;&#xC219;&#xD55C; &#xC2DD;&#xBB3C; &#xB300;&#xC2E0; 14 d &#xB41C; &#xBB18; &#xBAA9;&#xC758; &#xC870;&#xC9C1;&#xC5D0;&#xC11C; protoplasts &#xC808;&#xC5F0; &#xC6B0;&#xB9AC; &#xB54C;&#xBB38;&#xC5D0; &#xC124;&#xBA85; &#xB41C; &#xC808;&#xCC28;&#xB294; &#xC2E0;&#xC18D; &#xD558; &#xAC8C; (&#xB85C; &#xAC78;&#xB9AC;&#xB294; &#xAE30;&#xB2A5; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0; &#xC2EC;&#xB294; &#xC528;&#xC557;&#xC5D0;&#xC11C; 20 d), &#xB3D9;&#xC2DC;&#xC5D0; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xAC1C;&#xC758; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xB97C; &#xBD84;&#xC11D; &#xD558;&#xB294; &#xB370; &#xC801;&#xD569; &#xD558; &#xACE0; dsRNAs &#xACF5;&#xC7A5; &#xC2DD; &#xBCA1;&#xD130;&#xC5D0; &#xD074;&#xB85C;&#xB2DD;&#xC758; &#xB3C5;&#xB9BD;. &#xB530;&#xB77C;&#xC11C;, protoplasts&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; RNAi &#xADF8;&#xAC83; &#xD6C4;&#xC18D; planta &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xB294; &#xC2E0;&#xC18D; &#xD558; &#xAC8C;, &#xBE44;&#xC6A9; &#xBC0F; &#xACF5;&#xAC04; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC778; &#xCD08;&#xAE30; &#xAC80;&#xC0AC; &#xBC0F; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD5C8;&#xC6A9; &#xAE30;&#xC874; &#xC720;&#xC804; &#xB3C4;&#xAD6C;&#xB97C; &#xBCF4;&#xC644; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Protoplasts&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; RNA &#xBC29;&#xD574; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xAE30;&#xB2A5; &#xBD84;&#xC11D;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xC5ED; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC811;&#xADFC; &#xBC29;&#xC2DD;&#xC73C;&#xB85C; &#xC124;&#xC815;.

De doble cadena (ds) RNA de interferencia (ARNi) es ampliamente utilizado para el an&#xE1;lisis funcional de genes de plantas y se logra a trav&#xE9;s de la generaci&#xF3;n de transformantes estables que expresan dsRNA en planta. Este estudio demostr&#xF3; que RNAi tambi&#xE9;n se puede utilizar para examinar las funciones de genes en protoplastos. Debido a que los protoplastos se estacionaria c&#xE9;lulas, a partir de RNAi activada por el silenciamiento de genes no s&#xF3;lo depende de un agotamiento de las transcripciones de genes, sino tambi&#xE9;n en las tasas de rotaci&#xF3;n de los polip&#xE9;ptidos correspondientes. Aqu&#xED;, la prueba si RNAi transitoria en protoplastos se traducir&#xED;a en la disminuci&#xF3;n de un polip&#xE9;ptido espec&#xED;fico y, por protoplastos tienen una vida &#xFA;til limitada, si los ensayos funcionales de los genes knockout ARNi ser&#xED;a factible en protoplastos. Hemos demostrado que la transfecci&#xF3;n de protoplastos con un in vitro sintetizado dsRNA contra Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) beta-glutamilciste&#xED;na sintasa (ECS1), una enzima clave en la s&#xED;ntesis de glutati&#xF3;n, dio como resultado un agotamiento del 95% de ECS1 transcripci&#xF3;n, una disminuci&#xF3;n del 72% de polip&#xE9;ptido ECS1, y una ca&#xED;da de 60% en el contenido de glutati&#xF3;n. Estos resultados son comparables con los obtenidos en el an&#xE1;lisis de pl&#xE1;ntulas de Arabidopsis con el alelo CAD2-1 mutante de ECS1. Tambi&#xE9;n hemos mejorado el procedimiento para la inactivaci&#xF3;n de RNAi de varios genes simult&#xE1;neamente. Por &#xFA;ltimo, ya que se aislaron protoplastos a partir de tejidos de 14 d&#xED;as de pl&#xE1;ntulas en lugar de plantas maduras de 1 mes de edad, el procedimiento descrito es r&#xE1;pida (ya que s&#xF3;lo tiene 20 d&#xED;as a partir de semillas de siembra a los estudios funcionales), adecuado para el an&#xE1;lisis de m&#xFA;ltiples genes en paralelo, e independiente de dsRNAs clonaci&#xF3;n en vectores de expresi&#xF3;n de plantas. Por lo tanto, el ARNi en protoplastos complementa las herramientas gen&#xE9;ticas, ya que permite una r&#xE1;pida, econ&#xF3;mica y eficiente el espacio de selecci&#xF3;n inicial y la selecci&#xF3;n de genes para la posterior en los estudios de planta.

El establecimiento de la interferencia de ARN como un enfoque de gen&#xE9;tica inversa para el an&#xE1;lisis funcional de genes en protoplastos

