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Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

University of Washington

In cyclic nucleotide-gated (CNG) ion channels, binding of cGMP or cAMP drives a conformational change that leads to opening of an ion-conducting pore. One region implicated in the coupling of ligand binding to opening of the pore is the C linker region. Here, we used crosslinking of endogenous cysteines to study interregion proximity. We demonstrate that an individual amino acid--C481--in the C linker region of each of two neighboring subunits can form a disulfide bond. Further, using tandem dimers, we show that a disulfide bond between C35 in the N-terminal region and C481 in the C linker region can form either within a subunit or between subunits. From our data on proximity between individual amino acids and previous studies, a picture emerges of the C linker as a potential dimerization interface.

Dissecting intersubunit contacts in cyclic nucleotide-gated ion channels.

Dans cyclique nucl&eacute;otides (CNG) ion canaux, liaison du cGMP ou cAMP am&egrave;ne un changement de conformation qui m&egrave;ne &agrave; l&#39;ouverture d&#39;un pore de conducteurs d&#39;ions. Une des r&eacute;gions impliqu&eacute;es dans le couplage de la liaison du ligand &agrave; l&#39;ouverture du pore est la r&eacute;gion d&#39;&eacute;diteur de liens C. Ici, nous avons utilis&eacute; la r&eacute;ticulation des cyst&eacute;ines endog&egrave;nes pour &eacute;tudier la proximit&eacute; interregion. Nous d&eacute;montrons qu&#39;un aminoacide individuel--C481--dans la r&eacute;gion d&#39;&eacute;diteur de liens C de chacun des deux sous-unit&eacute;s voisines peuvent former un pont disulfure. En outre, &agrave; l&#39;aide de dim&egrave;res de tandem, nous montrons qu&#39;une liaison disulfure entre C35 dans la r&eacute;gion N-terminale et C481 dans la r&eacute;gion d&#39;&eacute;diteur de liens C peut se former dans une sous-unit&eacute; ou entre sous-unit&eacute;s. De nos donn&eacute;es sur la proximit&eacute; entre les diff&eacute;rents acides amin&eacute;s et les &eacute;tudes ant&eacute;rieures, une image se d&eacute;gage de l&#39;&eacute;diteur de liens C comme une interface de dim&eacute;risation potentiels.

Nombre de contacts dans les canaux ioniques de d&eacute;coupage en nucl&eacute;otides cycliques de dissection.

In cyclic nucleotide-gated (CNG) scanalature dello ione, associazione di cGMP o campo unit&agrave; un cambiamento conformazionale che porta all&#39;apertura di un poro ionico-conducendo. Una regione implicata nell&#39;accoppiamento dell&#39;associazione ligando all&#39;apertura del poro &egrave; la regione di linker C. Qui, abbiamo usato reticolazione delle cisteine endogeni per studiare vicinanza interregion. Dimostriamo che un singolo amminoacido - C481 - nella regione linker C di ciascuna delle due subunit&agrave; adiacenti possono formare un legame disolfuro. Ulteriormente, utilizzando dimeri tandem, mostrano che un ponte disolfuro tra C35 nella regione N-terminale e C481 nella regione linker C pu&ograve; formare all&#39;interno di una subunit&agrave; o tra le subunit&agrave;. Dai nostri dati sulla prossimit&agrave; tra i singoli amminoacidi e precedenti studi, emerge un quadro di linker C come interfaccia di dimerizzazione potenziali.

Intersubunit contatti in scanalature dello ione nucleotide-gated ciclica di dissezione.

The capsaicin (vanilloid) receptor, VR1, is an agonist-activated ion channel expressed by sensory neurons that serves as a detector of chemical and thermal noxious stimuli.

Subunit modification and association in VR1 ion channels.

Le r&eacute;cepteur de la capsa&iuml;cine (VANILLO&Iuml;DE), VR1, est un canal ionique activ&eacute; par agoniste exprim&eacute; par les neurones sensoriels qui sert un d&eacute;tecteur de stimuli nociceptifs chimiques et thermiques.

Modification de la sous-unit&eacute; et l&#39;association canaux ioniques VR1.

Il recettore della capsaicina (vanilloidi), VR1, &egrave; un canale di ioni agonista-attivato espresso dai neuroni sensoriali che serve come un rivelatore di stimoli nocivi chimiche e termiche.

Associazione in scanalature dello ione VR1 e modificazione della subunit&agrave;.

Cyclic nucleotide-gated (CNG) channels have been shown to be blocked by diltiazem, tetracaine, polyamines, toxins, divalent cations, and other compounds. Dequalinium is an organic divalent cation which suppresses the rat small conductance Ca(2+)-activated K(+) channel 2 (rSK2) and the activity of protein kinase C. In this study, we have tested the ability of dequalinium to block CNGA1 channels and heteromeric CNGA1+CNGB1 channels. When applied to the intracellular side of inside-out excised patches from Xenopus oocytes, dequalinium blocks CNGA1 channels with a K(1/2) approximately 190 nM and CNGA1+CNGB1 channels with a K(1/2) approximately 385 nM, at 0 mV. This block occurs in a state-independent fashion, and is voltage dependent with a zdelta approximately 1. Our data also demonstrate that dequalinium interacts with the permeant ion probably because it occupies a binding site in the ion conducting pathway. Dequalinium applied to the extracellular surface also produced block, but with a voltage dependence that suggests it crosses the membrane to block from the inside. We also show that at the single-channel level, dequalinium is a slow blocker that does not change the unitary conductance of CNGA1 channels. Thus, dequalinium should be a useful tool for studying permeation and gating properties of CNG channels.

Dequalinium: a novel, high-affinity blocker of CNGA1 channels.

Cyclique canaux (CNG) nucl&eacute;otides ont d&eacute;montr&eacute; d&#39;&ecirc;tre bloqu&eacute;e par le diltiazem, t&eacute;traca&iuml;ne, polyamines, toxines, les cations divalents et autres compos&eacute;s. Dequalinium est un cation divalent organique qui supprime le rat petite conductance k Ca(2+)-activ&eacute; du canal 2 (rSK2) et l&#39;activit&eacute; de la prot&eacute;ine kinase C. Dans cette &eacute;tude, nous avons test&eacute; la capacit&eacute; de d&eacute;qualinium de bloquer des cha&icirc;nes de CNGA1 et h&eacute;t&eacute;rom&eacute;rique CNGA1 + CNGB1. Lorsqu&#39;elle est appliqu&eacute;e du c&ocirc;t&eacute; intracellulaire des patchs excis&eacute;s dedans-dehors des ovocytes de Xenopus, D&eacute;qualinium bloque les canaux de CNGA1 avec un K(1/2) environ 190 nM et les canaux de CNGA1 + CNGB1 avec un K(1/2) environ 385 nM, &agrave; 0 mV. Ce bloc se produit de fa&ccedil;on ind&eacute;pendante de l&#39;&Eacute;tat et est la tension de charge avec un zdelta environ 1. Nos r&eacute;sultats d&eacute;montrent &eacute;galement que D&eacute;qualinium interagit avec l&#39;ion perm&eacute;ant, probablement parce qu&#39;elle occupe un site de liaison de l&#39;ion en voie de r&eacute;alisation. Dequalinium appliqu&eacute; sur la surface extracellulaire produit &eacute;galement bloc, mais avec une tension de d&eacute;pendance qui le sugg&egrave;re traverse la membrane de bloquer de l&#39;int&eacute;rieur. Nous montrons aussi que niveau monocanal, D&eacute;qualinium est un bloqueur lent qui ne change pas la conductance unitaire des canaux CNGA1. Ainsi, D&eacute;qualinium devrait &ecirc;tre un outil utile pour l&#39;&eacute;tude de perm&eacute;ation et blocage des propri&eacute;t&eacute;s des canaux CNG.

D&eacute;qualinium : un roman, haute affinit&eacute; bloqueur des canaux CNGA1.

Cyclic nucleotide-gated canali di (CNG) hanno dimostrati di essere bloccato da diltiazem, tetracaina, poliammine, tossine, cationi bivalenti e altri composti. Dequalinium &egrave; un catione bivalente organici che sopprime il ratto piccola conduttanza attivato Ca(2+) K(+) canale 2 (rSK2) e l&#39;attivit&agrave; della chinasi di proteina C. In questo studio, abbiamo testato la capacit&agrave; di bloccare i canali CNGA1 ed eteromerici CNGA1 + CNGB1 dequalinium. Quando viene applicato al lato intracellulare del inside-out patch escisse da ovociti di Xenopus, dequalinium Blocca canali CNGA1 con un K(1/2) circa 190 nM e canali CNGA1 + CNGB1 con un K(1/2) circa 385 nM, a 0 mV. Questo blocco si verifica in maniera indipendente dello stato ed &egrave; tensione dipendente con un zdelta circa 1. I nostri dati dimostrano anche che dequalinium interagisce con lo ione permeant probabilmente perch&eacute; occupa un sito di legame in ione conducendo pathway. Dequalinium applicato alla superficie extracellulare prodotta anche blocco, ma con una tensione di dipendenza che suggerisce attraversa la membrana per bloccare dall&#39;interno. Ci mostrano anche che a livello di singolo canale, dequalinium &egrave; un bloccante lento che non cambia la conduttanza unitaria dei canali CNGA1. Cos&igrave;, dequalinium dovrebbe essere uno strumento utile per studiare la permeazione e gating propriet&agrave; dei canali CNG.

Dequalinium: un romanzo, ad alta affinit&agrave; bloccanti dei canali CNGA1.

TRPV1 ion channels mediate the response to painful heat, extracellular acidosis, and capsaicin, the pungent extract from plants in the Capsicum family (hot chili peppers) (Szallasi, A., and P.M. Blumberg. 1999. Pharmacol. Rev. 51:159-212; Caterina, M.J., and D. Julius. 2001. Annu. Rev. Neurosci. 24:487-517). The convergence of these stimuli on TRPV1 channels expressed in peripheral sensory nerves underlies the common perceptual experience of pain due to hot temperatures, tissue damage and exposure to capsaicin. TRPV1 channels are nonselective cation channels (Caterina, M.J., M.A. Schumacher, M. Tominaga, T.A. Rosen, J.D. Levine, and D. Julius. 1997. Nature. 389:816-824). When activated, they produce depolarization through the influx of Na+, but their high Ca2+ permeability is also important for mediating the response to pain. In particular, Ca2+ influx is thought to be required for the desensitization to painful sensations over time (Cholewinski, A., G.M. Burgess, and S. Bevan. 1993. Neuroscience. 55:1015-1023; Koplas, P.A., R.L. Rosenberg, and G.S. Oxford. 1997. J. Neurosci. 17:3525-3537). Here we show that in inside-out excised patches from TRPV1 expressed in Xenopus oocytes and HEK 293 cells, Ca2+/calmodulin decreased the capsaicin-activated current. This inhibition was not mimicked by Mg2+, reflected a decrease in open probability, and was slowly reversible. Furthermore, increasing the calmodulin concentration in our patches by coexpression of wild-type calmodulin with TRPV1 produced inhibition by Ca2+ alone. In contrast, patches excised from cells coexpressing TRPV1 with a mutant calmodulin did not respond to Ca2+. Using an in vitro calmodulin-binding assay, we found that TRPV1 in oocyte lysates bound calmodulin, although in a Ca2+-independent manner. Experiments with GST-fusion proteins corresponding to regions of the channel NH2-terminal domain demonstrated that a stretch of approximately 30 amino acids adjacent to the first ankyrin repeat bound calmodulin in a Ca2+-dependent manner. The physiological response to pain involves an influx of Ca2+ through TRPV1. Our results indicate that this Ca2+ influx may feed back on the channels, inhibiting their gating. This type of feedback inhibition could play a role in the desensitization produced by capsaicin.

