私たちは、電鋳装置を構築するためにブライアンVenema氏とエリック·マーティンソンに感謝します。この作品は、国立衛生研究所の総合医科学の国立研究所からの補助金（SEGへR01GM100718）と国立衛生研究所の国立眼研究所（SEGへR01EY017564）によって賄われていた。

1。有機溶媒からの脂質の沈着：クラッシックプロトコル<ol><li> 。-20℃または-80℃で貯蔵から脂質を取り外し、RTに暖かい注意：脂質は極めて吸湿性であり、多くは酸素に敏感である。乾燥アルゴンまたは窒素ガス中の脂質をカバーし、 すべてのステップで空気への暴露を最小限に抑えることができます 。 </li><li>必要であれば、1から10 mg / mlのでクロロホルム又はシクロヘキサンに脂質を中断、メーカーの規定の濃度は、通常、名目だけであることに注意してください注意：有機溶剤を使用する場合、適切な手袋および他の個人用保護具を着用してください。ほとんどの材料は、まだこれらの溶剤に対して透過性であり、彼らは唯一の一時的な保護を提供するような溶媒は、その上にこぼした場合はすぐにPPEを外します。 </li><li>エタノールを持つ2つの25×37.5ミリメートルITO被覆ガラススライドの両側をきれい</li><li>所望のモル比を達成するために、脂質を混ぜる。リップで被覆するITOスライドの領域のそれぞれ1cm 2のためのイド、ミックス〜脂質の15〜20μgの。両方とも25×37.5ミリメートルスライドが完全に被覆されるべきであった場合、我々は一般的に10 mg / mlの脂質混合物30μlのを使用します（注）。蛍光イメージングのために0.1モル％、テキサスレッド-DPPEを追加し、に関する注意については、以下を参照してください蛍光色素。 </li><li>スライドガラスのITOコーティングされた側が抵抗計またはマルチメータと表面抵抗を測定することにより、上を向いていることを確認します。 </li><li>溶媒耐性シリンジ注意に脂質を吸引：いいえ接着剤やPTFE以外のプラスチック、有機溶剤にお問い合わせください。 </li><li>注射針はかなりITO表面に触れていないと、徐々にスライドを行き来針を動かす脂質を適用します。ガラス表面に &quot;虹の輝き&quot;を探して、均等に表面を覆う。 </li><li> &lt;1トル（1 mmHgの）溶剤の痕跡を除去するための0.5-1時間、真空下で素早くスライドを置きます。不活性ガスで真空を解除します。 </li><li>で、シリコンガスケットを適用する両側のシリコン真空グリースの薄層。スライドの一端で露出むき出しのスライドの5mm以上にしておきます。 </li><li>第4節にすぐ進みます。 </li></ol> 2。制御された脱水のための小さなリポソーム製剤<ol><li>ステップ1.4から1.1のように、脂質混合物を準備します。 </li><li> 10〜15ミリメートル径培養チューブにアルゴンのストリームまたは窒素ガスを用いた脂質を乾かします。脂質の少量の場合は、≤0.5mgを、得られたフィルムを直接残留溶媒を除去するために0.5〜1時間真空下に置いた後、水和することができ、2.5に進みます。脂質の多量でも真空下で、厚いゲル中に有機溶媒をトラップする傾向があり、良好な凍結乾燥により調製され、ステップ2.3-4を参照してください。 </li><li> 、シクロヘキサンで乾燥脂質フィルムを中断ストッパーとアルゴンとシールでカバー、1時間最低-80℃で冷たいブロックと凍結にチューブを配置。 </li><li>真空システムに冷たいブロックと脂質サンプルを置き100トルに達することができる。真空を適用し、それは溶剤昇華オフとして約1Torrで &quot;失速&quot;意志。いったん溶媒が完全に真空がこのレベル以下に低下します（約1時間）に削除されます。不活性ガスで真空を解除し、直ちに管又は水和物を封印。 </li><li>脂質は、真空下でされていますが、脱気水和バッファ真空を使用して15-17を散布。 </li><li>最終濃度1-10 mg / mlので脱気したバッファーを使用して水和物脂質。ゆっくり水和物への脂質を許す。 30分後、1時間、残りの塊を分割するための渦。完全な水和を可能にするために追加の0.5-1時間を待ちます。以下の手順で完全に脱水症状を防ぐために、このような最大200 mmまでのソルビトールまたはスクロースなど、osmoticantを使用してください。 </li><li>押出により100-200 nmの直径リポソームを準備します。詳細については、製造元の押し出しプロトコルを参照してください。バッファは〜25 mMのイオン強度未満持っている必要があります、または特別な電鋳電圧プロトコルは第4節で必要とされることに注意してください。 </li></ol> 3。小さなリポソームの制御脱水によって脂質の堆積<ol><li> 注意：私たちのプロトコルは脂質が多くの時間のために、飽和塩溶液と蒸気の平衡状態に置かれている必要があります。我々は強くグローブボックスまたは類似のエンクロージャを使用して、不活性ガス雰囲気中でプロトコルを実行することをお勧めします。 </li><li> 注意：タンパク質を含む試料を準備した場合、完全な脱水を避ける。水和物は、暖かい水のビーカーを持つ任意のエンクロージャ内の雰囲気、または超音波処理器ベースの加湿器。少なくとも30％の相対湿度があることを確認するために湿度計を使用してください。合計脱水を防ぐために、追加の予防措置として、小さなリポソームバッファ内ソルビトールまたはスクロースを使用してください。 </li><li>適切な相対湿度の飽和塩溶液を準備します。目標湿度は、小胞の準備の浸透圧に依存します。