&#x87AF;&#x8C03;&#x89E3;&#x7531;&#x6DB2;&#x6CE1;&#x6210;&#x87AF;&#x5408;&#x7EDC;&#x91D1;&#x5C5E;&#x914D;&#x5408;&#x7269;&#x5BF9;&#x690D;&#x7269;&#x548C;&#x4E00;&#x4E9B;&#x771F;&#x83CC;&#x4E2D;&#x91CD;&#x91D1;&#x5C5E;&#x8010;&#x53D7;&#x6027;&#x3002;&#x5230;&#x76EE;&#x524D;&#x4E3A;&#x6B62;&#xFF0C;&#x53EA;&#x6709;&#x7C9F;&#x9152; Hmt1 &#x5DF2;&#x88AB;&#x63CF;&#x8FF0;&#x4E3A;&#x87AF;&#x519C;&#x7528;&#x8FD0;&#x8F93;&#x8F66;&#x548C;&#x5C1D;&#x8BD5;&#xFF0C;&#x4ECE;&#x800C;&#x786E;&#x5B9A; orthologous &#x7EDC;&#x8F6C;&#x8FD0;&#x86CB;&#x767D;&#x5728;&#x690D;&#x7269;&#x548C;&#x5176;&#x4ED6;&#x751F;&#x7269;&#x6709;&#x5931;&#x8D25;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x6700;&#x8FD1;&#x7684;&#x6570;&#x636E;&#x8868;&#x660E; hmt1 &#x7A81;&#x53D8;&#x79EF;&#x7D2F;&#x5927;&#x87AF;&#x5408;&#x80BD;&#x6C34;&#x5E73;&#x7684;&#x6DB2;&#x6CE1;&#xFF0C;&#x6697;&#x793A;&#x4E0D;&#x660E;&#x7684;&#x7EDC;&#x8F6C;&#x8FD0;&#x86CB;&#x767D;&#x5B58;&#x5728;&#x4E8E;&#x771F;&#x83CC;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x663E;&#x793A;&#x5220;&#x9664;&#x6240;&#x6709;&#x6DB2;&#x6CE1; ABC &#x8F6C;&#x8FD0;&#x4F53;&#x7684;&#x5E9F;&#x9664;&#x7EDC; S.&#x6B96;&#x9175;&#x6BCD;&#x6DB2;&#x6CE1;&#x4E2D;&#x7684;&#x79EF;&#x7D2F;&#x548C;&#x5E9F;&#x9664; (35)S-PC(2) S.&#x6B96;&#x9175;&#x6BCD;&#x5FAE;&#x7C92;&#x4F53;&#x5C0F;&#x6CE1;&#x6210;&#x7684;&#x5438;&#x6536;&#x3002;&#x6574;&#x4E2A; S.&#x6B96;&#x9175;&#x6BCD; ABC &#x8F6C;&#x8FD0;&#x86CB;&#x767D;&#x5BB6;&#x65CF;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x5206;&#x6790;&#x786E;&#x5B9A; Abc2 &#x4E3A;&#x5168;&#x5C3A;&#x5BF8;&#x7684; ABC &#x8F6C;&#x8FD0; (&#x7D22;&#x507F;&#x578B;) &#x4ECB;&#x5BFC;&#x690D;&#x7269;&#x7EDC;&#x5408;&#x7D20;&#x8FD0;&#x8F93;&#x5230;&#x6DB2;&#x6CE1;&#x3002;S.&#x6B96;&#x9175;&#x6BCD; abc1 abc2 abc3 abc4 hmt1 &#x4E94;&#x8054;&#x548C; abc2 hmt1 &#x53CC;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x5728;&#x6DB2;&#x6CE1;&#x4E2D;&#x663E;&#x793A;&#x6CA1;&#x6709;&#x63A2;&#x6D4B;&#x87AF;&#x3002;Abc2 &#x8868;&#x8FBE;&#x5F0F;&#x5C06;&#x8FD8;&#x539F;&#x5230;&#x6DB2;&#x6CE1;&#x690D;&#x7269;&#x7EDC;&#x5408;&#x7D20;&#x79EF;&#x7D2F;&#x5E76;&#x6291;&#x5236;&#x9549;&#x654F;&#x611F;&#x6027;&#x7684; abc &#x4E94;&#x8054;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x3002;Hmt1 GS &#x5171;&#x8F6D;&#x8FD0;&#x8F93;&#x4E2D;&#x7684;&#x4E00;&#x4E2A;&#x65B0;&#x9896;&#x3001; &#x610F;&#x5916;&#xFF0C;&#x51FD;&#x6570;&#x4E5F;&#x4F1A;&#x663E;&#x793A;&#x3002;&#x4E0E; Hmt1&#xFF0C;Abc2 orthologs &#x738B;&#x56FD;&#x5E7F;&#x4E3A;&#x6563;&#x53D1;&#xFF0C;&#x5E76;&#x5EFA;&#x8BAE;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x957F;&#x671F;&#x5BFB;&#x6C42;&#x6DB2;&#x6CE1;&#x690D;&#x7269;&#x7EDC;&#x5408;&#x7D20;&#x8F6C;&#x8FD0;&#x4F53;&#x690D;&#x7269;&#x548C;&#x5176;&#x4ED6;&#x751F;&#x7269;&#x3002;

&#x6DB2;&#x6CE1;&#x819C;&#x672C;&#x5730;&#x5316; Abc2 &#x8F6C;&#x8FD0;&#x86CB;&#x767D;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x7EDC;&#x6DB2;&#x6CE1;&#x4E2D;&#x7684;&#x79EF;&#x7D2F;&#x548C;&#x8D4B;&#x4E88;&#x9549;&#x7684;&#x8010;&#x53D7;&#x3002;

Phytochelatins mediate tolerance to heavy metals in plants and some fungi by sequestering phytochelatin-metal complexes into vacuoles. To date, only Schizosaccharomyces pombe Hmt1 has been described as a phytochelatin transporter and attempts to identify orthologous phytochelatin transporters in plants and other organisms have failed. Furthermore, recent data indicate that the hmt1 mutant accumulates significant phytochelatin levels in vacuoles, suggesting that unidentified phytochelatin transporters exist in fungi. Here, we show that deletion of all vacuolar ABC transporters abolishes phytochelatin accumulation in S. pombe vacuoles and abrogates (35)S-PC(2) uptake into S. pombe microsomal vesicles. Systematic analysis of the entire S. pombe ABC transporter family identified Abc2 as a full-size ABC transporter (ABCC-type) that mediates phytochelatin transport into vacuoles. The S. pombe abc1 abc2 abc3 abc4 hmt1 quintuple and abc2 hmt1 double mutant show no detectable phytochelatins in vacuoles. Abc2 expression restores phytochelatin accumulation into vacuoles and suppresses the cadmium sensitivity of the abc quintuple mutant. A novel, unexpected, function of Hmt1 in GS-conjugate transport is also shown. In contrast to Hmt1, Abc2 orthologs are widely distributed among kingdoms and are proposed as the long-sought vacuolar phytochelatin transporters in plants and other organisms.

Tonoplast-localized Abc2 transporter mediates phytochelatin accumulation in vacuoles and confers cadmium tolerance.