Ca2+/calmodulin modulates TRPV1 activation by capsaicin.

Canaux ioniques TRPV1 m&eacute;dier la r&eacute;ponse &agrave; la capsa&iuml;cine, le piquant extrait de plantes de la famille des Capsicum (hot chili peppers) chaleur douloureuse et acidose extracellulaire (Szallasi, A. et h. Blumberg. 1999. Pharmacol. Mgr 51:159-212 ; Caterina, M.J. et d. Julius. 2001. Annu. Rev Neurosci. 24:487-517). La convergence de ces stimuli sur les canaux de TRPV1 exprim&eacute;e dans les nerfs sensoriels p&eacute;riph&eacute;riques sous&#x2011;tend l&#39;exp&eacute;rience perceptive commune de douleurs dues &agrave; des temp&eacute;ratures &eacute;lev&eacute;es, des l&eacute;sions tissulaires et l&#39;exposition &agrave; la capsa&iuml;cine. TRPV1 cha&icirc;nes sont non s&eacute;lectifs cation (Caterina, M.J., M.A. Schumacher, M. Tominaga, T.A. Rosen, J.D. Levine et D. Julius. 1997. La nature. 389:816-824). Lorsqu&#39;il est activ&eacute;, ils produisent une d&eacute;polarisation par l&#39;afflux de Na +, mais leur perm&eacute;abilit&eacute; &eacute;lev&eacute;e de Ca2 + est aussi importante pour la m&eacute;diation de la r&eacute;action &agrave; la douleur. En particulier, influx de Ca2 + est consid&eacute;r&eacute;e comme n&eacute;cessaire pour la d&eacute;sensibilisation aux sensations p&eacute;nibles au fil du temps (Cholewinski, r., G.M. Burgess et S. Bevan. 1993. Neuroscience. 55:1015-1023 ; Koplas, P.A., R.L. Rosenberg et G.S. Oxford. 1997. J Neurosci. 17:3525-3537). Ici, nous montrons que dans inside-out excis&eacute; rustines de TRPV1 exprim&eacute;s dans des ovocytes de Xenopus et cellules HEK 293, Ca2 + / calmoduline diminue le courant activ&eacute; par la capsa&iuml;cine. Cette inhibition n&#39;est pas imit&eacute;e par Mg2 +, refl&egrave;te une diminution de la probabilit&eacute; d&#39;ouverture et est lentement r&eacute;versible. De plus, l&#39;augmentation de la concentration de la calmoduline dans nos patchs par coexpression de calmoduline sauvage avec TRPV1 produit l&#39;inhibition par le Ca2 + uniquement. En revanche, les patchs excis&eacute;s de cellules co-exprimant TRPV1 avec une mutante calmoduline n&#39;a pas r&eacute;pondu au Ca2 +. &Agrave; l&#39;aide d&#39;un test in vitro de liaison de la calmoduline, nous avons trouv&eacute; que TRPV1 dans les lysats ovocyte li&eacute; &agrave; la calmoduline, bien que dans un Ca2 +-mani&egrave;re ind&eacute;pendante. Des exp&eacute;riences avec des prot&eacute;ines de fusion GST correspondant aux r&eacute;gions du domaine canal NH2-terminal ont d&eacute;montr&eacute; qu&#39;un tron&ccedil;on d&#39;environ 30 acides amin&eacute;s adjacents &agrave; l&#39;ankyrin premi&egrave;re r&eacute;p&eacute;tition li&eacute; la calmoduline Ca2 +-fa&ccedil;on d&eacute;pendante. Les r&eacute;ponses physiologiques &agrave; la douleur implique un influx de Ca2 + par le biais de TRPV1. Nos r&eacute;sultats indiquent que cet afflux de Ca2 + peut se nourrir sur les canaux, inhibant leur processus de blocage. Ce type de r&eacute;tro-inhibition pourrait jouer un r&ocirc;le dans la d&eacute;sensibilisation produite par la capsa&iuml;cine.

Ca2 + / calmoduline module TRPV1 activation par la capsa&iuml;cine.

Canali ionici TRPV1 mediano la risposta alla capsaicina, il pungente Estratto da piante appartenenti alla famiglia Capsicum (hot chili peppers), acidosi extracellulare e calore doloroso (Szallasi, A. e P.M. Blumberg. 1999. Pharmacol. Rev. 51:159-212; Caterina, M.J. e d. Giulio. 2001. Annu. Rev Neurosci. 24:487-517). La convergenza di questi stimoli su canali TRPV1 espressi nei nervi sensoriali periferici sottende la comune esperienza percettiva del dolore a causa di temperature calde, danno tissutale e l&#39;esposizione alla capsaicina. TRPV1 canali sono canali non selettivi catione (Caterina, M.J., M.A. Schumacher, M. Tominaga, T.E. Rosen, J.D. Levine e D. Giulio. 1997. La natura. 389:816-824). Quando attivati, producono depolarizzazione attraverso l&#39;afflusso di Na +, ma la loro elevata permeabilit&agrave; Ca2 + &egrave; anche importante per mediare la risposta al dolore. In particolare, l&#39;afflusso di Ca2 + &egrave; pensato per essere richiesto per la desensibilizzazione alle sensazioni dolorose nel corso del tempo (Cholewinski, A., G.M. Burgess e S. Bevan. 1993. Neuroscience. 55:1015-1023; KOPLAS, P.A., R.L. Rosenberg e G.S. Oxford. 1997. J. Neurosci. 17:3525-3537). Qui mostriamo che in inside out escisse patch da TRPV1 espressa in ovociti di Xenopus e cellule HEK 293, Ca2 + calmodulina diminuita la corrente capsaicina-attivato. Questa inibizione non fu imitata da Mg2 +, riflette una diminuzione della probabilit&agrave; aperta e fu lentamente reversibile. Inoltre, l&#39;aumento della concentrazione di Calmodulina nella nostra patch da coexpression della calmodulina selvaggio-tipo con TRPV1 prodotto inibizione di Ca2 + da solo. In contrasto, patch escisse dalle cellule coexpressing TRPV1 con un mutante calmodulina non ha risposto al Ca2 +. Utilizzando un&#39;analisi in vitro della calmodulina-associazione, abbiamo trovato che TRPV1 nei lisati ovocita associato calmodulina, sebbene in un Ca2 +-modo indipendente. Esperimenti con proteine di GST-fusione corrispondenti alle regioni del dominio canale NH2-terminal ha dimostrato che un tratto di circa 30 aminoacidi adiacenti il primo ankyrin ripetere associato calmodulina in un Ca2 +-dipendente dal modo. La risposta fisiologica al dolore comporta un afflusso di Ca2 + attraverso TRPV1. I nostri risultati indicano che questo afflusso di Ca2 + pu&ograve; nutrire indietro sui canali, inibendo la loro gating. Questo tipo di inibizione feedback potrebbe svolgere un ruolo nella desensibilizzazione prodotta dalla capsaicina.

Ca2 + calmodulina modula TRPV1 attivazione di capsaicina.

Cyclic nucleotide-gated (CNG) ion channels are nonselective cation channels with a high permeability for Ca(2+). Not surprisingly, they are blocked by a number of Ca(2+) channel blockers including tetracaine, pimozide, and diltiazem. We studied the effects of dequalinium, an extracellular blocker of the small conductance Ca(2+)-activated K(+) channel. We previously noted that dequalinium is a high-affinity blocker of CNGA1 channels from the intracellular side, with little or no state dependence at 0 mV. Here we examined block by dequalinium at a broad range of voltages in both CNGA1 and CNGA2 channels. We found that dequalinium block was mildly state dependent for both channels, with the affinity for closed channels 3-5 times higher than that for open channels. Mutations in the S4-S5 linker did not alter the affinity of open channels for dequalinium, but increased the affinity of closed channels by 10-20-fold. The state-specific effect of these mutations raises the question of whether/how the S4-S5 linker alters the binding of a blocker within the ion permeation pathway.

State-dependent block of CNG channels by dequalinium.

D&eacute;coupage en nucl&eacute;otides cycliques canaux ioniques (CNG) est des canaux de cation non s&eacute;lectif avec une perm&eacute;abilit&eacute; &eacute;lev&eacute;e pour Ca(2+). Sans surprise, ils sont bloqu&eacute;s par un certain nombre d&#39;inhibiteurs des canaux calciques Ca(2+) y compris la t&eacute;traca&iuml;ne, pimozide et le diltiazem. Nous avons &eacute;tudi&eacute; les effets de d&eacute;qualinium, un inhibiteur extracellulaire de la conductance de petit canaux activ&eacute;s par Ca(2+) k. Nous avons remarqu&eacute; pr&eacute;c&eacute;demment que D&eacute;qualinium est un bloqueur de haute affinit&eacute; des canaux de CNGA1 du c&ocirc;t&eacute; intracellulaire, avec peu ou aucune d&eacute;pendance &Eacute;tat &agrave; 0 mV. Ici, nous avons examin&eacute; bloc de d&eacute;qualinium une large gamme de tensions dans les canaux des CNGA1 et CNGA2. Nous avons trouv&eacute; ce bloc D&eacute;qualinium &eacute;tait l&eacute;g&egrave;rement &Eacute;tat d&eacute;pendant pour les deux canaux, avec l&#39;affinit&eacute; pour les canaux ferm&eacute; 3 &agrave; 5 fois plus &eacute;lev&eacute; que celui des canaux ouverts. Mutations dans l&#39;&eacute;diteur de liens S4-S5 ne modifient pas l&#39;affinit&eacute; des canaux ouverts pour D&eacute;qualinium, mais augmente l&#39;affinit&eacute; des canaux ferm&eacute;s de 10 &agrave; 20 fois. L&#39;effet sp&eacute;cifique &agrave; l&#39;&eacute;tat de ces mutations soul&egrave;ve la question de savoir si/comment l&#39;&eacute;diteur de liens S4-S5 alt&egrave;re la liaison d&#39;un bloqueur dans la voie de perm&eacute;ation ion.

Bloc d&eacute;pendant de l&#39;&eacute;tat des canaux CNG de d&eacute;qualinium.

Nucleotide-gated cicliche (CNG) ione canali sono canali non selettivi catione con un&#39;elevata permeabilit&agrave; per Ca(2+). Non sorprendentemente, sono bloccati da un certo numero di bloccanti dei canali del Ca(2+) tetracaina, pimozide e diltiazem. Abbiamo studiato gli effetti di dequalinium, un bloccante extracellulare della conduttanza piccolo canale attivato Ca(2+) K(+). Abbiamo notato in precedenza che dequalinium &egrave; un bloccante ad alta affinit&agrave; dei canali CNGA1 dal lato intracellulare, con poca o nessuna dipendenza dello stato a 0 mV. Qui abbiamo esaminato il blocco di dequalinium presso un&#39;ampia gamma di tensioni in canali sia CNGA1 e CNGA2. Abbiamo trovato quel blocco dequalinium lievemente era stato dipendente per entrambi i canali, con affinit&agrave; per i canali chiusi 3 - 5 volte superiore a quella per i canali aperti. Mutazioni nel linker S4-S5 non alterava le affinit&agrave; di canali aperti per dequalinium, ma aumenta l&#39;affinit&agrave; dei canali chiusi da 10-20 volte. L&#39;effetto di dichiarare-specifici di queste mutazioni solleva la questione del se/come il linker S4-S5 altera il legame di un blocco entro il pathway di permeazione ionica.

