乳腺イメージングの窓からDendra2 Photoswitching

要約

乳腺画像ウィンドウを通してDendra2標識腫瘍細胞の生体内photoswitchingとトラッキングは、私たちは、画像間のタイムスケール上の選択された腫瘍の微小環境における腫瘍細胞の転移挙動をするという技術です。

要約

シングルセルの解像度でマウスとラットの乳腺腫瘍の過去10年間で、生体顕微鏡

プロトコル

1。乳腺脂肪体に腫瘍細胞の注入を用いて蛍光腫瘍の発生：

1. 80％コンフルエント - 40にDendra2タンパク質を（細胞質マーカーなど）を発現する細胞株を成長する。
2. PBS W / OのCa ²で料理を少なくとも3回リンス⁺やMg ^{2 +。}
3. ° C細胞のほとんどはそれを振るために平らな表面に皿をヒットしてデタッチとなるまで37℃で10cmディッシュとインキュベート当たりトリプシンの3 mlを加え。
4. 皿からすべてのセルをすすぎ、そして同様に行列を収集するためにスクレーパー（ラバーポリス）を使用してください。 PBS 5 mlを加える。遠心操作中にカウントするように注してください。
5. 5分間800gで遠心する。
6. 吸引し、5の濃度にPBSで再懸濁します- 10 ^{6 / mlの} 10倍。 （30分以内に注入）注入するまで氷上で保管してください。
7. 無菌フード内4から5週齢の雌の免疫欠損マウス（例えば、SCID）を含むケージを置きます。
8. 70％エタノールで4日（腹部）ニップルの周りにスプレーしてください。
9. 乳腺脂肪体に0.1 mlを注入する。助手を見つけることができる場合は、一人は場所でマウスを保持することができます一方、他の挿入乳腺脂肪体の内側針。自分で注入している場合は、イソフルランを使用して光麻酔下にマウスを置く。
10. 腫瘍5-7 mmに成長した後、乳腺イメージングウィンドウ（MIW）を挿入してください。
    注：別の方法として、いくつかのアプリケーションのために、MIWが健康な乳房脂肪パッドの上に挿入することができると細胞はその後注入することができます。そのアプローチは、生理的環境の中で一過性にトランスフェクションされた細胞のイメージングを可能にします。

2。乳腺イメージングウィンドウ（MIW）のマニュアル製作：

1. MIWs（図1A）は、生体適合性を保証するために、組織グレードプラスチックで作られています。手動の建設のために、我々は、5または10cmの皿を使用。
2. でラテックス手袋を置く。
3. 組織培養皿を加熱し、加熱料理（我々はこのために1インチdremmelのビットを使用）に対して丸みを帯びた、ハードオブジェクトをプッシュすることで曲面をレコード生成。
4. 加熱されたカミソリの刃を使用して皿の中央を切り取ります。
5. ドーム形のプラスチック製のベース（直径6〜7ミリメートル）の中央に穴を作るために小さな、円錐形のdremmelのビットを使用してください。
6. dremmelでそれをサンディングし、さらにそれを提出することにより、プラスチックベースのエッジが完全に滑らかにしてください。
7. ガラスのカバースリップのための平らな面を作るプラスチックベースの上を提出。提出された、平らな面の直径は9〜10ミリメートルでなければなりません。
8. 瞬間接着剤を使用して平らな表面上に接着剤8ミリメートルの円形ガラスカバースリップ（番号1）（シアノアクリレート系接着剤）。
9. 乾燥して接着剤（15分）を待ちます。
10. 外側（ガラスがどこにある）から、ベースの内側にパンクチュアeight縫合穴を作るために加熱された26G針を使用してください。穴は均等に離れてカバースリップの端0.5〜1ミリメートル、カバースリップの周りに分布しているはずだ。
11. 5から0の縫合針を使って穴を広げる。
12. プラスチックベースに穴に穴を開けると内側の表面が不均一になります。サンドペーパーを使用して、この表面が完全に滑らかにします。
13. 小さなブラシを使ってMIWから小さなプラスチックの粒子の手袋とブラシを変更します。
14. 脱イオン水でMIWを洗ってください。
15. 70％エタノールを使用してMIWを洗ってください。それが完全に透明であるので、ガラスをきれいにするQ -ティップを使用してください。接着剤蒸気から現在の霧のスポットがある場合は、Q -ティップでアセトンを慎重に使用してください。
16. 各サイドで3時間UV照射によってMIWを滅菌する。

：乳腺イメージングウィンドウ（MIW）のセミマニュアル製作

プラスチック基材を作製するために、我々は現在、シリコーンゴム鋳型を使用していると、手作りのMIWsを使用して作成。金型は、ポリエステル樹脂を充填してから、すぐに一緒に参加して前面と背面元の両方の正確な複製を作成するシリコーンゴムの2つの部分から構成されます。液体ポリエステル樹脂は、一緒に午前9時10分混合し、完全に48時間で硬化ハード構造の結果さ。プラスチックは、分解または時間の経過とともに黄色になることなく、保護されたUVとアーカイブです。
ベースが硬化した後、ステップ2.8から2.16までは手動で製MIWsの場合と同じ方法で行われます。