Phytoch&#xE9;latines m&#xE9;diation tol&#xE9;rance aux m&#xE9;taux lourds dans les plantes et certains champignons en s&#xE9;questrant phytoch&#xE9;latine complexes de m&#xE9;taux dans les vacuoles. &#xC0; ce jour, seulement Hmt1 Schizosaccharomyces pombe a &#xE9;t&#xE9; d&#xE9;crit comme un transporteur phytoch&#xE9;latine et tente d&#x26;#39;identifier les transporteurs orthologue phytoch&#xE9;latine dans les plantes et autres organismes ont &#xE9;chou&#xE9;. En outre, des donn&#xE9;es r&#xE9;centes indiquent que le mutant accumule d&#x26;#39;importants niveaux hmt1 phytoch&#xE9;latine dans les vacuoles, ce qui sugg&#xE8;re que les transporteurs non identifi&#xE9;s phytoch&#xE9;latine existent dans les champignons. Ici, nous montrons que la suppression de tous les transporteurs ABC vacuolaires abolit l&#x26;#39;accumulation dans les vacuoles phytoch&#xE9;latine S. pombe et abroge (35) S-PC (2) absorption dans des v&#xE9;sicules de S. pombe microsomales. L&#x26;#39;analyse syst&#xE9;matique de la famille S. pombe transporteur ABC ensemble identifi&#xE9; en tant que transporteur ABC2 pleine grandeur ABC (ABCC-type) que le transport de m&#xE9;diateur dans les vacuoles des phytoch&#xE9;latines. Le S. pombe abc1 abc2 abc3 abc4 hmt1 quintuple et abc2 hmt1 spectacle double mutant pas phytoch&#xE9;latines d&#xE9;tectables dans les vacuoles. ABC2 expression restaure l&#x26;#39;accumulation dans les vacuoles des phytoch&#xE9;latines et supprime la sensibilit&#xE9; au cadmium de la quintuple mutant abc. Un roman, inattendu, en fonction de Hmt1 en GS-conjugu&#xE9; de transport est &#xE9;galement montr&#xE9;. Contrairement &#xE0; Hmt1, ABC2 orthologues sont largement distribu&#xE9;s parmi les royaumes et sont propos&#xE9;s comme les recherch&#xE9;s depuis longtemps par les transporteurs vacuolaires phytoch&#xE9;latine dans les plantes et autres organismes.

Tonoplaste-localis&#xE9;es m&#xE9;diateur Transporter ABC2 accumulation dans les vacuoles et phytoch&#xE9;latine conf&#xE8;re la tol&#xE9;rance au cadmium

Phytochelatine vermitteln Toleranz gegen&uuml;ber Schwermetallen in Pflanzen und einige Pilze durch Phytochelatine-Metall-komplexe in Vakuolen absondern. Bis heute konnten nur Schizosaccharomyces Pombe Hmt1 wurde als Transporter Phytochelatine beschrieben und versucht, Orthologous Phytochelatine Transporter in Pflanzen und andere Organismen zu identifizieren. Dar&uuml;ber hinaus zufolge den j&uuml;ngsten Daten der Mutant hmt1 sammelt sich erhebliche Phytochelatine Ebenen in Vakuolen, darauf hindeutet, dass nicht identifizierter Phytochelatine Transporter in Pilze vorhanden sind. Hier zeigen wir, dass l&ouml;schen alle welches ABC-Transporter Phytochelatine Anh&auml;ufung in S. Pombe Vakuolen schafft und (35)S-PC(2) Aufnahme in S. Pombe mikrosomale Bl&auml;schen hebt. Systematischer Analyse der gesamten S. Pombe ABC Transporter Familie identifiziert Abc2 als ein Full-Size ABC-Transporter (ABCC-Typ), der Phytochelatine Transport in Vakuolen vermittelt. Die S. Pombe abc1 abc2 abc3 abc4 hmt1 5-fach und abc2 hmt1 Doppel Mutant zeigen keine nachweisbaren Phytochelatine Vakuolen. Abc2 Ausdruck stellt Phytochelatine Anh&auml;ufung in Vakuolen und unterdr&uuml;ckt die Kadmium-Empfindlichkeit von den Abc-5-fach-Mutanten. Eine neue, unerwartete, Funktion der Hmt1 im GS-Konjugat Verkehr wird auch angezeigt. Im Gegensatz zum Hmt1 Abc2 Orthologen sind weit verbreitet unter den K&ouml;nigreichen und werden als die lang ersehnte welches Phytochelatine-Transporter in Pflanzen und andere Organismen vorgeschlagen.

Tonoplast lokalisierte Abc2 Transporter vermittelt Phytochelatine Anh&auml;ufung in Vakuolen und Kadmium Toleranz verleiht.

Fitochelatine mediare tolleranza ai metalli pesanti in piante e alcuni funghi sequestrando complessi fitochelatina-metallo nei vacuoli. Ad oggi, solo Schizosaccharomyces pombe Hmt1 &egrave; stato descritto come un trasportatore fitochelatina e tenta di identificare orthologous fitochelatina trasportatori in piante e altri organismi hanno fallito. Inoltre, dati recenti indicano che il mutante hmt1 accumula fitochelatina significativi livelli nei vacuoli, suggerendo che i trasportatori non identificato fitochelatina esistano nei funghi. Qui, ci mostrano che la cancellazione di tutti i trasportatori ABC vacuolar abolisce fitochelatina accumulo nei vacuoli di S. pombe e abroga (35)S-PC(2) assorbimento in vescicole microsomiale S. pombe. Analisi sistematica dell&#39;intera famiglia S. pombe ABC transporter identificato Abc2 come un trasportatore ABC Full-Size (ABCC-tipo) che media fitochelatina trasporto nei vacuoli. Lo S. pombe abc1 abc2 abc3 abc4 hmt1 quintuple e abc2 hmt1 doppio mutante non visualizza fitochelatine rilevabili nei vacuoli. Abc2 espressione Ripristina fitochelatina accumulo nei vacuoli e sopprime la sensibilit&agrave; di cadmio del mutante quintuple abc. Viene mostrata anche una funzione di romanzo, inaspettata, di Hmt1 nei trasporti GS-coniugato. A differenza di Hmt1, Abc2 orthologs sono ampiamente distribuiti tra i regni e vengono proposti come i trasportatori fitochelatina vacuolar lungo cercato in piante e altri organismi.

Localizzato tonoplasto Abc2 transporter da intermediario fitochelatina accumulo nei vacuoli e conferisce tolleranza di cadmio.