Blocco di stato-dipendente dei canali CNG da dequalinium.

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels contribute to a wide range of physiological functions and regulate cardiac and neuronal pacemaker activity. Here, we review recent advances in three areas: the polarity of the S4 movement with hyperpolarization, the location of the activation gate, and the structure of the C-terminal C linker and CNBD.

Quickening the pace: looking into the heart of HCN channels.

Activ&eacute; par une hyperpolarisation cyclique nucl&eacute;otides (HCN) canaux contribue pour une large gamme de fonctions physiologiques et r&eacute;guler l&#39;activit&eacute; de stimulateur cardiaque et neuronale. Ici, nous passons en revue les progr&egrave;s r&eacute;cents dans trois domaines : la polarit&eacute; du mouvement avec l&#39;hyperpolarisation, l&#39;emplacement de la porte de l&#39;activation et la structure de l&#39;&eacute;diteur de liens C-terminal C et CNBD S4.

Acc&eacute;l&egrave;re le rythme : regarder au c&oelig;ur des canaux HCN.

Hyperpolarization-attivato cyclic nucleotide-gated (HCN) canali contribuiscono a una vasta gamma di funzioni fisiologiche e regolano attivit&agrave; di pacemaker cardiaco e neuronali. Qui, passiamo in rassegna i recenti progressi in tre aree: la polarit&agrave; del movimento S4 con hyperpolarization, la posizione del cancello di attivazione e la struttura del C-terminale C linker e CNBD.

Accelerare il ritmo: esaminando il cuore dei canali HCN.

Cyclic nucleotide-gated (CNG) channels are nonselective cation channels that are activated by the direct binding of the cyclic nucleotides cAMP and cGMP. The region linking the last membrane-spanning region (S6) to the cyclic nucleotide binding domain in the COOH terminus, termed the C-linker, has been shown to play an important role in coupling cyclic nucleotide binding to opening of the pore. In this study, we explored the intersubunit proximity between the A' helices of the C-linker regions of CNGA1 in functional channels using site-specific cysteine substitution. We found that intersubunit disulfide bonds can be formed between the A' helices in open channels, and that inducing disulfide bonds in most of the studied constructs resulted in potentiation of channel activation. This suggests that the A' helices of the C-linker regions are in close proximity when the channel is in the open state. Our finding is not compatible with a homology model of the CNGA1 C-linker made from the recently published X-ray crystallographic structure of the hyperpolarization-activated, cyclic nucleotide-modulated (HCN) channel COOH terminus, and leads us to suggest that the C-linker region depicted in the crystal structure may represent the structure of the closed state. The opening conformational change would then involve a movement of the A' helices from a position parallel to the axis of the membrane to one perpendicular to the axis of the membrane.

Functional interactions between A' helices in the C-linker of open CNG channels.

Cycliques nucl&eacute;otide-d&eacute;pendants (CNG) cha&icirc;nes sont cation non s&eacute;lectif qui sont activ&eacute;s par la liaison directe du cAMP de nucl&eacute;otides cycliques et de cGMP. La r&eacute;gion qui relie la derni&egrave;re r&eacute;gion transmembranaire (S6) pour le domaine de liaison de nucl&eacute;otides cycliques dans le COOH terminal, appel&eacute; le C-linker, s&#39;est av&eacute;r&eacute;e jouent un r&ocirc;le important dans le couplage des liaison de nucl&eacute;otides cycliques &agrave; l&#39;ouverture du pore. Dans cette &eacute;tude, nous avons explor&eacute; la proximit&eacute; entre la A&#39; h&eacute;lices des r&eacute;gions de CNGA1 C-linker en canaux fonctionnels &agrave; l&#39;aide de la substitution de cyst&eacute;ine in situ. Nous avons trouv&eacute; que les liaisons disulfide sous-unit&eacute;s peuvent se former entre les A&#39; h&eacute;lices dans les canaux d&eacute;couverts, et qu&#39;induisant le disulfure de liaisons dans la plupart des constructions &eacute;tudi&eacute;es a entra&icirc;n&eacute; une potentialisation de l&#39;activation de canal. Cela laisse entendre que le A&#39; h&eacute;lices des r&eacute;gions C-linker sont &agrave; proximit&eacute; imm&eacute;diate lorsque le canal est dans l&#39;&eacute;tat ouvert. Notre conclusion n&#39;est pas compatible avec un mod&egrave;le d&#39;homologie de la C-linker CNGA1 issu de la radiographie publi&eacute;e r&eacute;cemment une structure cristallographique de l&#39;hyperpolarisation-activ&eacute;, cyclique modul&eacute;s en nucl&eacute;otides (HCN) canal COOH terminal et fils de sugg&eacute;rer que la r&eacute;gion C-linker d&eacute;peinte dans la structure cristalline peut repr&eacute;senter la structure de l&#39;&eacute;tat ferm&eacute;. Le changement de conformation ouverture impliquerait alors un mouvement de l&#39;A &#39; h&eacute;lices d&#39;une position parall&egrave;le &agrave; l&#39;axe de la membrane &agrave; l&#39;un est perpendiculaire &agrave; l&#39;axe de la membrane.

Les interactions fonctionnelles entre A&#39; spirales dans l&#39;&eacute;diteur de liens C de canaux CNG.

Ciclici nucleotide-gated (CNG) canali sono canali non selettivi cazione che vengono attivati dall&#39;associazione diretta del cGMP e cAMP di nucleotidi ciclici. La regione che collega l&#39;ultima membrana-spanning regione (S6) al dominio di associazione nucleotide ciclico in capolinea COOH, definito C-linker, ha dimostrata di giocare un ruolo importante nell&#39;accoppiamento associazione nucleotide ciclico all&#39;apertura del poro. In questo studio, abbiamo esplorato il intersubunit prossimit&agrave; tra l&#39;A &#39; eliche delle regioni C-linker di CNGA1 nei canali funzionali mediante sostituzione di cisteina site-specific. Abbiamo trovato che si possono formare legami bisolfurico intersubunit tra la A&#39; eliche in canali aperti, e che indurre disolfuro obbligazioni nella maggior parte dei costrutti studiati ha portato nel potenziamento dell&#39;attivazione del canale. Questo suggerisce che la A&#39; eliche delle regioni C-linker sono nelle immediate vicinanze, quando il canale &egrave; stato aperto. La nostra ricerca non &egrave; compatibile con un modello di omologia di CNGA1 C-linker fatto da raggi x pubblicato di recente struttura cristallografica del hyperpolarization-attivato, ciclico nucleotide-modulato (HCN) canale COOH terminus e porta noi a suggerire che la regione C-linker raffigurato nella struttura di cristallo possiamo rappresentare la struttura dello stato chiuso. Il cambiamento conformazionale di apertura comporterebbe quindi un movimento dell&#39;A &#39; eliche da una posizione parallela all&#39;asse della membrana ad uno perpendicolare all&#39;asse della membrana.

Interazioni funzionali tra A&#39; eliche in C-linker di aprire canali CNG.

&#x75BC;&#x75DB;&#x6C19;&#x6C14;&#x79BB;&#x5B50;&#x901A;&#x9053; TRPV1 &#x5BA3;&#x4F20;&#x662F; proalgesic &#x4EE3;&#x7406;&#x5982;&#x795E;&#x7ECF;&#x751F;&#x957F;&#x56E0;&#x5B50; (NGF) &#x7684;&#x70ED;&#x75DB;&#x89C9;&#x8FC7;&#x654F;&#x7684;&#x57FA;&#x7840;&#x3002;&#x795E;&#x7ECF;&#x751F;&#x957F;&#x56E0;&#x5B50;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x75DB;&#x89C9;&#x8FC7;&#x654F;&#x671F;&#x95F4; TRPV1 &#x51FD;&#x6570;&#x4E2D;&#x7684;&#x589E;&#x52A0;&#x5229;&#x7528;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x78F7;&#x8102;&#x9176; C &#xFF08;PLC&#xFF09; &#x5728; PIP2&#xFF0C;&#x62DF; tonically &#x6291;&#x5236; TRPV1 &#x76EE;&#x524D;&#x516C;&#x8BA4;&#x7684;&#x578B;&#x53F7;&#x3002;&#x5728;&#x6B64;&#x7814;&#x7A76;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x6D4B;&#x8BD5;&#x7684; PLC &#x6A21;&#x578B;&#x548C;&#x53D1;&#x73B0;&#x7684;&#x8BC1;&#x636E;&#x76F4;&#x63A5;&#x6311;&#x6218;&#x53CA;&#x5176;&#x6709;&#x6548;&#x6027;&#x7684;&#x4E24;&#x884C;&#xFF1A; (1) &#x805A;&#x8D56;&#x6C28;&#x9178;&#x3001; &#x9633;&#x79BB;&#x5B50;&#x78F7;&#x8102;&#x9170;&#x808C;&#x9187;&#x87AF;&#x5408;&#x4EE3;&#x7406;&#xFF0C;&#x800C;&#x4E0D;&#x662F;&#x53D1;&#x6325;&#x5176;&#x6F5C;&#x80FD;&#xFF0C;&#x6291;&#x5236; TRPV1 &#x548C; PIP2 (2) &#x76F4;&#x63A5;&#x9002;&#x7528;&#x5185;&#x5916;&#x79BB;&#x4F53;&#x4FEE;&#x8865;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x5927;&#x5927;&#x5F3A;&#x5316; TRPV1&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x663E;&#x793A;&#x7684;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x8868;&#x660E;&#x808C;&#x9187;&#x7269;&#x7406;&#x4E0A;&#x548C;&#x529F;&#x80FD;&#x4E0A;&#x8026;&#x5408;&#x5230; TRPV1 &#x7684;&#x56DB;&#x79CD;&#x7C7B;&#x578B;&#xFF1A; (1) p85beta &#x4E9A;&#x57FA;&#x7684;&#x808C;&#x9187;&#x4E0E; TRPV1 &#x5728;&#x9175;&#x6BCD; 2 &#x6742;&#x4EA4;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x4E2D;&#x7684;&#xFF0C;&#x4E0E;&#x4ECE;&#x4EBA;&#x80DA;&#x80CE;&#x80BE; 293 &#x7EC6;&#x80DE;&#x548C;&#x80CC;&#x6839;&#x795E;&#x7ECF;&#x8282; (DRG) &#x795E;&#x7ECF;&#x5143; TRPV1 (2) &#x808C;&#x9187; p85beta coimmunoprecipitated N-&#x672B;&#x7AEF;&#x533A;&#x57DF;&#x4E92;&#x52A8;&#x3001; (3) TRPV1 &#x4EA4;&#x4E92;&#x91CD;&#x7EC4;&#x808C;&#x9187;-p85 &#x5728;&#x8BD5;&#x7BA1;&#x91CC;&#x548C; (4) &#x6E25;&#x6F2B;&#x9752;&#x9709;&#x7D20;&#x4E00;&#x79CD;&#x7279;&#x5B9A;&#x7684;&#x6291;&#x5236;&#x5242;&#x808C;&#x9187;&#xFF0C;&#x5B8C;&#x5168;&#x5E9F;&#x9664;&#x6025;&#x6027;&#x5206;&#x79BB;&#x7684;&#x80CC;&#x6839;&#x8282;&#x795E;&#x7ECF;&#x5143;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x795E;&#x7ECF;&#x751F;&#x957F;&#x56E0;&#x5B50;&#x7684;&#x5BA3;&#x4F20;&#x3002;&#x6700;&#x540E;&#xFF0C;&#x540C;&#x65F6;&#x7535;&#x751F;&#x7406;&#x548C;&#x603B;&#x5185;&#x90E8;&#x53CD;&#x5C04; &#xFF08;&#x63D0;&#x5C14;&#x592B;) &#x8367;&#x5149;&#x663E;&#x5FAE;&#x955C;&#x5F55;&#x97F3;&#x8BC1;&#x660E;&#x795E;&#x7ECF;&#x751F;&#x957F;&#x56E0;&#x5B50;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8D28;&#x819C;&#x7684;&#x6E20;&#x9053;&#x589E;&#x591A;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x63D0;&#x51FA;&#x4E00;&#x79CD;&#x65B0;&#x6A21;&#x578B;&#x4E2D;&#x54EA;&#x4E9B;&#x7269;&#x7406;&#x8026;&#x5408; TRPV1 &#x548C;&#x808C;&#x9187;&#x7684;&#x4FE1;&#x53F7;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x590D;&#x6742;&#x4FBF;&#x5229; TRPV1 &#x8D29;&#x8FD0;&#x5230;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8D28;&#x819C;&#x7684;&#x795E;&#x7ECF;&#x751F;&#x957F;&#x56E0;&#x5B50;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x75DB;&#x89C9;&#x8FC7;&#x654F;&#x3002;