低浸透圧の小胞の準備が十分に脱水することができるしながら生理的浸透圧を有する製剤の場合、30〜45％RHを使用75から90パーセントRH（ 表1も参照）と平衡。 </li><li>インテリア棚でしっかり密閉できる容器に飽和食塩水と過剰な塩分を入れて。非常によくヨーグルトとグラノーラの仕事のための商業食品容器。充填した後に棚を交換し、流体はシェルフの下5〜10ミリメートルであることを確認してください。 </li><li>セクション1のようにITOコートしたスライドを清掃してください。導電性のある側面を決定し、サンプル名と非導電性の面にラベルを付けるためにマルチメータを使用します。 </li><li>軽くグリースつまたは複数の孔を有するシリコーン（USPグレードVI）ガスケット（複数可）の両側。 </li><li>ベンチの上に導電性のスライド側を上に置き、電鋳装置に接続するための一方の端部に露出したスライドの少なくとも5mmがあることを確認し、脂質が適用される各スライドにシリコーンガスケット（s）を適用する。良好なシール性を確保するためにガスケットを滑らかに。 </li><li> 〜1-2 mg / mlのに低塩等張緩衝液中の小胞の準備を希釈。我々は、より高いconcentrを見つける管理ポイントが悪い結果を生む。 </li><li> 1-10液滴内のスライドに脂質を適用します。小さな液滴は、一般的に良い結果を生む。 </li><li>飽和塩溶液上記のインテリア棚の上にスライドを置き、しっかりと容器を密封する。 O / Nに3時間室温で残す容器を4℃で配置することができるが、いくつかの塩のために、RH、温度、およびその冷たいに強く依存することに注意が平衡時間を増加させる。 </li><li>得られたフィルムは、それにわずかに虹の光沢を持っているかもしれませんが、いずれにしてもほぼ乾燥表示されるはずです。高い浸透開始ソリューションは、脂質膜に完全に乾燥することは不可能かもしれないが、これは逆に結果には影響しません。 </li></ol> 4。ジャイアントリポソームの電鋳<ol><li>特に、脂質膜、脱水リポソームから形成されたものは、容易に外れている。 慎重水和物各ウェルは、ガスケット27の端部にGの注射針を配置し、 徐々にバッファを適用することによって。バッファができます水、≤200mMのスクロース、ソルビトール≤1 Mと≤の5mM HEPESを含む。以上の10mM塩溶液は、代替電鋳電圧プロトコルを必要とするかもしれない。 〜10％よくあふれ各ガスケット。 </li><li> 注：一度脂質が水和している、脂質膜はすぐに剥離し始めているので、残りの手順をすばやく進める。電鋳は、速やかに始まる場合収量とサイズが最大化されています。 </li><li> 1滑らかな動きでは、ガスケットの一番上に、第二のITOスライド、導電性の顔を適用します。ガスケットエリア外と最初のオーバーハング反対オーバーハングの少なくとも5ミリメートルを持っていることを確認してください。良好なシール性を確保するために軽く押します。 </li><li>エタノールを使用して2オーバーハングを清掃し、ガスケットが直面している側面があなたのマルチメータを有する導電性であることを確認します。 </li><li>必要に応じてチャンバーはパラフィルムや光テンションスプリングクリップでさらに固定することができる。 </li><li> &quot;、アルミニウムまたは銅バーを固定することによって、電圧源にEMI gaskを電鋳槽を接続するら2つのスライドの導電性表面に泡&quot;、または導電性粘着テープ。私たちはEMIガスケットの泡を使用しています。具とクランプのための計画は、 図5に示します。 </li><li>接点間には電気的短絡がないことを確認し、マルチメータを使用して、連絡先がITO表面に適切に接続すること。 </li><li> 52にDPPC用など 、熱42のチェーン融解温度℃以上、最低10℃℃、室内は10℃現在の脂質のうちのいずれかの最高溶融温度以上Cを加熱</li><li>低塩バッファの場合、60〜90分間、10 Hzの正弦波、2 ITOコーティングされた表面間の各ミリギャップ〜0.7 V RMSを適用。高塩緩衝液については、他の電圧プロトコル（参考文献を参照）を使用すべきである。 </li></ol> 5。イメージングとトラブルシューティング<ol><li>イメージローダミンまたはテキサスレッド染料用のフィルタキューブ装備倒立顕微鏡を用いてリポソームを。リポソームは、球状であるべき主に目で単層、およびそのようなリポソームをオフにぶら下がって &quot;文字列&quot;として欠陥。 </li><li>リポソームが小さすぎると、より少ない脂質を使用する。 </li><li>多くの欠陥または少数のリポソームがある場合、これは、ゲル相脂質に起因する可能性がある。電鋳の温度を上昇させることを検討してください。 </li><li>脱水小さなリポソームから全く形成少ない又は全く巨大リポソーム場合、リポソームバッファの浸透強度を低下させる、または電鋳バッファの浸透強度を高める。濃縮された間質性緩衝液中にバッファの突入は、堆積脂質フィルムの剥離を引き起こす可能性があります。 </li><li>小胞の収量、品質、またはサイズが悪く、あなたは電鋳やリポソームバッファー中の塩またはpH緩衝液が含まれている場合、代替電鋳電圧プロトコルを検討してください。例えば、ポットら 11は 、90分間保持して、Vppは50-1,300 / mで30分かけてからの電圧を上昇させる、500Hzの正弦波を用いて3段階プロトコルを推薦するnは30〜60分かけて50 Hzに周波数を下げる。白金またはチタン電極は、この場合には必要とされ得るが、これは実質的にプロトコルを変更しません。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