Phytochelatins&#x306F;&#x6DB2;&#x80DE;&#x306B;&#x9694;&#x96E2;phytochelatin&#x91D1;&#x5C5E;&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x690D;&#x7269;&#x3084;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306E;&#x771F;&#x83CC;&#x306E;&#x91CD;&#x91D1;&#x5C5E;&#x306B;&#x5BFE;&#x3059;&#x308B;&#x8010;&#x6027;&#x3092;&#x5A92;&#x4ECB;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x73FE;&#x5728;&#x307E;&#x3067;&#x306B;&#x3001;&#x552F;&#x4E00;&#x306E;&#x5206;&#x88C2;&#x9175;&#x6BCD;&#x306E;Hmt1&#x306F;phytochelatin&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x8A18;&#x8F09;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x690D;&#x7269;&#x3084;&#x4ED6;&#x306E;&#x751F;&#x7269;&#x306B;&#x30AA;&#x30EB;&#x30BD;&#x30ED;&#x30AC;&#x30B9;phytochelatin&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x3092;&#x540C;&#x5B9A;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x8A66;&#x307F;&#x304C;&#x5931;&#x6557;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x3001;&#x6700;&#x8FD1;&#x306E;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x306F;&#x3001;&#x6B63;&#x4F53;&#x4E0D;&#x660E;&#x306E;phytochelatin&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x306F;&#x771F;&#x83CC;&#x306B;&#x5B58;&#x5728;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3001;hmt1&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x306F;&#x6DB2;&#x80DE;&#x306E;&#x8457;&#x3057;&#x3044;phytochelatin&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x3092;&#x84C4;&#x7A4D;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x3059;&#x3079;&#x3066;&#x306E;&#x6DB2;&#x80DE;&#x306E;ABC&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x6B20;&#x5931;&#x306F;&#x3001;S. pombe&#x306E;&#x7A7A;&#x80DE;&#x3068;abrogates&#xFF08;35&#xFF09;S-PC&#xFF08;2&#xFF09;&#x5206;&#x88C2;&#x9175;&#x6BCD;&#x306E;&#x30DF;&#x30AF;&#x30ED;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x5C0F;&#x80DE;&#x3078;&#x306E;&#x53D6;&#x308A;&#x8FBC;&#x307F;&#x306B;phytochelatin&#x84C4;&#x7A4D;&#x3092;&#x5EC3;&#x6B62;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5168;&#x4F53;&#x306E;&#x5206;&#x88C2;&#x9175;&#x6BCD;&#x306E;ABC&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x30D5;&#x30A1;&#x30DF;&#x30EA;&#x30FC;&#x306E;&#x4F53;&#x7CFB;&#x7684;&#x5206;&#x6790;&#x306F;&#x3001;&#x6DB2;&#x80DE;&#x3078;&#x306E;&#x8F38;&#x9001;&#x3092;&#x4EF2;&#x4ECB;&#x3059;&#x308B;phytochelatin&#x305D;&#x306E;&#x30D5;&#x30EB;&#x30B5;&#x30A4;&#x30BA;&#x306E;ABC&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#xFF08;ABCC&#x578B;&#xFF09;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x3001;ABC2&#x3092;&#x540C;&#x5B9A;&#x3057;&#x305F;&#x3002; S. pombe&#x306E;&#x4E94;&#x91CD;ABC1 ABC2 ABC3 abc4 hmt1&#x3068;ABC2 hmt1&#x4E8C;&#x91CD;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x306F;&#x6DB2;&#x80DE;&#x3067;&#x306F;&#x691C;&#x51FA;phytochelatins&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x306A;&#x3044;&#x3002; ABC2&#x306E;&#x5F0F;&#x306F;&#x3001;&#x6DB2;&#x80DE;&#x306B;&#x84C4;&#x7A4D;phytochelatin&#x3092;&#x5FA9;&#x5143;&#x3057;&#x3001;&#x4E94;&#x91CD;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;ABC&#x306E;&#x30AB;&#x30C9;&#x30DF;&#x30A6;&#x30E0;&#x306E;&#x611F;&#x5EA6;&#x3092;&#x6291;&#x5236;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002; GS-&#x5171;&#x5F79;&#x8F38;&#x9001;Hmt1&#x306E;&#x5C0F;&#x8AAC;&#x3001;&#x4E88;&#x671F;&#x3057;&#x306A;&#x3044;&#x3001;&#x95A2;&#x6570;&#x3082;&#x8868;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002; Hmt1&#x3068;&#x306F;&#x5BFE;&#x7167;&#x7684;&#x306B;&#x3001;ABC2&#x30AA;&#x30EB;&#x30BD;&#x30ED;&#x30B0;&#x306F;&#x5E83;&#x304F;&#x738B;&#x56FD;&#x306E;&#x9593;&#x3067;&#x5206;&#x6563;&#x3055;&#x308C;&#x3001;&#x690D;&#x7269;&#x3084;&#x4ED6;&#x306E;&#x751F;&#x7269;&#x3067;&#x5FF5;&#x9858;&#x306E;&#x6DB2;&#x80DE;phytochelatin&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x63D0;&#x6848;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x6DB2;&#x80DE;&#x819C;&#x306B;&#x30ED;&#x30FC;&#x30AB;&#x30E9;&#x30A4;&#x30BA;&#x3055;&#x308C;&#x305F;ABC2 Transporter&#x306E;&#x4EF2;&#x4ECB;&#x80DE;&#x3067;Phytochelatin&#x84C4;&#x7A4D;&#x3068;&#x30AB;&#x30C9;&#x30DF;&#x30A6;&#x30E0;&#x8010;&#x6027;&#x3092;&#x4ED8;&#x4E0E;&#x3059;&#x308B;