&#x78F7;&#x8102;&#x9170;&#x808C;&#x9187; 3-&#x6FC0;&#x9176;&#x5C06;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230; TRPV1 &#x548C;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x795E;&#x7ECF;&#x751F;&#x957F;&#x56E0;&#x5B50;&#x523A;&#x6FC0; TRPV1 &#x8D29;&#x8FD0;&#x5230;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8D28;&#x819C;&#x3002;

Sensitization of the pain-transducing ion channel TRPV1 underlies thermal hyperalgesia by proalgesic agents such as nerve growth factor (NGF). The currently accepted model is that the NGF-mediated increase in TRPV1 function during hyperalgesia utilizes activation of phospholipase C (PLC) to cleave PIP2, proposed to tonically inhibit TRPV1. In this study, we tested the PLC model and found two lines of evidence that directly challenge its validity: (1) polylysine, a cationic phosphoinositide sequestering agent, inhibited TRPV1 instead of potentiating it, and (2) direct application of PIP2 to inside-out excised patches dramatically potentiated TRPV1. Furthermore, we show four types of experiments indicating that PI3K is physically and functionally coupled to TRPV1: (1) the p85beta subunit of PI3K interacted with the N-terminal region of TRPV1 in yeast 2-hybrid experiments, (2) PI3K-p85beta coimmunoprecipitated with TRPV1 from both HEK293 cells and dorsal root ganglia (DRG) neurons, (3) TRPV1 interacted with recombinant PI3K-p85 in vitro, and (4) wortmannin, a specific inhibitor of PI3K, completely abolished NGF-mediated sensitization in acutely dissociated DRG neurons. Finally, simultaneous electrophysiological and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy recordings demonstrate that NGF increased the number of channels in the plasma membrane. We propose a new model for NGF-mediated hyperalgesia in which physical coupling of TRPV1 and PI3K in a signal transduction complex facilitates trafficking of TRPV1 to the plasma membrane.

Phosphoinositide 3-kinase binds to TRPV1 and mediates NGF-stimulated TRPV1 trafficking to the plasma membrane.

Sensibilisation du canal ionique douleur-transduction TRPV1 sous-tend une hyperalg&eacute;sie thermique par des agents de proalgesic comme facteur de croissance de nerf (NGF). Le mod&egrave;le couramment accept&eacute; est que l&#39;augmentation TRPV1 fonction au cours de l&#39;hyperalg&eacute;sie induite par le NGF utilise l&#39;activation de la phospholipase C (PLC) en conjonction avec le PIP2, propos&eacute; pour inhiber toniquement TRPV1. Dans cette &eacute;tude, nous avons test&eacute; le mod&egrave;le PLC et trouv&eacute; deux lignes d&#39;&eacute;l&eacute;ments de preuve qui contestent directement sa validit&eacute;: (1) polylysine, un phosphoinositide cationique agent, s&eacute;questrant inhibe TRPV1 au lieu de potentialiser il et application (2) directe du PIP2 &agrave; inside-out excis&eacute;s patches potentialis&eacute;e dramatiquement TRPV1. De plus, nous montrons les quatre types d&#39;exp&eacute;riences indiquant que PI3K est physiquement et fonctionnellement coupl&eacute;e &agrave; TRPV1: (1) la sous-unit&eacute; p85beta de PI3K interagi avec la r&eacute;gion N-terminale de TRPV1 dans les exp&eacute;riences de 2-hybride de levure, coimmunoprecipitated de PI3K-p85beta (2) avec TRPV1 de cellules HEK293 et les neurones des ganglions (DRG) de la racine dorsale, (3) TRPV1 interagi avec recombinant PI3K-p85 in vitro et (4) wortmannin, un inhibiteur sp&eacute;cifique de PI3K, compl&egrave;tement aboli sensibilisation m&eacute;di&eacute;e par NGF dans les neurones DRG aigu&euml; dissoci&eacute;es. Enfin, enregistrements de microscopie simultan&eacute;e &eacute;lectrophysiologiques et total internal reflection fluorescence (FRBR) d&eacute;montrent que le NGF a augment&eacute; le nombre de canaux dans la membrane plasmique. Nous proposons un nouveau mod&egrave;le pour l&#39;hyperalg&eacute;sie induite par le NGF dans quel couplage physique de TRPV1 et PI3K dans un signal transduction complexe facilite le trafic de TRPV1 vers la membrane plasmique.

Phosphoinositide 3-kinase lie &agrave; TRPV1 et m&eacute;diatise TRPV1 NGF-stimul&eacute; le trafic vers la membrane plasmique.

Sensibilisierung des Schmerz-transducing Ionenkanal TRPV1 unterliegt thermischen Hyperalgesie durch Proalgesic Mittel wie Nerv Wachstumfaktor (NGF). Das heute akzeptierte Modell ist, dass der NGF-vermittelten Anstieg der TRPV1-Funktion w&auml;hrend der Hyperalgesie Aktivierung der Phospholipase C (PLC), PIP2, vorgeschlagen, tonisch TRPV1 hemmen cleave nutzt. In dieser Studie wir getestet das PLC-Modell und zwei Linien von beweisen, die seine G&uuml;ltigkeit direkt herauszufordern: (1) Polylysin, eine kationische Phosphoinositid absondern Agent, gehemmt TRPV1 statt potentiating es, und (2) direkte Anwendung von PIP2 Inside-Out-excised Patches potenzierte dramatisch TRPV1. Dar&uuml;ber hinaus zeigen wir vier Arten von Experimenten, die darauf hinweist, dass PI3K physisch und funktionell TRPV1 gekoppelt ist: (1) die p85beta-Untereinheit des PI3K interagiert mit der N-terminalen Region TRPV1 Hefe-2-Hybrid-Experimente, (2) PI3K-p85beta-Coimmunoprecipitated mit TRPV1 von HEK293 Zellen und Spinalganglien Ganglien (DRG) Neuronen, (3) TRPV1 interagiert mit rekombinantem PI3K-p85 in-vitro- und Wortmannin (4), einen spezifischen Inhibitor der PI3K, vollst&auml;ndig abgeschafft NGF-vermittelte Sensibilisierung in akut getrennten DRG-Neuronen. Gleichzeitige elektrophysiologische und total internal Reflection Fluorescence (TIRF) Mikroskopie Aufnahmen zeigen schlie&szlig;lich, dass NGF die Anzahl der Kan&auml;le in der Plasmamembran erh&ouml;ht. Wir schlagen ein neues Modell f&uuml;r NGF-vermittelte Hyperalgesie in welche physikalische Kopplung von TRPV1 und PI3K in ein Signal Transduktion komplexe erleichtert Handel mit TRPV1, der Plasmamembran.

Phosphoinositid-3-Kinase bindet an TRPV1 und vermittelt NGF-stimuliert TRPV1 Menschenhandel an der Plasmamembran.

Sensibilizzazione della scanalatura dello ione transducing dolore TRPV1 sottende iperalgesia termica da agenti proalgesic come fattore di crescita nervosa (NGF). Il modello attualmente accettato &egrave; che l&#39;aumento del NGF-mediata TRPV1 funzione durante l&#39;iperalgesia utilizza la attivazione della fosfolipasi C (PLC) a fendere PIP2, proposto per inibire tonicamente TRPV1. In questo studio, abbiamo testato il modello PLC e ha trovato due linee di evidenza che sfidano direttamente la sua validit&agrave;: (1) polilisina, una cationica phosphoinositide sequestrante, inibito TRPV1 invece esso POTENZIANTI, e (2) diretta applicazione di PIP2 inside-out patch escisse notevolmente potenziate TRPV1. Inoltre, mostriamo quattro tipi di esperimenti che indica che PI3K &egrave; fisicamente e funzionalmente accoppiati a TRPV1: (1) la subunit&agrave; p85beta di PI3K interagito con la regione N-terminale di TRPV1 in esperimenti di lievito 2-ibrido, coimmunoprecipitated PI3K-p85beta (2) con TRPV1 da cellule HEK293 sia spinali neuroni gangli (DRG), (3) TRPV1 interagito con ricombinante PI3K-p85 in vitro e (4) wortmannin, un inibitore specifico di PI3K, completamente abolita NGF-mediata sensibilizzazione nei neuroni DRG acutamente dissociati. Infine, registrazioni di microscopia fluorescenza (TIRF) simultanea riflessione interna totale ed elettrofisiologiche dimostrano che NGF aumentato il numero di canali nella membrana del plasma. Vi proponiamo un nuovo modello per iperalgesia NGF-mediata in cui accoppiamento fisico di TRPV1 e PI3K in un segnale complesso di trasduzione facilita il traffico di TRPV1 alla membrana del plasma.

Fosfoinositide 3-chinasi si associa a TRPV1 e da intermediario NGF-stimolato TRPV1 traffico alla membrana del plasma.