巨大リポソームの電鋳は、多様な脂質、準備、およびバッファとの互換性が柔軟な手法へと発展しています。脂質堆積プロセスの注意深い制御が成功にとって最も重要である。私たちは小さなリポソーム製剤簡単なプロセスからの脂質の制御された堆積を作るための簡単​​なツールを提示している。相対湿度は、初期リポソームの適切な脱水するために重要であり、最適値は、リポソーム?...

ジャイアントリポソームは（しばしば巨大な単層小胞、またはGUVsと呼ばれる）は、主に二重層変形、横相共存（ &quot;ラフト&quot;）、膜融合など 1-4の研究を含む脂質二重層の物理学と物理化学を勉強するために使用されている。簡単に周囲の水性緩衝液よりも異ならせることができる水性内部を取り囲む膜の球殻：それらは著しくセル状構造を有している。それらは、定義により、直径が1〜100μmで≈ので、それらは光学顕微鏡様々な手法を用いて撮像することができるされている。それらは、一般的にソフトながら、それらの特性は、取り扱いが簡単に操作できるように、ピンと張っ用いて浸透圧の勾配または機械的に適用された張力を行うことができる。具体的には、リポソームの &quot;剛性&quot;電気生理学のための &quot;リポソームに接続された&quot;又は切除したパッチを形成することが簡単で制御することになる。過去には、イオンチャネルの再構成は、主に平面脂質（b）で実施したilayers。さて、巨大リポソームからパッチを形成し、従来の電気生理学のために開発されたツールのかなりの震え（蛍光顕微鏡、マイクロピペット吸引、急速潅流と温度制御など ） を使用する能力は、再構成の研究5,6のために巨大なリポソームがますます魅力的になります。 巨大リポソームは、多くの戦略によってなされている。乾燥した脂質膜は4,7,8を再水和されたとき、実際には、巨大なリポソームは腫れプロセスによって自発的に形成する。より急速に大きくなる準備をする欲求は、より均一なリポソームは、電鋳1,9そのうちチーフ他のアプローチへの研究を主導した。電鋳はまた、乾燥脂質膜の水和に依存するが、脂質膜を横切る振動電場を印加して処理を高速化する。フィールドまたは水によって分離され、二つの電極、白金線のいずれか、またはインジウムスズ酸化物（ITO）でコーティングされたガラススライドを介して印加されるバッファとその上に脂質が堆積される。リポソームの膨潤をスピードアップすることで、人はより大きなリポソームの高収率を達成しています。したがって、電鋳、巨大リポソーム4を生成するデフォルトの方法となっています。 電鋳のメカニズムは完全には理解されるものではなく、プロトコルのほとんど（ 例えば 、10,11）経験的に開発されている。それにもかかわらず、我々は理論といくつかの実証結果を考慮することによって期待することについて少し学ぶことができます。これは、広く電鋳が堆積脂質膜10,11に積層され、個々の脂質二重層との間のバッファの電気浸透流を駆動することによって起こると考えられている。脂質二重層の熱揺らぎに静電結合はまた、おそらく12複雑です。これらの仮説は、定性的10,12を使用することができる電界の周波数および強度の上限を予測する。特に、その高い導電性溶液を予測している（ <eM&gt;すなわち生理的塩溶液）がリポソーム電鋳12を開始することができる電気流体力を低減。電気浸透流速度は、一般に、塩濃度の増加に伴って減少し、頻繁にいくつかの電界発振周波数（ 例えば 、異なる幾何学的形状、Green ら。13であっても）でピークに達している。したがって、高い電界強度と高い周波数は制限10内、高導電性ソリューションのための合理的である。 しかしながら、膜タンパク質は、その後、薄い脂質フィルムを残すように蒸発させる有機溶媒中、すなわち、electroswelling手順については電極上に脂質を堆積する通常の方法と互換性があると思われる。この難しさの周りに二つの主要な経路があり​​ます：巨大リポソーム形成後にタンパク質を組み込むために、または脂質が堆積されているどのように適応する。我々のアプローチは、脂質とreconstiを堆積させるために他の人5,11上に構築小規模または大規模な &quot;プロテオ&quot;の懸濁液から一緒に膜タンパク質をtuted。我々は、（コリンズとゴードン、 レビューで）他の場所で、タンパク質と脂質を精製からプロテオリポソームを生成する長い、より挑戦的なプロセスについて説明します。ここでは、任意のタンパク質が存在しない場合にプロトコルを記述しますが、タンパク質が組み込まれているとき、それは同じであり、私たちはイオンチャネルTRPV1を含むプロテオがGUVsに変換され、パッチクランプ電気生理学に使用できることを示す結果が含まれています。任意の電鋳アプローチでは、脂質堆積プロセス中の脂質サンプルの目視検査が成功に不可欠である。 我々のアプローチはイオンチャネル再構成に専用アプリケーションを超えて関連しているかもしれません。まず現在、このプロトコルを開発してからの時間で、それはまた、脂質​​電鋳用電極上に積層された方法は、得られたGUVsの組成の不均一性をどのように影響するかが示されている。 BaykアルCaglar ら 14は慎重に脱水リポソームから形成GUVsは、様々なリン脂質とコレステロールの混合物から形成GUVsの混和転移温度で2.5倍小さい変動を有することを示した。彼らの仕事は、その脂質を示し、特にコレステロール、堆積された脂質膜の組成に大きな空間的変動を生じる有機溶媒から析出脂質混合物から沈殿し得る。これは、脂質膜の相挙動の研究のために特に重要であるだけでなく、イオンチャンネル機能に関する定量実験に重要であり得る。バイカル-Caglar らのプロトコルは似ていますが、私たち自身と同一ではない、と読者は、同様にそれを勉強することをお勧めします。 このプロトコルは、（概要、 図1を参照）を使用することができる、多くの一つである。原則電鋳の成功で脂質混合物、水和、温度、他の溶質（特にイオン）、およびに依存もちろん形成に使用される電圧および周波数を。電鋳は、より良い理解になると、我々はより多くの我々のプロトコルを絞り込むことを期待しています。 最後に、巨大リポソームを電鋳で急な学習曲線がしばしばあります。我々は、従来のプロトコル（セクション1と4、そして、必要に応じて、第5項）をリポソーム懸濁液（セクション2-5）から脂質を堆積させるために学習する前にマスタリングを示唆している。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Multimeter</td>