Phytochelatins phytochelatin &#xAE08;&#xC18D; &#xBCF5;&#xD569;&#xBB3C; vacuoles&#xB85C; &#xBD09;&#xC1C4;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC2DD;&#xBB3C;&#xACFC; &#xC77C;&#xBD80; &#xADE0;&#xC758; &#xC911; &#xAE08;&#xC18D; &#xD5C8;&#xC6A9; &#xC911;&#xC7AC;. &#xC9C0;&#xAE08;&#xAE4C;&#xC9C0; Schizosaccharomyces pombe Hmt1 phytochelatin &#xC804;&#xC1A1;&#xC73C;&#xB85C; &#xC124;&#xBA85; &#xD558; &#xACE0; &#xC2DD;&#xBB3C; &#xBC0F; &#xB2E4;&#xB978; &#xC720;&#xAE30; &#xCCB4;&#xC5D0;&#xC11C; orthologous phytochelatin &#xC804;&#xC1A1;&#xAE30;&#xB97C; &#xD655;&#xC778; &#xD558;&#xB824;&#xACE0; &#xC2DC;&#xB3C4; &#xD558;&#xC9C0; &#xBABB;&#xD588;&#xB2E4;. &#xB610;&#xD55C;, &#xCD5C;&#xADFC; &#xB370;&#xC774;&#xD130;&#xB294; hmt1 &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xCD95;&#xC801; vacuoles&#xC5D0;&#xC11C; &#xC218;&#xC900; &#xC0C1;&#xB2F9;&#xD55C; phytochelatin &#xC81C;&#xC548; &#xD558;&#xB294; &#xC815;&#xCCB4; &#xBD88;&#xBA85;&#xB41C; phytochelatin &#xC804;&#xC1A1;&#xAE30; &#xACF0; &#xD321;&#xC774;&#xC5D0; &#xC874;&#xC7AC; &#xD558;&#xB294; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0C5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xBAA8;&#xB4E0; vacuolar ABC &#xC804;&#xC1A1;&#xAE30;&#xC758; &#xC0AD;&#xC81C; S. pombe vacuoles&#xC5D0; &#xB204;&#xC801; &#xB41C; phytochelatin&#xB97C; &#xB9D0;&#xC0B4; &#xD558; &#xACE0; &#xB418;&#xC5B4;&#xC788;&#xB294; (35)S-PC(2) S. pombe microsomal vesicles&#xB85C; &#xD638;&#xC751;&#xC744; &#xC5BB; &#xC5C8;. &#xC804;&#xCCB4; S. pombe ABC transporter &#xC81C;&#xD488;&#xAD70;&#xC758; &#xCCB4;&#xACC4;&#xC801;&#xC778; &#xBD84;&#xC11D; Abc2 vacuoles&#xB97C; phytochelatin &#xC804;&#xC1A1; &#xC911;&#xC7AC; &#xD480; &#xC0AC;&#xC774;&#xC988; ABC &#xC804;&#xC1A1; (ABCC &#xD0C0;&#xC785;) &#xC2DD;&#xBCC4; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. S. pombe abc1 abc2 abc3 abc4 hmt1 5 &#xBC30;&#xC758; abc2 hmt1 &#xC774;&#xC911; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; vacuoles&#xC5D0;&#xC11C; &#xAC10;&#xC9C0;&#xD560; &#xC218; &#xC5C6;&#xB294; phytochelatins&#xB97C; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. Abc2 &#xC2DD; phytochelatin &#xCD95;&#xC801; vacuoles &#xBCF5;&#xC6D0; &#xD558; &#xACE0; abc 5 &#xBC30;&#xC758; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774;&#xC758; &#xCE74;&#xB4DC;&#xBBB4; &#xAC10;&#xB3C4; &#xD45C;&#xC2DC; &#xD558;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC18C;&#xC124;, &#xC608;&#xAE30;&#xCE58; &#xC54A;&#xC740;, GS-&#xACF5;&#xC561; &#xC804;&#xC1A1;&#xC5D0;&#xC11C; hmt1&#xC758; &#xAE30;&#xB2A5; &#xD45C;&#xC2DC; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. Hmt1, &#xB2EC;&#xB9AC; Abc2 orthologs &#xC655;&#xAD6D; &#xC0AC;&#xC774;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAD11;&#xBC94;&#xC704; &#xD558; &#xAC8C; &#xBC30;&#xD3EC; &#xD558; &#xACE0; &#xC2DD;&#xBB3C;&#xACFC; &#xB2E4;&#xB978; &#xC720;&#xAE30; &#xCCB4;&#xC5D0;&#xC11C; vacuolar phytochelatin &#xAE34; &#xBAA8;&#xC0C9; &#xC6B4;&#xC1A1;&#xC5C5; &#xC81C;&#xC548;.

Tonoplast &#xC9C0;&#xC5ED;&#xD654; Abc2 &#xC804;&#xC1A1; vacuoles&#xC5D0; &#xB204;&#xC801; &#xB41C; phytochelatin&#xB97C; &#xC911;&#xC7AC; &#xD558; &#xACE0; &#xCE74;&#xB4DC;&#xBBB4; &#xD5C8;&#xC6A9; &#xC624;&#xCC28;&#xB97C; &#xC218; &#xC5EC;.

Fitoquelatinas mediar en la tolerancia a metales pesados &#x200B;&#x200B;en las plantas y algunos hongos por el secuestro de fitoquelatina met&#xE1;licos complejos en las vacuolas. Hasta la fecha, s&#xF3;lo Hmt1 Schizosaccharomyces pombe se ha descrito como un transportador de fitoquelatina y los intentos para identificar los transportadores de ort&#xF3;logos fitoquelatina en plantas y otros organismos han fracasado. Adem&#xE1;s, datos recientes indican que el mutante hmt1 acumula niveles significativos de fitoquelatina en vacuolas, lo que sugiere que los transportistas no identificados fitoquelatina existen en los hongos. Aqu&#xED;, mostramos que la supresi&#xF3;n de todos los transportadores ABC suprime la acumulaci&#xF3;n vacuolar fitoquelatina en vacuolas S. pombe y deja sin efecto (35) S-PC (2) la captaci&#xF3;n en ves&#xED;culas microsomales S. pombe. El an&#xE1;lisis sistem&#xE1;tico de toda la familia de transportadores ABC S. pombe abc2 identificados como transportador de tama&#xF1;o completo ABC (ABCC-tipo) que el transporte de media fitoquelatina en vacuolas. El S. pombe ABC1 ABC2 abc3 abc4 hmt1 qu&#xED;ntuple y abc2 hmt1 espect&#xE1;culo doble mutante no fitoquelatinas detectables en las vacuolas. Abc2 restaura la expresi&#xF3;n de la acumulaci&#xF3;n en las vacuolas fitoquelatina y suprime la sensibilidad de cadmio de la qu&#xED;ntuple mutante abc. Una novela, la funci&#xF3;n inesperada, de Hmt1 en el GS-conjugado de transporte tambi&#xE9;n se muestra. En contraste con Hmt1, abc2 orthologs est&#xE1;n ampliamente distribuidos entre los reinos y se proponen como la tan buscada transportadores vacuolares fitoquelatina en plantas y otros organismos.