&#x75DB;&#x307F; il-13 &#x30A4;&#x30AA;&#x30F3; &#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB; TRPV1 &#x306E;&#x611F;&#x4F5C; proalgesic &#x30A8;&#x30FC;&#x30B8;&#x30A7;&#x30F3;&#x30C8;&#x795E;&#x7D4C;&#x6210;&#x9577;&#x56E0;&#x5B50; &#xFF08;NGF&#xFF09; &#x306A;&#x3069;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x71B1;&#x6027;&#x75DB;&#x899A;&#x904E;&#x654F;&#x306E;&#x6839;&#x5E95;&#x306B;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x73FE;&#x5728;&#x53D7;&#x3051;&#x5165;&#x308C;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x306F;&#x3001;TRPV1 &#x95A2;&#x6570;&#x75DB;&#x899A;&#x904E;&#x654F;&#x4E2D;&#x306E; NGF &#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x305F;&#x5897;&#x52A0;&#x30DB;&#x30B9;&#x30DB;&#x30EA;&#x30D1;&#x30FC;&#x30BC; C (PLC) &#x5288;&#x958B;&#x306F; pip 2 &#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x6D3B;&#x6027;&#x3001;tonically TRPV1 &#x3092;&#x963B;&#x5BB3;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x63D0;&#x6848;&#x3059;&#x308B;&#x306E;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x3092;&#x5229;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x672C;&#x7814;&#x7A76;&#x306F;, PLC &#x306E;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x3092;&#x30C6;&#x30B9;&#x30C8;&#x3057;&#x3001;&#x76F4;&#x63A5;&#x305D;&#x306E;&#x59A5;&#x5F53;&#x6027;&#x306B;&#x6311;&#x6226;&#x8A3C;&#x62E0;&#x306E; 2 &#x3064;&#x306E;&#x884C;&#x304C;&#x898B;&#x3064;&#x304B;&#x308A;&#x307E;&#x3057;&#x305F;: (1) &#x30DD;&#x30EA;&#x30EA;&#x30B8;&#x30F3;&#x3001;&#x91D1;&#x5C5E;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x5C01;&#x9396;&#x5264;&#x3001;&#x30AB;&#x30C1;&#x30AA;&#x30F3;&#x6027;&#x30DB;&#x30B9;&#x30DB;&#x30A4;&#x30CE;&#x30B7;&#x30C1;&#x30C9;&#x6291;&#x5236; TRPV1 &#x305D;&#x308C;&#x306B;&#x3001;&#x5897;&#x5F37;&#x3067;&#x306F;&#x306A;&#x304F;&#x3001;TRPV1 &#x3092;&#x5287;&#x7684;&#x306B;&#x5897;&#x5F37;&#x3057;&#x305F; pip 2 &#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x6D3B;&#x6027;&#x306E; (2) &#x76F4;&#x63A5;&#x30A2;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306B;&#x30A4;&#x30F3;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C9; &#x30A2;&#x30A6;&#x30C8;&#x5207;&#x9664;&#x30D1;&#x30C3;&#x30C1;&#x3002;&#x3055;&#x3089;&#x306B;, 4 &#x7A2E;&#x985E; PI3K &#x7269;&#x7406;&#x7684;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x6A5F;&#x80FD;&#x7684; TRPV1 &#x306B;&#x7D50;&#x5408;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3059;&#x5B9F;&#x9A13;&#x306E;&#x793A;&#x3059;: (1) p85beta &#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8; PI3K &#x306E; TRPV1 &#x9175;&#x6BCD; 2 &#x30CF;&#x30A4;&#x30D6;&#x30EA;&#x30C3;&#x30C9;&#x306E;&#x5B9F;&#x9A13;&#x3067;&#x3001;TRPV1 HEK293 &#x7D30;&#x80DE;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x5F8C;&#x6839;&#x795E;&#x7D4C;&#x7BC0;&#x30CB;&#x30E5;&#x30FC;&#x30ED;&#x30F3;&#x304B;&#x3089;&#x306E; (2) PI3K p85beta coimmunoprecipitated &#x306E; N &#x672B;&#x7AEF;&#x9818;&#x57DF;&#x3068;&#x306E;&#x4EA4;&#x6D41;&#x3001;(3) TRPV1 &#x4EA4;&#x6D41;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048; PI3K p85 in vitro &#x304A;&#x3088;&#x3073; (4) &#x30EF;&#x30EB;&#x30C8;&#x30DE;&#x30CB;&#x30F3;&#x3001;PI3K&#x3001;&#x306E;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x963B;&#x5BB3;&#x5264;&#x306F;&#x5B8C;&#x5168;&#x306B;&#x6025;&#x6027;&#x89E3;&#x96E2; DRG &#x30CB;&#x30E5;&#x30FC;&#x30ED;&#x30F3;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B; NGF &#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x305F;&#x611F;&#x4F5C;&#x3092;&#x5EC3;&#x6B62;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6700;&#x5F8C;&#x306B;&#x3001;&#x540C;&#x6642;&#x96FB;&#x6C17;&#x751F;&#x7406;&#x5B66;&#x7684;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x5168;&#x5185;&#x90E8;&#x53CD;&#x5C04;&#x86CD;&#x5149; &#xFF08;TIRF) &#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x9332;&#x97F3; NGF &#x539F;&#x5F62;&#x8CEA;&#x819C;&#x306E;&#x30C1;&#x30E3;&#x30F3;&#x30CD;&#x30EB;&#x6570;&#x3092;&#x5897;&#x52A0;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3069;&#x306E;&#x4FE1;&#x53F7;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B; TRPV1 &#x3068; PI3K &#x306E;&#x7269;&#x7406;&#x7D50;&#x5408;&#x3067;&#x8907;&#x96D1;&#x306A;&#x4F1D;&#x9054; TRPV1 &#x306E;&#x539F;&#x5F62;&#x8CEA;&#x819C;&#x306B;&#x4EBA;&#x8EAB;&#x58F2;&#x8CB7;&#x4FC3;&#x9032; NGF &#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x305F;&#x75DB;&#x899A;&#x904E;&#x654F;&#x306E;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x3092;&#x63D0;&#x6848;&#x3059;&#x308B;.

&#x30DB;&#x30B9;&#x30DB;&#x30A4;&#x30CE;&#x30B7;&#x30C1;&#x30C9; 3-&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x306F; TRPV1 &#x306B;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x3057;&#x3001;NGF &#x523A;&#x6FC0; TRPV1 &#x819C;&#x306B;&#x4EBA;&#x8EAB;&#x58F2;&#x8CB7;&#x3092;&#x4EF2;&#x4ECB;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

TRPV1 &#xC774;&#xC628; &#xD1B5;&#xC99D; transducing &#xCC44;&#xB110; sensitization &#xC2E0;&#xACBD; &#xC131;&#xC7A5; &#xC778;&#xC790; (NGF) &#xAC19;&#xC740; proalgesic &#xC5D0;&#xC774;&#xC804;&#xD2B8;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC5F4; hyperalgesia &#xAE30;&#xCD08;&#xAC00; &#xB418;. &#xD604;&#xC7AC; &#xD5C8;&#xC6A9;&#xB41C; &#xBAA8;&#xB378; hyperalgesia &#xB3D9;&#xC548; TRPV1 &#xD568;&#xC218;&#xC5D0;&#xC11C; NGF &#xC911;&#xC7AC; &#xC99D;&#xAC00; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; phospholipase C (PLC) tonically trpv1&#xC744; &#xC5B5;&#xC81C; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xC81C;&#xC548; &#xB41C; PIP2 &#xCABC;&#xAC1C; &#xB2E4; &#xC218;&#xC758; &#xD65C;&#xC6A9;&#xC740;. &#xC774; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; PLC &#xBAA8;&#xB378;&#xC744; &#xD14C;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xD558; &#xACE0; &#xC9C1;&#xC811; &#xADF8;&#xAC83;&#xC758; &#xD0C0;&#xB2F9;&#xC131;&#xC5D0; &#xB3C4;&#xC804; &#xD558;&#xB294; &#xB450; &#xC904; &#xC99D;&#xAC70;&#xC758; &#xBC1C;&#xACAC;: (1) polylysine, &#xC5D0;&#xC774;&#xC804;&#xD2B8;, &#xBD09;&#xC1C4; &#xC591;&#xC774;&#xC628; phosphoinositide, potentiating &#xB300;&#xC2E0; TRPV1 &#xC800;&#xD574; &#xBC0F; pip2&#xC758; &#xB0B4;&#xBD80;-&#xC544;&#xC6C3; &#xC0AD;&#xC81C; &#xD328;&#xCE58; &#xC801;&#xC6A9; (2) &#xC9C1;&#xC811; &#xADF9;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; TRPV1 potentiated. &#xB610;&#xD55C;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; pi3k&#xB294; &#xC721;&#xCCB4;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xACB0;&#xD569; trpv1&#xB97C; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0B4;&#xB294; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC758; 4 &#xC885;&#xB958; &#xD45C;&#xC2DC;: &#xD6A8; &#xBAA8; 2 &#xC7A1;&#xC885; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC5D0;&#xC11C; TRPV1, TRPV1 HEK293 &#xC138;&#xD3EC;&#xC640; &#xB290; &#xB8E8;&#xD2B8; (DRG) &#xC911;&#xCD94; &#xC2E0;&#xACBD;&#xC5D0;&#xC11C;&#xC640; (2) PI3K p85beta coimmunoprecipitated&#xC758; N &#xD130;&#xBBF8;&#xB110; &#xC9C0;&#xC5ED; &#xC791;&#xC6A9;&#xD560; pi3k&#xC758; p85beta &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704; (1), (3) TRPV1 &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; PI3K-&#xD56D;&#xBAA9;&#xC774; p85 &#xCCB4; &#xC678;, &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; (4) wortmannin&#xC640; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;PI3K&#xC758; &#xD2B9;&#xC815; &#xC5B5;&#xC81C;&#xC81C; &#xC644;&#xC804;&#xD788; &#xD3D0;&#xC9C0; &#xC2EC;&#xD558;&#xAC8C; &#xB04A;&#xB41C; DRG &#xC2E0;&#xACBD; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0;&#xC11C; NGF &#xC911;&#xC7AC; &#xBBFC;&#xAC10;&#xC131;. &#xB9C8;&#xC9C0;&#xB9C9;&#xC73C;&#xB85C; &#xB3D9;&#xC2DC; electrophysiological &#xBC0F; &#xCD1D; &#xB0B4;&#xBD80; &#xBC18;&#xC0AC; (TIRF) &#xD615;&#xAD11; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD; &#xB179;&#xC74C; &#xC124;&#xBA85; NGF &#xD50C;&#xB77C;&#xC988;&#xB9C8; &#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778;&#xC5D0;&#xB294; &#xCC44;&#xB110;&#xC758; &#xC218;&#xB97C; &#xC99D;&#xAC00; &#xD588;&#xB2E4;. NGF &#xC911;&#xC7AC; hyperalgesia &#xC2E0;&#xD638;&#xC5D0;&#xC11C; TRPV1 &#xBC0F; pi3k&#xC758; &#xBB3C;&#xB9AC;&#xC801; &#xCEE4;&#xD50C;&#xB9C1;&#xC5D0; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xBCC0;&#xD658; &#xC6A9;&#xC774; &#xD50C;&#xB77C;&#xC988;&#xB9C8; &#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778; trpv1&#xC758; &#xC778;&#xC2E0; &#xB9E4;&#xB9E4;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xBAA8;&#xB378;&#xC744; &#xC81C;&#xC548; &#xD55C;&#xB2E4;.

Phosphoinositide 3-kinase trpv1&#xC5D0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD558;&#xACE0; NGF &#xC790;&#xADF9; TRPV1 &#xD50C;&#xB77C;&#xC988;&#xB9C8; &#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778;&#xC5D0; &#xC778;&#xC2E0; &#xB9E4;&#xB9E4;&#xB97C; &#xC911;&#xC7AC;.

Sensibilizaci&oacute;n de la canal del ion transducci&oacute;n dolor TRPV1 subyace Hiperalgesia t&eacute;rmica por agentes de la proalg&eacute;sicos como factor de crecimiento nervioso (NGF). El modelo actualmente aceptado es que el aumento de NGF-mediada en funci&oacute;n TRPV1 durante hiperalgia utiliza la activaci&oacute;n de la fosfolipasa C (PLC) de allegarse PIP2, pretende inhibir tonalmente TRPV1. En este estudio, probamos el modelo PLC y encontr&oacute; dos l&iacute;neas de evidencia que directamente impugnar su validez: (1) polylysine, un Fosfoinositol cati&oacute;nico agente, el secuestro inhibida TRPV1 en lugar de potenciarlo y aplicaci&oacute;n (2) directa de PIP2 a rev&eacute;s suprimidos parches dram&aacute;ticamente potenciada TRPV1. Por otra parte, nos muestran cuatro tipos de experimentos indicando que PI3K es f&iacute;sica y funcionalmente junto a TRPV1: (1) la subunidad p85beta de PI3K interactuaron con la regi&oacute;n N-terminal de TRPV1 en experimentos de levadura 2-h&iacute;brido, (2) coinmunoprecipit&oacute; de PI3K-p85beta con TRPV1 de c&eacute;lulas HEK293 y las neuronas de los ganglios (DRG) ra&iacute;z dorsal, (3) TRPV1 interactu&oacute; con recombinante PI3K-p85 in vitro y (4) wortmannin, un inhibidor espec&iacute;fico de PI3K, completamente suprimido sensibilizaci&oacute;n mediada por NGF en neuronas DRG agudo disociadas. Finalmente, grabaciones de microscop&iacute;a de fluorescencia (TIRF) simult&aacute;nea reflexi&oacute;n interna total y electrofisiol&oacute;gicos demuestran que el NGF aument&oacute; el n&uacute;mero de canales en la membrana plasm&aacute;tica. Proponemos un nuevo modelo para Hiperalgia NGF-mediada en que acoplamiento f&iacute;sico de TRPV1 y PI3K en una se&ntilde;al de transducci&oacute;n complejo facilita tr&aacute;fico de TRPV1 a la membrana plasm&aacute;tica.