			<td>Agilent Technologies, <a href="http://www.agilent.com" target="_blank">www.agilent.com</a></td>
			<td>U1232A or similar</td>
			<td>Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>117 or 177</td>
			<td>Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>Agilent Technologies, <a href="http://www.agilent.com" target="_blank">www.agilent.com</a></td>
			<td>33210A or similar</td>
			<td>Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 &Omega; load</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITO coated glass slides</td>
			<td>Delta Technologies, Loveland, CO <a href="http://www.delta-technologies.com" target="_blank">www.delta-technologies.com</a></td>
			<td>CB-90IN-S107 or similar</td>
			<td>Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Omega Engineering Stamford, CT <a href="http://www.omega.com" target="_blank">www.omega.com</a></td>
			<td>CNi3233 or similar</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygrometer</td>
			<td>Extech, Nashua, NH, <a href="http://www.extech.com" target="_blank">www.extech.com</a></td>
			<td>445815</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheet</td>
			<td>McMaster-Carr Elmhurst, IL <a href="http://www.mcmaster.com" target="_blank">www.mcmaster.com</a></td>
			<td><a href="http://www.mcmaster.com/#87315K64" target="_blank">87315K64</a></td>
			<td>Use USP Grade VI silicone for its high purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMI gasket</td>
			<td>Laird Technologies <a href="http://www.lairdtech.com" target="_blank">www.lairdtech.com</a></td>
			<td>4202-PA-51H-01800 or similar</td>
			<td>Distributed by Mouser <a href="http://www.mouser.com" target="_blank">www.mouser.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TxR-DHPE</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, CA <a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank">www.lifetechnologies.com</a></td>
			<td>T1395MP</td>
			<td>Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL <a href="http://www.avantilipids.com" target="_blank">www.avantilipids.com</a></td>
			<td>850457P or 850457C</td>
			<td>Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPS</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034P/C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8667</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology

電気生理学的記録のために、化学的に定義された脂質膜へのイオンチャネルの再構成は、これらの重要なタンパク質の機能を識別し、探索するための強力な手法となっています。しかしながら、このような平面的な二重層のような古典的な製剤は、再構成されたチャネルと、その膜環境で行うことができる操作や実験を制限する。巨大リポソームの全表示セル​​状構造は、脂質環境の制御を犠牲にすることなく、従来のパッチクランプ実験を可能にする。 電鋳は効率的で巨大なリポソーム&gt;薄い、順序付けられた脂質フィルムが電極表面に堆積する交流電圧の印加に依存して、直径が10μmを生成することを意味する。脂質は有機溶媒から析出させるために、古典的なプロトコルを呼び出ししかし、それはイオンチャネルと変更する必要がありますようにそれほど強固な膜タンパク質との互換性はありません。最近では、PRotocolsは私達が私達の研究室でタンパク質含有リポソームに適応している部分脱水小さなリポソームから巨大リポソームを電鋳するために開発されている。 我々はここで、背景、装置、技術、および小型のリポソーム分散液から巨大リポソームの電鋳の落とし穴を紹介。我々は従うより挑戦的なプロトコルを試みる前に、最初に習得すべきである古典的なプロトコルで始まる。私たちは、飽和塩溶液と蒸気の平衡を用いた小型リポソームの制御された部分的な脱水のプロセスを示しています。最後に、電鋳自体のプロセスを示す。我々は、高品質のリポソームを生成し、最良の結果を得るために各段階で調製物の目視検査を記述するために自社で製造することができる単純で安価な機器について説明する。