Tonoplasto localizados ABC2 media la acumulaci&#xF3;n Transporter fitoquelatina en las vacuolas y confiere tolerancia cadmio

(Ds) &#x53CC;&#x94FE; RNA &#x5E72;&#x6270; (RNAi) &#x5E7F;&#x6CDB;&#x7528;&#x4F5C;&#x690D;&#x7269;&#x57FA;&#x56E0;&#x529F;&#x80FD;&#x5206;&#x6790;&#x7684;&#x4E00;&#x79CD;&#x53CD;&#x5411;&#x9057;&#x4F20;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;&#x901A;&#x8FC7;&#x751F;&#x6210;&#x7A33;&#x5B9A;&#x690D;&#x682A;&#x8868;&#x793A; dsRNAs &#x6216;&#x4EBA;&#x5DE5; Microrna (amiRNAs) &#x8DB3;&#x5E95;&#x6216;&#x7531;&#x75C5;&#x6BD2;&#x8BF1;&#x5BFC;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x6C89;&#x9ED8; &#xFF08;VIGS&#xFF09; &#x53D6;&#x5F97;&#x4E86;&#x672C;&#x6784;&#x6216;&#x77AC;&#x6001; RNAi &#x4F5C;&#x7528;&#x7684;&#x690D;&#x7269;&#x3002;&#x867D;&#x7136;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x5DE5;&#x5177;&#x4E3A;&#x529F;&#x80FD;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x5B66;&#x63D0;&#x4F9B;&#x4F18;&#x79C0;&#x7684;&#x8D44;&#x6E90;&#xFF0C;&#x4ED6;&#x4EEC;&#x9700;&#x8981;&#x8F7D;&#x4F53;&#x8868;&#x8FBE; dsRNAs &#x6216; amiRNAs &#x5BF9;&#x76EE;&#x6807;&#x57FA;&#x56E0;&#x8F6C;&#x5316;&#x548C;&#x8F6C;&#x57FA;&#x56E0;&#x690D;&#x682A;&#x7684;&#x7E41;&#x6B96;&#x6216;&#x591A;&#x4E2A; VIGS &#x7EBF;&#x8DEF;&#x7EF4;&#x62A4;&#x7684;&#x4E00;&#x4EE3;&#xFF0C;&#x4ECE;&#x800C;&#x65BD;&#x52A0;&#x65F6;&#x95F4;&#x3001; &#x52B3;&#x52A8;&#x529B;&#x548C;&#x7A7A;&#x95F4;&#x8981;&#x6C42;&#x3002;&#x6B63;&#x5982;&#x6211;&#x4EEC;&#x6700;&#x8FD1;&#x6240;&#x663E;&#x793A;&#xFF0C;&#x53EF;&#x4EE5;&#x901A;&#x8FC7;&#x8BF1;&#x5BFC;&#x539F;&#x751F;&#x8D28;&#x4F53;&#x901A;&#x8FC7;&#x8F6C;&#x67D3;&#x4E0E;&#x5B83;&#x4EEC;&#x5728;&#x4F53;&#x5916;&#x5408;&#x6210; dsRNAs RNAi &#x6548;&#x5E94;&#x89C4;&#x907F;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x9650;&#x5236;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x4E00;&#x7AE0;&#x4E2D;&#x6211;&#x4EEC;&#x8BE6;&#x7EC6;&#x8BF4;&#x660E;&#x77AC;&#x6001;&#x57FA;&#x56E0;&#x6C89;&#x9ED8;&#x7684;&#x539F;&#x751F;&#x8D28;&#x4F53;&#x4F7F;&#x7528;&#x5408;&#x6210; dsRNAs &#x7A0B;&#x5E8F;&#xFF0C;&#x5E76;&#x4E3A;&#x540E;&#x7EED;&#x7684;&#x529F;&#x80FD;&#x5206;&#x6790;&#x63D0;&#x4F9B;&#x529E;&#x6CD5;&#x7684;&#x5B9E;&#x4F8B;&#x3002;

&#x76F4;&#x63A5;&#x5408;&#x6210;&#x7684;&#x53CC;&#x94FE; RNA &#x8F6C;&#x79FB;&#x5230;&#x62DF;&#x5357;&#x82A5;&#x539F;&#x751F;&#x8D28;&#x4F53;&#x3002;

Double-stranded (ds) RNA interference (RNAi) is widely used as a reverse genetic approach for functional analysis of plant genes. Constitutive or transient RNAi effects in plants have been achieved via generating stable transformants expressing dsRNAs or artificial microRNAs (amiRNAs) in planta or by viral-induced gene silencing (VIGS). Although these tools provide outstanding resources for functional genomics, they require generation of vectors expressing dsRNAs or amiRNAs against targeted genes, transformation and propagation of transformed plants, or maintenance of multiple VIGS lines and thus impose time, labor, and space requirements. As we showed recently, these limitations can be circumvented by inducing RNAi effects in protoplasts via transfecting them with in vitro-synthesized dsRNAs. In this chapter we detail the procedure for transient gene silencing in protoplasts using synthetic dsRNAs and provide examples of approaches for subsequent functional analyses.

Direct transfer of synthetic double-stranded RNA into protoplasts of Arabidopsis thaliana.

Double brin (ds) l&#x26;#39;interf&#xE9;rence ARN (ARNi) est largement utilis&#xE9; comme une approche de g&#xE9;n&#xE9;tique inverse pour l&#x26;#39;analyse fonctionnelle des g&#xE8;nes de plantes. Constitutifs ou transitoire des effets ARNi dans les usines ont &#xE9;t&#xE9; r&#xE9;alis&#xE9;s par la g&#xE9;n&#xE9;ration des transformants stables exprimant ARNdb ou microARN artificiels (amiRNAs) in planta ou par gene silencing d&#x26;#39;origine virale (VIGS). Bien que ces outils offrent les meilleures ressources pour la g&#xE9;nomique fonctionnelle, dont ils ont besoin g&#xE9;n&#xE9;ration de vecteurs exprimant ARNdb ou amiRNAs contre g&#xE8;nes cibl&#xE9;s, la transformation et la propagation des plantes transform&#xE9;es, ou l&#x26;#39;entretien de lignes de VIGS multiples et imposent donc des temps, de travail, et les besoins en espace. Comme nous l&#x26;#39;avons montr&#xE9; r&#xE9;cemment, ces limitations peuvent &#xEA;tre contourn&#xE9;es par induire des effets ARNi dans des protoplastes par les transfecter avec ARNdb synth&#xE9;tis&#xE9;s in vitro. Dans ce chapitre, nous d&#xE9;taillons la proc&#xE9;dure d&#x26;#39;inactivation de g&#xE8;ne passag&#xE8;re dans les protoplastes en utilisant ARNdb synth&#xE9;tiques et des exemples d&#x26;#39;approches pour la suite des analyses fonctionnelles.