Fosfatidilinositol 3-quinasa se une a TRPV1 y media TRPV1 NGF-estimulado el tr&aacute;fico a la membrana plasm&aacute;tica.

Some members of the transient receptor potential (TRP) family of cation channels mediate sensory responses to irritant substances. Although it is well known that TRPA1 channels are activated by pungent compounds found in garlic, onion, mustard and cinnamon extracts, activation of TRPV1 by these extracts remains controversial. Here we establish that TRPV1 is activated by pungent extracts from onion and garlic, as well as by allicin, the active compound in these preparations, and participates together with TRPA1 in the pain-related behavior induced by this compound. We found that in TRPV1 these agents act by covalent modification of cysteine residues. In contrast to TRPA1 channels, modification of a single cysteine located in the N-terminal region of TRPV1 was necessary and sufficient for all the effects we observed. Our findings point to a conserved mechanism of activation in TRP channels, which provides new insights into the molecular basis of noxious stimuli detection.

A single N-terminal cysteine in TRPV1 determines activation by pungent compounds from onion and garlic.

Certains membres de la famille (TRP) potentielle transient receptor des canaux cationiques m&eacute;dient sensorielles r&eacute;ponses aux substances irritantes. Bien qu&#39;il est bien connu que les canaux TRPA1 est activ&eacute;s par la piquants compos&eacute;s pr&eacute;sents dans l&#39;ail, oignon, moutarde et cannelle extraits, activation de TRPV1 par ces extraits de demeure controvers&eacute;es. Ici, nous &eacute;tablissons que TRPV1 est activ&eacute; par piquants extraits d&#39;oignon et l&#39;ail, ainsi que par l&#39;allicine, le compos&eacute; actif dans ces pr&eacute;parations et participe avec TRPA1 dans le comportement li&eacute; &agrave; la douleur induit par ce compos&eacute;. Nous avons constat&eacute; que dans TRPV1, ces agents agissent par modification covalente des r&eacute;sidus cyst&eacute;ine. Contrairement aux canaux TRPA1, modification d&#39;une cyst&eacute;ine unique situ&eacute; dans la r&eacute;gion N-terminale de TRPV1 &eacute;tait n&eacute;cessaire et suffisant pour tous les effets que nous avons observ&eacute;. Nos r&eacute;sultats indiquent un m&eacute;canisme conserv&eacute; d&#39;activation dans les canaux de TRP, qui offre de nouvelles perspectives sur les bases mol&eacute;culaires de d&eacute;tection des stimuli nociceptifs.

Une seule cyst&eacute;ine N-terminale en TRPV1 d&eacute;termine l&#39;activation en piquants compos&eacute;s de l&#39;oignon et l&#39;ail.

Alcuni membri della famiglia transient receptor potenziale (TRP) dei canali del catione mediano risposte sensoriali a sostanze irritanti. Anche se &egrave; ben noto che TRPA1 canali vengono attivati dal pungente composti che si trovano in aglio, cipolla, senape e cannella estratti, attivazione di TRPV1 da questi estratti rimane controversa. Qui stabiliamo che TRPV1 &egrave; attivato dal pungenti estratti di cipolla e aglio, cos&igrave; come di allicina, il composto attivo in queste preparazioni e partecipa insieme a TRPA1 il comportamento correlati a dolore indotto da questo composto. Abbiamo trovato che nel TRPV1 questi agenti agiscono mediante modificazione covalente di residui di cisteina. In contrasto con canali TRPA1, modifica di un singolo cisteina che si trova nella regione N-terminale di TRPV1 era necessario e sufficiente per tutti gli effetti che abbiamo osservato. I nostri risultati indicano un meccanismo conservato di attivazione in canali TRP, che fornisce nuove intuizioni la base molecolare della rilevazione di stimoli nocivi.

Un singolo cisteina N-terminale in TRPV1 determina attivazione di pungente composti da cipolla e aglio.

Une fois consid&eacute;r&eacute; comme simplement une barri&egrave;re huileuse qui maintient l&#39;int&eacute;grit&eacute; cellulaire, lipides sont maintenant connus pour jouer un r&ocirc;le actif dans une grande vari&eacute;t&eacute; de processus cellulaires. Phosphoinositides sont particuli&egrave;rement int&eacute;ressantes en raison de leur remarquable capacit&eacute; d&#39;influer sur les nombreuses voies de signalisation. Transporteurs et canaux ioniques sont une cible importante de signalisation phosphoinositide, mais l&#39;identification des phosphoinositides sp&eacute;cifiques impliqu&eacute;s s&#39;av&egrave;re insaisissable. TRPV1 est un bon exemple ; Bien que phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate (PI(4,5)P(2)) peut r&eacute;glementer puissamment son activation, nous montrons que phosphatidylinositol 4-phosphate (PI(4)P) et phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate (PI(3,4,5)P(3)) pouvez aussi bien. Pour d&eacute;terminer l&#39;identit&eacute; de la phosphoinositide endog&egrave;ne r&eacute;glementant TRPV1, nous avons appliqu&eacute; domaines d&#39;homologie pleckstrine recombinante &agrave; inside-out patches excis&eacute;s. M&ecirc;me si un domaine d&#39;homologie PI (4,5) P 2 sp&eacute;cifique pleckstrine inhib&eacute;e TRPV1, un domaine d&#39;homologie P PI (3,4,5) sp&eacute;cifique &agrave; 3 pleckstrine n&#39;avait aucun effet. Imagerie confocale simultan&eacute;e et enregistrement &eacute;lectrophysiologique des cellules enti&egrave;res, exprimant une phosphatase lipidique rapamycine inductible aussi illustre qu&#39;&eacute;puisement des PI(4,5)P(2) inhibe activ&eacute;s par la capsa&iuml;cine TRPV1 actuel ; le PI (4) P g&eacute;n&eacute;r&eacute;es par les phosphatases n&#39;&eacute;tait pas suffisant pour soutenir la fonction TRPV1. Nous concluons que les PI(4,5)P(2) et pas les autres phosphoinositides ou les autres lipides, est la phosphoinositide endog&egrave;ne TRPV1 canaux de r&eacute;gulation.

D&eacute;terminants de la sp&eacute;cificit&eacute; mol&eacute;culaire dans le r&egrave;glement des phosphoinositides. Phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate (PI(4,5)P2) est le lipides endog&egrave;nes r&eacute;glementant TRPV1.

Once thought of as simply an oily barrier that maintains cellular integrity, lipids are now known to play an active role in a large variety of cellular processes. Phosphoinositides are of particular interest because of their remarkable ability to affect many signaling pathways. Ion channels and transporters are an important target of phosphoinositide signaling, but identification of the specific phosphoinositides involved has proven elusive. TRPV1 is a good example; although phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate (PI(4,5)P(2)) can potently regulate its activation, we show that phosphatidylinositol (4)-phosphate (PI(4)P) and phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate (PI(3,4,5)P(3)) can as well. To determine the identity of the endogenous phosphoinositide regulating TRPV1, we applied recombinant pleckstrin homology domains to inside-out excised patches. Although a PI(4,5)P(2)-specific pleckstrin homology domain inhibited TRPV1, a PI(3,4,5)P(3)-specific pleckstrin homology domain had no effect. Simultaneous confocal imaging and electrophysiological recording of whole cells expressing a rapamycin-inducible lipid phosphatase also demonstrates that depletion of PI(4,5)P(2) inhibits capsaicin-activated TRPV1 current; the PI(4)P generated by the phosphatases was not sufficient to support TRPV1 function. We conclude that PI(4,5)P(2), and not other phosphoinositides or other lipids, is the endogenous phosphoinositide regulating TRPV1 channels.

Determinants of molecular specificity in phosphoinositide regulation. Phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate (PI(4,5)P2) is the endogenous lipid regulating TRPV1.

Una volta pensato come semplicemente una barriera oleosa che mantiene l&#39;integrit&agrave; cellulare, lipidi sono ora noti per svolgere un ruolo attivo in una grande variet&agrave; di processi cellulari. Phosphoinositides sono di particolare interesse a causa della loro notevole capacit&agrave; di influenzare molte vie di segnalazione. Trasportatori e canali ionici sono un obiettivo importante di phosphoinositide signaling, ma identificare i phosphoinositides specifici coinvolti si &egrave; dimostrata sfuggente. TRPV1 &egrave; un buon esempio; Sebbene fosfatidilinositolo (4,5)-bisfosfato (PI(4,5)P(2)) potentemente pu&ograve; regolare la sua attivazione, mostriamo che fosfatidilinositolo 4-fosfato (PI(4)P) e fosfatidilinositolo (3, 4,5)-trifosfato (PI(3,4,5)P(3)) pu&ograve; pure. Per determinare l&#39;identit&agrave; del fosfoinositide endogeno che regolano TRPV1, abbiamo applicato domini omologia ricombinante settori patch escisse inside-out. Anche se un dominio di omologia PI (4,5) P 2 specifici settori inibito TRPV1, un dominio di omologia PI (3, 4,5) P 3 specifici settori ha avuto alcun effetto. Imaging confocale simultanea e registrazione elettrofisiologica di intere cellule che esprimono una fosfatasi lipidica rapamicina-inducible anche dimostra che deplezione di PI(4,5)P(2) inibisce la capsaicina-attivato TRPV1 corrente; PI (4) P generati dalla fosfatasi non era sufficiente a sostenere la funzione TRPV1. Concludiamo che PI(4,5)P(2) e non altri phosphoinositides o altri lipidi, &egrave; il fosfoinositide endogeno TRPV1 canali di regolazione.

Determinanti della specificit&agrave; molecolare phosphoinositide regolamento. Fosfatidilinositolo (4,5)-bisfosfato (PI(4,5)P2) &egrave; il lipidi endogeni che regolano TRPV1.

The 30+ members of the family of TRP channels are diverse in their physiological roles, yet the mechanisms that regulate their gating may be conserved. In particular, all TRP channels show an activity-dependent inhibition which is mediated by Ca(2+). The mechanism by which Ca(2+) inhibits TRP channels is currently a matter of intense debate, with Ca(2+)-regulated kinases, phosphatases, phospholipases and calmodulin all proposed to be involved. In this review, we will discuss different mechanisms for Ca(2+)-dependent desensitization in TRP channels. We will conclude with a model that focuses on Ca(2+)-dependent activation of phospholipase C and Ca(2+) binding to calmodulin and propose that the phospholipase C and calmodulin pathways are structurally and functionally coupled.

Mechanism of Ca(2+)-dependent desensitization in TRP channels.