我々の実施例では、約55モル％のPOPC（1 -パルミトイル-2 -オレオイル-sn-グリセロ-ホスホコリン）、15モル％ポップ（1 -パルミトイル-2 -オレオイル-sn-グリセロホスホセリンの混合物からリポソームを調製、30モル％コレステロール、および0.1モル％テキサス1,2 -ジパルミトイル-SN-ホスホエタノールアミン（TxRは-DPPE）赤標識。この組成物は、18後根神経節の脂質の約?...

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Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

定義されている物の巨大リポソームに機能的な膜タンパク質を再構成すると、パッチクランプ電気生理学と組み合わせた強力なアプローチである。しかし、従来の巨大リポソーム生産は、タンパク質の安定性と互換性がないかもしれません。私たちは純粋な脂質やイオンチャネルを含む小さなリポソームから巨大リポソームを製造するためのプロトコルを記述します。

イメージングとパッチクランプ電気生理学用ジャイアントリポソーム製剤

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

giant-liposome-preparation-for-imaging-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Biology

22.1K ビュー.  University of Washington. 定義されている物の巨大リポソームに機能的な膜タンパク質を再構成すると、パッチクランプ電気生理学と組み合わせた強力なアプローチである。しかし、従来の巨大リポソーム生産は、タンパク質の安定性と互換性がないかもしれません。私たちは純粋な脂質やイオンチャネルを含む小さなリポソームから巨大リポソームを製造するためのプロトコル?...

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Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

がくからパッチクランプの静電容量の録音のための方法

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

生物学

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

アフリカツメガエルの卵母細胞で発現イオンチャネルのパッチクランプ記録

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording. We first developed this method for fabricating pipettes suitable for recording from small (&lt;3 m) neuronal cell bodies. The basic principal is similar to glass-blowing and combines air pressure and heat to modify the shape of patch pipettes prepared by a conventional micropipette puller. It can be applied to so-called soft (soda lime) and hard (borosilicate) glasses. Generally speaking, pressure polishing can reduce pipette resistance by 25% without decreasing the diameter of the tip opening (Goodman and Lockery, 2000). It can be applied to virtually any type of glass and requires only the addition of a high-pressure valve and fitting to a microforge. This technique is essential for recording from ultrasmall cells (&lt;5 m) and can also improve single-channel recording by minimizing pipette resistance. The blunt shape is also useful for perforated-patch clamp recording since this tip shape results in a larger membrane bleb available for perforation.

This is a guide to modifying the shape of glass micropipettes. Specifically, by using heat and air pressure the taper is widened without increasing the tip opening, leading to lower pipette resistance. This is critical to obtain low noise recordings of small cells but is useful in many applications.

改善されたパッチクランプ記録のための圧力 - 研磨ピペット

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can be used for many different studies, such as the characterization of membrane-active peptides, the reconstitution of ion channels or investigations on how changes in lipid bilayer properties alter the function of bilayer-spanning channels.  Here, we show how to form a planar bilayer and how to isolate small patches from the bilayer, and in a second video  will also demonstrate a procedure for using gramicidin channels to determine changes in lipid bilayer elastic properties.   We also demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. Here, we demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

電気生理学的実験のための人工二重層の準備

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

脊髄電気生理学

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

イオンチャネル研究のためのパッチクランプおよび灌流のテクニックで表さアフリカツメガエル卵母細胞

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

パッチクランプ電気生理学および圧力筋運動記録法を用いた動脈平滑筋KV7カリウムチャネル機能を探る

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

イメージングと免疫組織化学のための網膜ホールマウントの準備のために最適化されたプロトコル

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

一チャネルセル付パッチクランプ法

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

膜貫通タンパク質の再構成、顕微鏡およびパッチクランプ研究のための巨大単膜小胞への電位依存性イオンチャネル、KvAP、

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...