Transfert direct d&#x26;#39;synth&#xE9;tiques d&#x26;#39;ARN double brin dans des protoplastes d&#x26;#39;Arabidopsis thaliana

(Ds) doppelstr&auml;ngige RNA-Interferenz (RNAi) ist als umgekehrte genetischer Ansatz f&uuml;r Funktionsanalyse von Pflanzengene verbreitet. Konstitutive oder transiente RNAi-Effekte in Pflanzen wurden erreicht, &uuml;ber stabile Transformants DsRNAs oder k&uuml;nstlichen MicroRNAs (AmiRNAs) in Planta oder von viral-induzierte gen-silencing (VIGS) generieren. Obwohl diese Tools f&uuml;r funktionelle Genomik hervorragende Ressourcen bereitstellen, sie erfordern Generation von Vektoren Ausdr&uuml;cken, DsRNAs oder AmiRNAs gegen gezielte Gene, Transformation und Vermehrung der transformierte Pflanzen und Erhaltung der VIGS Mehrfachlinien und somit zu verh&auml;ngen, Zeit, Arbeit und Platzbedarf. Wie wir k&uuml;rzlich gezeigt hat, k&ouml;nnen diese Einschr&auml;nkungen umgangen werden, durch RNAi-Effekte in Urformen &uuml;ber transfecting mit in Vitro synthetisiert DsRNAs induzieren. In diesem Kapitel haben wir detailliert das Verfahren f&uuml;r transient-gen-silencing in Urformen mit synthetischen DsRNAs und geben Sie Beispiele f&uuml;r Ans&auml;tze f&uuml;r sp&auml;tere Funktionsanalysen.

Direkte &Uuml;bertragung von synthetischen doppelstr&auml;ngige RNA in Urformen von Arabidopsis Thaliana.

Double-stranded (ds) interferenza del RNA (RNAi) &egrave; ampiamente usato come un approccio di genetico inverso per l&#39;analisi funzionale dei geni della pianta. Costitutivi o transitori effetti di RNAi in piante sono stati raggiunti tramite generazione di stabili transformants esprimendo RNAds o microRNA artificiali (amiRNAs) in planta o dal gene virale indotta silenziamento (VIGS). Sebbene questi strumenti forniscono risorse eccezionali per la genomica funzionale, essi richiedono la generazione di vettori che esprimono RNAds o amiRNAs contro geni mirate, trasformazione e moltiplicazione delle piante trasformate, o manutenzione di linee multiple VIGS e quindi imporre requisiti di spazio tempo e manodopera. Come abbiamo mostrato recentemente, queste limitazioni possono essere aggirate da indurre RNAi effetti in protoplasti tramite loro con transfecting di RNAds sintetizzato in vitro. In questo capitolo abbiamo dettaglio la procedura per il silenziamento genico transitorio in protoplasti utilizzando RNAds sintetici e fornire esempi di approcci per successive analisi funzionale.

Trasferimento diretto di sintetico double-stranded RNA in protoplasti di Arabidopsis thaliana.

&#x4E8C;&#x672C;&#x9396;&#xFF08;ds&#xFF09;RNA&#x5E72;&#x6E09;&#xFF08;RNAi&#xFF09;&#x306F;&#x3001;&#x5E83;&#x304F;&#x690D;&#x7269;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x89E3;&#x6790;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x9006;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B66;&#x7684;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x690D;&#x7269;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x69CB;&#x6210;&#x7684;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x4E00;&#x6642;&#x7684;&#x306A;RNAi&#x52B9;&#x679C;&#x306F;&#x690D;&#x7269;&#x4F53;&#x3084;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x8A98;&#x767A;&#x6027;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x30B5;&#x30A4;&#x30EC;&#x30F3;&#x30B7;&#x30F3;&#x30B0;&#xFF08;VIGS&#xFF09;&#x306B;&#x3088;&#x308B;dsRNA&#x306F;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x4EBA;&#x5DE5;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;RNA&#xFF08;amiRNAs&#xFF09;&#x3092;&#x767A;&#x73FE;&#x3059;&#x308B;&#x5B89;&#x5B9A;&#x306A;&#x5F62;&#x8CEA;&#x8EE2;&#x63DB;&#x4F53;&#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x9054;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x30C4;&#x30FC;&#x30EB;&#x306F;&#x3001;&#x6A5F;&#x80FD;&#x30B2;&#x30CE;&#x30DF;&#x30AF;&#x30B9;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x512A;&#x308C;&#x305F;&#x30EA;&#x30BD;&#x30FC;&#x30B9;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x304C;&#x3001;&#x5F7C;&#x3089;&#x306F;&#x9396;dsRNA&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x6A19;&#x7684;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x3001;&#x5F62;&#x8CEA;&#x8EE2;&#x63DB;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x5F62;&#x8CEA;&#x8EE2;&#x63DB;&#x690D;&#x7269;&#x306E;&#x4F1D;&#x64AD;&#x306B;&#x5BFE;&#x3057;&#x3066;amiRNAs&#x3092;&#x767A;&#x73FE;&#x3059;&#x308B;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x751F;&#x6210;&#x3001;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x8907;&#x6570;&#x306E;VIGS&#x30E9;&#x30A4;&#x30F3;&#x306E;&#x30E1;&#x30F3;&#x30C6;&#x30CA;&#x30F3;&#x30B9;&#x3092;&#x5FC5;&#x8981;&#x3068;&#x3057;&#x3001;&#x5F93;&#x3063;&#x3066;&#x6642;&#x9593;&#x3001;&#x52B4;&#x529B;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30B9;&#x30DA;&#x30FC;&#x30B9;&#x306E;&#x8981;&#x4EF6;&#x3092;&#x8AB2;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x304C;&#x6700;&#x8FD1;&#x793A;&#x3057;&#x305F;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x5236;&#x9650;&#x306F;&#x3001;in vitro&#x3067;&#x5408;&#x6210;&#x3057;&#x305F;dsRNA&#x306F;&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A7;&#x30AF;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30C8;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;RNAi&#x52B9;&#x679C;&#x3092;&#x8A98;&#x5C0E;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x56DE;&#x907F;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x8A73;&#x7D30;&#x5408;&#x6210;dsRNA&#x3092;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30C8;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x4E00;&#x904E;&#x6027;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x30B5;&#x30A4;&#x30EC;&#x30F3;&#x30B7;&#x30F3;&#x30B0;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x624B;&#x9806;&#x3092;&#x3053;&#x306E;&#x7AE0;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x5F8C;&#x7D9A;&#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x89E3;&#x6790;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x306E;&#x4F8B;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