Les 30 + membres de la famille des canaux TRP sont vari&eacute;s dans leurs r&ocirc;les physiologiques, mais les m&eacute;canismes qui r&eacute;gulent leur d&eacute;clenchement peuvent &ecirc;tre conserv&eacute;s. En particulier, tous les canaux TRP montrent une inhibition de l&#39;activit&eacute; d&eacute;pendante m&eacute;di&eacute;e par Ca(2+). Le m&eacute;canisme par lequel le Ca(2+) inhibe canaux TRP est actuellement un sujet de d&eacute;bat intense, avec r&eacute;glement&eacute;s Ca(2+) kinases, phosphatases, phospholipases et toutes les propositions de la calmoduline de participer. Dans cette revue, nous allons discuter des m&eacute;canismes diff&eacute;rents pour la d&eacute;sensibilisation Ca(2+)-d&eacute;pendante dans les canaux de TRP. Nous concluons avec un mod&egrave;le qui met l&#39;accent sur l&#39;activation de la Ca(2+)-d&eacute;pendante de la phospholipase C et liaison de ca(2+) &agrave; la calmoduline et proposer que la phospholipase C et la calmoduline voies sont structurellement et fonctionnellement coupl&eacute;s.

M&eacute;canisme de d&eacute;sensibilisation Ca(2+)-d&eacute;pendante dans les canaux de TRP.

I 30 + membri della famiglia di canali TRP sono diversi nel loro ruolo fisiologico, ma i meccanismi che regolano il loro gating possono essere conservati. In particolare, tutti i canali TRP mostrano un&#39;inibizione di attivit&agrave;-dipendente che &egrave; mediata da Ca(2+). Il meccanismo mediante il quale Ca(2+) inibisce canali TRP attualmente &egrave; una questione di intenso dibattito, con chinasi Ca(2+)-regolato, fosfatasi, phospholipases e calmodulina tutto proposto di essere coinvolto. In questa recensione, discuteremo diversi meccanismi per la desensibilizzazione Ca(2+)-dipendente nei canali TRP. Concludo con un modello che si concentra su attivazione Ca(2+)-dipendente delle fosfolipasi C e l&#39;associazione Ca(2+) di Calmodulina e ci propongono che la fosfolipasi C e calmodulina percorsi sono strutturalmente e funzionalmente accoppiati.

Meccanismo di desensibilizzazione Ca(2+)-dipendente nei canali TRP.

Perspectives on: Local calcium signaling.

En perspective : signalisation calcique locale.

Prospettive su: segnalazione di calcio locale.

TRPV2 is a member of the transient receptor potential family of ion channels involved in chemical and thermal pain transduction. Unlike the related TRPV1 channel, TRPV2 does not appear to bind either calmodulin or ATP in its N-terminal ankyrin repeat domain. In addition, it does not contain a calmodulin-binding site in the distal C-terminal region, as has been proposed for TRPV1. We have found that TRPV2 channels transiently expressed in F-11 cells undergo Ca(2+)-dependent desensitization, similar to the other TRPVs, suggesting that the mechanism of desensitization may be conserved in the subfamily of TRPV channels. TRPV2 desensitization was not altered in whole-cell recordings in the presence of calmodulin inhibitors or on coexpression of mutant calmodulin but was sensitive to changes in membrane phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP(2)), suggesting a role of membrane PIP(2) in TRPV2 desensitization. Simultaneous confocal imaging and electrophysiological recording of cells expressing TRPV2 and a fluorescent PIP(2)-binding probe demonstrated that TRPV2 desensitization was concomitant with depletion of PIP(2). We conclude that the decrease in PIP(2) levels on channel activation underlies a major component of Ca(2+)-dependent desensitization of TRPV2 and may play a similar role in other TRP channels.

Ca2+-dependent desensitization of TRPV2 channels is mediated by hydrolysis of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate.

TRPV2 est membre de la famille potentielle transient receptor des canaux ioniques impliqu&eacute;s dans la transduction de douleur chimique et thermique. Contrairement &agrave; la cha&icirc;ne TRPV1 connexe, TRPV2 ne semble pas lier la calmoduline ou ATP dans son domaine N-terminal ankyrin. En outre, il ne contient pas un site de liaison de la calmoduline dans la r&eacute;gion C-terminale distal, comme cela a &eacute;t&eacute; propos&eacute; pour TRPV1. Nous avons trouv&eacute; que TRPV2 canaux transitoirement exprim&eacute; dans les cellules de F-11 subissent une d&eacute;sensibilisation Ca(2+)-d&eacute;pendante, semblable &agrave; l&#39;autres TRPVs, ce qui sugg&egrave;re que le m&eacute;canisme de d&eacute;sensibilisation peut-&ecirc;tre &ecirc;tre conserv&eacute; dans la sous-famille des canaux TRPV. TRPV2 d&eacute;sensibilisation n&#39;a pas &eacute;t&eacute; modifi&eacute;e dans les enregistrements de cellules enti&egrave;res en pr&eacute;sence d&#39;inhibiteurs de la calmoduline ou sur coexpression de calmoduline mutante mais est sensible aux changements de membrane phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP(2)), sugg&eacute;rant un r&ocirc;le de membrane PIP(2) TRPV2 d&eacute;sensibilisation. Imagerie confocale simultan&eacute;e et enregistrement &eacute;lectrophysiologique des cellules exprimant TRPV2 et une sonde fluorescente de liaison 2 PIP a d&eacute;montr&eacute; que la d&eacute;sensibilisation TRPV2 &eacute;tait concomitante avec l&#39;appauvrissement de la couche de PIP(2). Nous concluons que la diminution des niveaux PIP(2) lors de l&#39;activation du canal est &agrave; la base une composante majeure de d&eacute;sensibilisation de Ca(2+) d&eacute;pendant de TRPV2 et peut jouer un r&ocirc;le similaire dans les autres canaux TRP.

Ca2 +-d&eacute;pendante d&eacute;sensibilisation des canaux TRPV2 est m&eacute;di&eacute;e par hydrolyse du phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate.

TRPV2 &egrave; un membro della famiglia dei canali ionici coinvolti nella trasduzione del dolore chimica e termica potenziali transient receptor. A differenza del canale TRPV1 correlato, non sembrano legano calmodulina o ATP nel dominio N-terminale ankyrin ripetizione TRPV2. Inoltre, non contiene un sito di Calmodulina-associazione nella regione C-terminale distale, come &egrave; stato proposto per TRPV1. Abbiamo trovato che canali TRPV2 transitoriamente espressi in cellule F-11 sottoposti a desensibilizzazione Ca(2+)-dipendente, simile all&#39;altro TRPVs, suggerendo che il meccanismo di desensibilizzazione pu&ograve; essere conservato nella sottofamiglia dei canali TRV1. Desensibilizzazione TRPV2 non &egrave; stato alterato in cellule intere registrazioni in presenza di inibitori della calmodulina o su coexpression della calmodulina mutante ma era sensibile ai cambiamenti nella membrana fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato (PIP(2)), suggerendo un ruolo della membrana PIP(2) in TRPV2 desensibilizzazione. Imaging confocale simultanea e registrazione elettrofisiologica delle cellule che esprimono TRPV2 e PIP 2-associazione sonda fluorescente dimostrato che TRPV2 desensibilizzazione era concomitante con deplezione di PIP(2). Possiamo concludere che la diminuzione nei livelli di PIP(2) sull&#39;attivazione del canale sottende una componente importante di desensibilizzazione Ca(2+)-dipendente di TRPV2 e pu&ograve; giocare un ruolo simile in altri canali TRP.

Ca2 +-dipendente desensibilizzazione dei canali TRPV2 &egrave; mediata da idrolisi del fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato.

Although a large number of ion channels are now believed to be regulated by phosphoinositides, particularly phosphoinositide 4,5-bisphosphate (PIP2), the mechanisms involved in phosphoinositide regulation are unclear. For the TRP superfamily of ion channels, the role and mechanism of PIP2 modulation has been especially difficult to resolve. Outstanding questions include: is PIP2 the endogenous regulatory lipid; does PIP2 potentiate all TRPs or are some TRPs inhibited by PIP2; where does PIP2 interact with TRP channels; and is the mechanism of modulation conserved among disparate subfamilies? We first addressed whether the PIP2 sensor resides within the primary sequence of the channel itself, or, as recently proposed, within an accessory integral membrane protein called Pirt. Here we show that Pirt does not alter the phosphoinositide sensitivity of TRPV1 in HEK-293 cells, that there is no FRET between TRPV1 and Pirt, and that dissociated dorsal root ganglion neurons from Pirt knock-out mice have an apparent affinity for PIP2 indistinguishable from that of their wild-type littermates. We followed by focusing on the role of the C terminus of TRPV1 in sensing PIP2. Here, we show that the distal C-terminal region is not required for PIP2 regulation, as PIP2 activation remains intact in channels in which the distal C-terminal has been truncated. Furthermore, we used a novel in vitro binding assay to demonstrate that the proximal C-terminal region of TRPV1 is sufficient for PIP2 binding. Together, our data suggest that the proximal C-terminal region of TRPV1 can interact directly with PIP2 and may play a key role in PIP2 regulation of the channel.

Localization of the PIP2 sensor of TRPV1 ion channels.

Bien qu&#39;un grand nombre de canaux ioniques est cens&eacute; maintenant &ecirc;tre r&eacute;gul&eacute;s par des phosphoinositides, particuli&egrave;rement phosphoinositide 4, 5-bisphosphate (PIP2), les m&eacute;canismes impliqu&eacute;s dans la r&eacute;gulation des phosphoinositides ne sont pas claires. Pour la superfamille TRP des canaux ioniques, le r&ocirc;le et le m&eacute;canisme de modulation PIP2 a &eacute;t&eacute; particuli&egrave;rement difficile &agrave; r&eacute;soudre. Parmi les questions en suspens : est PIP2 les lipides endog&egrave;nes de r&eacute;glementation ; PIP2 potentialise tous les PST ou est certains TRP inhib&eacute;e par le PIP2 ; o&ugrave; le PIP2 interagit-il avec canaux TRP ; et le m&eacute;canisme de modulation conserv&eacute;e parmi les sous-familles disparates ? Nous a d&#39;abord abord&eacute; si le capteur du PIP2 r&eacute;side dans la s&eacute;quence primaire de la cha&icirc;ne elle-m&ecirc;me, ou, comme l&#39;a r&eacute;cemment propos&eacute;, au sein d&#39;une prot&eacute;ine int&eacute;grale de membrane accessoire appel&eacute;e Pirt. Nous d&eacute;montrons que le Pirt n&#39;alt&egrave;re pas la sensibilit&eacute; des phosphoinositides de TRPV1 en cellules HEK-293, qu&#39;il n&#39;y a aucun FRET entre TRPV1 et Pirt, et que les neurones des ganglions spinaux dissoci&eacute; de souris knock-out Pirt ont une affinit&eacute; apparente pour le PIP2 impossibles &agrave; distinguer de celle de leur sauvage de m&ecirc;me port&eacute;e. Nous avons suivi en mettant l&#39;accent sur le r&ocirc;le de la partie C terminale de TRPV1 en t&eacute;l&eacute;d&eacute;tection PIP2. Ici, nous montrons que la r&eacute;gion C-terminale distale n&#39;est pas n&eacute;cessaire pour le r&egrave;glement du PIP2, comme PIP2 activation reste intacte dans les canaux o&ugrave; le C-terminal distal a &eacute;t&eacute; tronqu&eacute;. En outre, nous avons utilis&eacute; un test de la nouvelle liaison in vitro afin de d&eacute;montrer que la r&eacute;gion C-terminale proximale de TRPV1 est suffisante pour la liaison de PIP2. Ensemble, nos r&eacute;sultats sugg&egrave;rent que la r&eacute;gion C-terminale proximale de TRPV1 peut interagir directement avec le PIP2 et pourrait jouer un r&ocirc;le cl&eacute; dans le PIP2 r&egrave;glement du canal.