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&#xB354;&#xBE14;-&#xC88C;&#xCD08; (ds) RNA &#xAC04;&#xC12D; (RNAi) &#xC2DD;&#xBB3C; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xAE30;&#xB2A5; &#xBD84;&#xC11D;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC5ED;&#xBC29;&#xD5A5; &#xC720;&#xC804;&#xC801; &#xBC29;&#xBC95;&#xC73C;&#xB85C; &#xB110;&#xB9AC; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC548;&#xC815;&#xC801;&#xC778; transformants dsRNAs &#xB610;&#xB294; &#xC778;&#xACF5;&#xC801;&#xC778; microRNAs (amiRNAs) planta &#xB610;&#xB294; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xC720;&#xB3C4; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xCE68;&#xBB35; (VIGS) &#xD558; &#xC5EC; &#xD45C;&#xD604; &#xC0DD;&#xC131;&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; &#xC2DD;&#xBB3C;&#xC5D0; &#xC81C;&#xC815; &#xB610;&#xB294; &#xC77C;&#xC2DC;&#xC801;&#xC778; RNAi &#xD6A8;&#xACFC; &#xB2EC;&#xC131;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xB3C4;&#xAD6C; &#xAE30;&#xB2A5; &#xC720;&#xC804;&#xCCB4;&#xD559;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xB6F0;&#xC5B4;&#xB09C; &#xB9AC;&#xC18C;&#xC2A4;&#xB97C; &#xC81C;&#xACF5;, &#xBE44;&#xB85D; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC740; dsRNAs &#xB610;&#xB294; &#xD0C0;&#xAC9F;&#xB41C; &#xC720;&#xC804;&#xC790;, &#xBCC0;&#xD658; &#xD558; &#xACE0; &#xBCC0;&#xD658; &#xB41C; &#xC2DD;&#xBB3C;&#xC758; &#xC804;&#xD30C; &#xB610;&#xB294; &#xC5EC;&#xB7EC; VIGS &#xB77C;&#xC778;&#xC758; &#xC720;&#xC9C0; &#xAD00;&#xB9AC;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; Amirnas&#xC744; &#xD45C;&#xD604; &#xD558;&#xB294; &#xBCA1;&#xD130;&#xC758; &#xC0DD;&#xC131;&#xC744; &#xC694;&#xAD6C; &#xD558; &#xACE0; &#xB530;&#xB77C;&#xC11C; &#xC2DC;&#xAC04;, &#xB178;&#xB3D9; &#xBC0F; &#xACF5;&#xAC04; &#xC694;&#xAD6C; &#xC0AC;&#xD56D;&#xC744; &#xBD80;&#xACFC;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xCD5C;&#xADFC;&#xC5D0; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC900; &#xC2DC;&#xD5D8;&#xAD00; &#xD569;&#xC131; Dsrnas&#xC5D0;&#xC11C; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC744; transfecting&#xB97C; &#xD1B5;&#xD574; protoplasts&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; RNAi &#xD6A8;&#xACFC; &#xC720;&#xB3C4; &#xD558; &#xC5EC; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC81C;&#xD55C; &#xD53C;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC7A5;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBCC0;&#xC774; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xD569;&#xC131; Dsrnas&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; protoplasts&#xC5D0;&#xC11C; &#xC785;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xC808;&#xCC28;&#xC5D0; &#xC790;&#xC138;&#xD788; &#xC124;&#xBA85; &#xD558; &#xACE0; &#xD6C4;&#xC18D; &#xAE30;&#xB2A5; &#xBD84;&#xC11D;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xC811;&#xADFC; &#xBC29;&#xBC95;&#xC758; &#xC608;&#xB97C; &#xC81C;&#xACF5; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Arabidopsis thaliana&#xC758; protoplasts&#xB85C; &#xD569;&#xC131; &#xC774;&#xC911; &#xAC00;&#xB2E5; RNA&#xC758; &#xC9C1;&#xC811; &#xC804;&#xC1A1; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

De doble cadena (ds) RNA de interferencia (ARNi) es ampliamente utilizado como un m&#xE9;todo de gen&#xE9;tica inversa para el an&#xE1;lisis funcional de genes de plantas. RNAi efectos constitutivos o transitoria en las plantas se han logrado a trav&#xE9;s de la generaci&#xF3;n de transformantes estables que expresan ARN de doble cadena o microRNAs artificiales amiRNAs) en la planta o por el silenciamiento g&#xE9;nico inducido por virus (VIGS). A pesar de estas herramientas proporcionan los recursos pendientes de la gen&#xF3;mica funcional, que requieren la generaci&#xF3;n de vectores que expresan ARN de doble cadena o amiRNAs contra determinados genes, la transformaci&#xF3;n y la propagaci&#xF3;n de las plantas transformadas, o el mantenimiento de las l&#xED;neas de VIGS m&#xFA;ltiples e imponer as&#xED; el tiempo, el trabajo y las necesidades de espacio. Como mostramos recientemente, estas limitaciones pueden ser evitados mediante la inducci&#xF3;n de los efectos de RNAi en protoplastos a trav&#xE9;s de la transfecci&#xF3;n con ARN de doble cadena in vitro de s&#xED;ntesis. En este cap&#xED;tulo se detalla el procedimiento para el silenciamiento del gen transitoria en protoplastos utilizando ARN de doble cadena sint&#xE9;tico y dar ejemplos de enfoques para los subsiguientes an&#xE1;lisis funcionales.

Zhiyang Zhai

Crop and Soil Sciences

Cornell University

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Zhiyang Zhai

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Cornell University

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Crop and Soil Sciences