Localisation du capteur des canaux ioniques TRPV1 PIP2.

Anche se un gran numero di canali ionici &egrave; ora crede di essere regolata da phosphoinositides, particolarmente phosphoinositide 4,5-bisfosfato (PIP2), i meccanismi coinvolti nella regolazione di phosphoinositide sono poco chiari. Superfamiglia TRP dei canali ionici, il ruolo e il meccanismo di modulazione PIP2 &egrave; stato particolarmente difficile da risolvere. Includono questioni in sospeso: &egrave; PIP2 il lipidi endogeni normativo; fa PIP2 potenziare tutti TRP o sono alcuni TRP inibito da PIP2; dove PIP2 interagisce con i canali TRP; ed &egrave; il meccanismo di modulazione conservato tra le sottofamiglie disparati? Abbiamo affrontato in primo luogo se il sensore PIP2 risiede all&#39;interno della sequenza primaria del canale stesso, o, come recentemente proposto, all&#39;interno di una proteina integrale di membrana accessorio chiamata Pirt. Qui vi mostriamo che Pirt non altera la sensibilit&agrave; di phosphoinositide di TRPV1 in cellule HEK-293, che non non c&#39;&egrave; nessun tasto tra TRPV1 e Pirt, e che i neuroni gangliari dissociata spinali da topi knock-out Pirt hanno un&#39;affinit&agrave; apparente per PIP2 indistinguibile da quella di loro littermates wild-type. Abbiamo seguito concentrandosi sul ruolo del C terminale di TRPV1 nel rilevamento PIP2. Qui, ci mostrano che la regione C-terminale distale non &egrave; richiesta per regolamento PIP2, PIP2 attivazione rimane intatta nei canali in cui &egrave; stato troncato il C-terminale distale. Inoltre, abbiamo utilizzato un saggio romanzo associazione in vitro per dimostrare che la regione prossimale del C-terminale di TRPV1 &egrave; sufficiente per l&#39;associazione PIP2. Insieme, i nostri dati suggeriscono che la regione prossimale del C-terminale di TRPV1 pu&ograve; interagire direttamente con PIP2 e pu&ograve; giocare un ruolo chiave in PIP2 regolamento del canale.

Localizzazione del sensore PIP2 dei canali ionici TRPV1.

It has been hypothesized that cytoskeletal tension prevents large-scale phase separation within cell plasma membranes. Here, we microaspirate giant unilamellar vesicles to determine the effect of mechanical stress on the liquid/liquid miscibility temperature of a membrane composed of a ternary lipid mixture. An increase in tension of 0.1Â mN/m induces a decrease in miscibility temperature on the order of a few tenths of a degree K, which validates recent theoretical predictions.

Increasing membrane tension decreases miscibility temperatures; an experimental demonstration via micropipette aspiration.

Il a &eacute;mis l&#39;hypoth&egrave;se que cytosquelette tension emp&ecirc;che s&eacute;paration des phases &agrave; grande &eacute;chelle dans les membranes plasmiques cellulaires. Ici, nous microaspirate les v&eacute;sicules unilamellaires g&eacute;ant pour d&eacute;terminer l&#39;effet des contraintes m&eacute;caniques sur la temp&eacute;rature de la miscibilit&eacute; de liquide/liquide d&#39;une membrane constitu&eacute;e d&#39;un m&eacute;lange de lipides ternaires. Une augmentation de tension de 0,1 mN/m induit une diminution de la temp&eacute;rature sur l&#39;ordre de quelques dixi&egrave;mes de degr&eacute; K, qui valide les pr&eacute;dictions th&eacute;oriques r&eacute;centes de miscibilit&eacute;.

Augmenter la tension de membrane diminue les temp&eacute;ratures de miscibilit&eacute; ; une d&eacute;monstration exp&eacute;rimentale par aspiration une micropipette.

Si &egrave; ipotizzato che citoscheletriche tensione impedisce la separazione di fase su larga scala all&#39;interno della membrana plasmatica delle cellule. Qui, abbiamo microaspirate vescicole unilamellari gigante per determinare l&#39;effetto delle sollecitazioni meccaniche sulla temperatura liquido/liquido miscibilit&agrave; di una membrana composta da una miscela di lipidi ternario. Un aumento della tensione di 0.1 mN/m induce una diminuzione della temperatura di miscibilit&agrave; dell&#39;ordine di pochi decimi di grado K, che convalida le recenti previsioni teoriche.

Aumento della tensione di membrana diminuisce le temperature di miscibilit&agrave;; una dimostrazione sperimentale tramite aspirazione micropipetta.

La capacit&agrave; di rilevare le temperature calde &egrave; fondamentale per mantenere la temperatura corporea ed evitare lesioni in diversi animali, dagli insetti ai mammiferi. Embrioni di Zebrafish, quando data una scelta, attivamente evitare temperature calde e visualizzare un aumento nella locomozione simile a quello visto quando sono esposti a composti nocivi come l&#39;olio di senape. Analisi filogenetica suggeriscono che il singolo zebrafish ortholog TRPV1/2 maggio sono sorti da un precursore evolutivo dei mammiferi TRPV1 e TRPV2. Anzich&eacute; TRPV2, mammiferi TRPV1 &egrave; essenziale per la sensazione di calore ecologicamente rilevanti. Nel presente studio, ci forniscono prove che il canale ionico di zebrafish TRPV1 &egrave; richiesto anche per la sensazione di calore. Al contrario lo sviluppo nei mammiferi, zebrafish TRPV1(+) neuroni nascono durante la prima ondata di sviluppo somatosensoriale neurone, suggerendo una vitale importanza della sensazione termica nei primo sopravvivenza larvale. Analisi in vitro ha dimostrato che zebrafish TRPV1 agisce come un sensore molecolare del calore ambientale (&ge;25 &deg; C) che &egrave; nettamente inferiore rispetto la sensibilit&agrave; della forma dei mammiferi (&ge;42 &deg; C) ma coerente con le soglie misurate in analisi comportamentale. Utilizzando imaging in vivo di calcio con il sensore geneticamente codificati calcio GCaMP3, mostriamo che esprimendo TRPV1 neuroni trigeminali sono attivati dal calore a temperature comportamentale pertinenti. Mediante studi di knock-down, ci mostrano anche che TRPV1 &egrave; richiesto per la normale locomozione indotta dal calore. I nostri risultati dimostrano per la prima volta un ruolo antico di TRPV1 in diretta sensazione di calore ambientale e mostrano che la sensazione di calore &egrave; adattato in modo da riflettere le esigenze specie-dipendente in risposta a stimoli ambientali.

Il ortholog zebrafish di TRPV1 &egrave; richiesto per la locomozione indotta dal calore.

The ability to detect hot temperatures is critical to maintaining body temperature and avoiding injury in diverse animals from insects to mammals. Zebrafish embryos, when given a choice, actively avoid hot temperatures and display an increase in locomotion similar to that seen when they are exposed to noxious compounds such as mustard oil. Phylogenetic analysis suggests that the single zebrafish ortholog of TRPV1/2 may have arisen from an evolutionary precursor of the mammalian TRPV1 and TRPV2. As opposed to TRPV2, mammalian TRPV1 is essential for environmentally relevant heat sensation. In the present study, we provide evidence that the zebrafish TRPV1 ion channel is also required for the sensation of heat. Contrary to development in mammals, zebrafish TRPV1(+) neurons arise during the first wave of somatosensory neuron development, suggesting a vital importance of thermal sensation in early larval survival. In vitro analysis showed that zebrafish TRPV1 acts as a molecular sensor of environmental heat (â‰¥25Â°C) that is distinctly lower than the sensitivity of the mammalian form (â‰¥42Â°C) but consistent with thresholds measured in behavioral assays. Using in vivo calcium imaging with the genetically encoded calcium sensor GCaMP3, we show that TRPV1-expressing trigeminal neurons are activated by heat at behaviorally relevant temperatures. Using knock-down studies, we also show that TRPV1 is required for normal heat-induced locomotion. Our results demonstrate for the first time an ancient role for TRPV1 in the direct sensation of environmental heat and show that heat sensation is adapted to reflect species-dependent requirements in response to environmental stimuli.

The zebrafish ortholog of TRPV1 is required for heat-induced locomotion.

La capacit&eacute; &agrave; d&eacute;tecter des Chaleurs est essentielle pour maintenir la temp&eacute;rature corporelle et d&#39;&eacute;viter les blessures en divers animaux allant des insectes aux mammif&egrave;res. Activement, des embryons de poisson-z&egrave;bre, en fonction d&#39;un choix, &eacute;viter les temp&eacute;ratures chaudes et pr&eacute;sentent une augmentation dans la locomotion comparable &agrave; ceux observ&eacute;s lorsqu&#39;ils sont expos&eacute;s &agrave; des compos&eacute;s nocifs tels que l&#39;huile de moutarde. L&#39;analyse phylog&eacute;n&eacute;tique sugg&egrave;re que l&#39;orthologue zebrafish unique de TRPV1/2 ont pu surgir d&#39;un pr&eacute;curseur &eacute;volutif des mammif&egrave;res TRPV1 et TRPV2. Par opposition &agrave; TRPV2, mammif&egrave;res TRPV1 est essentiel pour la sensation de chaleur de l&#39;environnement. Dans la pr&eacute;sente &eacute;tude, nous montrons que le canal ionique de poisson-z&egrave;bre TRPV1 est &eacute;galement requis pour la sensation de chaleur. &Agrave; l&#39;encontre de d&eacute;veloppement chez les mammif&egrave;res, poisson z&egrave;bre TRPV1(+) neurones surviennent au cours de la premi&egrave;re vague de d&eacute;veloppement neurone somatosensoriel, sugg&eacute;rant une importance vitale de la sensation thermique dans la survie des larves au d&eacute;but. Analyse in vitro ont montr&eacute; que chez le poisson z&egrave;bre TRPV1 agit comme un capteur mol&eacute;culaire de la chaleur (25 &deg; C) qui est nettement inf&eacute;rieur &agrave; la sensibilit&eacute; de la forme chez les mammif&egrave;res (&ge;42 &deg; C), mais conforme aux seuils mesur&eacute;s lors d&#39;essais de comportements. &Agrave; l&#39;aide d&#39;imagerie calcique in vivo avec le capteur cod&eacute; g&eacute;n&eacute;tiquement calcium GCaMP3, nous montrons que les neurones trig&eacute;minaux exprimant le TRPV1 sont activ&eacute;s par la chaleur &agrave; temp&eacute;ratures pertinentes sur le plan comportemental. &Agrave; l&#39;aide d&#39;&eacute;tudes de la pr&eacute;cipitation, nous montrons &eacute;galement que TRPV1 est requis pour la locomotion normale d&#39;induite par la chaleur. Nos r&eacute;sultats d&eacute;montrent pour la premi&egrave;re fois un r&ocirc;le antique pour TRPV1 dans la sensation directe de chaleur environnementale et montrent que la sensation de chaleur est adapt&eacute;e afin de tenir compte des exigences ax&eacute;es sur les esp&egrave;ces en r&eacute;ponse &agrave; des stimuli environnementaux.

Sharona E. Gordon

Department of Physiology and Biophysics

University of Washington

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

Sharona E. Gordon

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University of Washington

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

Department of Physiology and Biophysics