3。 MIWの挿入：

1. 4 ^番目の乳首周辺には、セルのタイプ（図1B）に応じて、腫瘍細胞の注射後に小さい（5-7 mm径）腫瘍数日/週が必要です。 Dendra2 photoswitchableタンパク質または他の蛍光タンパク質を発現する細胞の注入が使用される細胞株に依存して後どのくらいの時間が経過した。腫瘍が目に見えて壊死とすべきではなく、腫瘍の上に髪の正常な皮膚を持つ必要があります。壊死性腫瘍を持つマウスを安楽死されるべきである。
2. 無菌フード内滅菌布を下に手術レイのための無菌空間を準備します。滅菌gの部分を入れて途中でauze、そしてその周りにいくつかのMIWsと滅菌器具を築く：私たちは小さな標準はさみ、春のはさみ、microdissectingピンセット、microdissecting鉗子、ニードルホルダーを使用してください。滅菌綿棒、フードの隅に70％エタノールと滅菌手袋のボトルキープ。
3. マウスは、HBSSに2.5％AVERTINのIP注入（20μlの/ g）を用いて無菌フード内で麻酔または、代わりに10μg/ kgのケタミン+ 10μg/ gのキシラジン（承認および発注については、動物のケア研究所にお問い合わせください）​​。
   注：AVERTIN溶液を調製する必要が隔週、0.22μmのフィルターフィルターと4で500μlのアリコートとして保存されている使用して滅菌℃（暗所で）。
4. 小動物のシェーバーを使用して腫瘍の上の領域を削って、髪を取り外します。
5. Nairさんの脱毛クリームを（任意のドラッグストアで入手可能）を使用して毛の残りの部分を削除します。エタノールに浸した綿棒を使って肌をきれいにします。
6. 滅菌ガーゼの上に動物を移し、乾燥や感染からそれらを保つために眼に眼軟膏を適用する。
7. betadineで皮膚を殺菌し、70％エタノールで洗浄。
8. 無菌フード内滅菌外科布の上に動物を譲渡する。
9. 皮膚に鉗子とカット〜2mmの切開を使用してニップルにすぐに内側の皮膚を引っ張る。
10. 解剖ハサミとピンセットを用いて皮膚から、基礎となる乳房脂肪パッドを区切ります。 MIWの挿入を収容する大きさにこの分離工程の間に皮膚や穴のストレッチ。
11. 誤って血管がsugery中にヒットされている場合は、/過大になるの出血を止めるために作られている任意の血液を除去するために滅菌綿棒を使用してください。
12. 非吸収糸と逆方向カット針を使ってその場でMIWの基盤と縫合糸の上に皮膚があるようなMIWを挿入します。
13. 縫合穴を埋めると皮膚にMIWを確保するために組織接着剤またはシアノアクリレートを使用してください。
14. TMP - SMX抗生物質ミックスを追加：（スルファメトキサゾール0.6 mg / mlの、トリメトプリム0.12 mg / ml）を手術の前後3日間ケージの水のボトルに。
15. 動物はAVERTIN IP注入後1 - 4Hのために麻酔下にとどまります。手術は一般的に〜45分かかるので、それは動物がその後回復に役立つことが重要です。
16. ケージの底に手を加温パッド（37 ° C）を（薬局で入手可能）に置き、ガーゼをかぶせます。
17. それはその胃をオンにして歩いて開始されるまでパッドの上に動物を保管してください。
18. 動物が3時間以上の間意識不明の場合は、水分補給のためのHBSS腹腔内に0.3 mlを注入する。
19. 動物は、最初のイメージングセッションが行われる前に、次の3-4日間にわたって回復するために許可されています。

4。イメージングボックスの構造

イメージングボックスは、MIWは、右の顕微鏡対物の上に、平らに座っていることを保証します。また、イソフルランの一定の空気の流れを通して、温度と麻酔の制御を容易にします。ボックスはプレキシガラス製とプラスチック製の溶接を使用してくっついています。それは特定の顕微鏡のステージに装着されているため、その底部の形状が（図2ライカSP5の顕微鏡ステージに取り付けられたボックスのスキームを示しています）使用顕微鏡によって異なります。
センチメートル単位でボックスの寸法はL = 11.4センチ、ワット= 7.6センチ、H = 4.4センチメートル（図2A）です。ボックスの下部には、ライカSP5の顕微鏡ステージ内に収まる中空板、サイズの12.7x8.4 cmの、二つのスライディング"ドア"、5.7 × 5.7 cm_each、円形の開口部を形成する（D = 2.22 cmの構成）閉じたとき。 MIWは、この開口部に収まる。サイド部分の一つが真空につながる出口穴が含まれている状態で、フロント部分は、麻酔の配信のための入口穴が含まれています。
コンデンサーとスライドホルダーは、イメージングボックスの配置する前に削除する必要があることに注意してください。

5。イメージングボックスの使用

1. イソフルラン麻酔下で動物を置き、目に眼軟膏を適用する。
2. 入口の穴（図2B）の外側に、麻酔器からイメージングボックスの前面にイソフルラン排気を取り付けます。
3. イメージングボックスの出口穴に2本目のチューブを取り付けます。このチューブは、ガスフィルターにして真空に接続する必要があります。
4. ボックスの蓋を開き、ボックスの扉を開いて、動物、底部が直面しているMIWの側に配置し、ボックスに扉をスライド。
5. ボックスを持ち、MIWのベースがそれらの間に保持し、固定化されるように、底部の扉を調整する。 MIWのカバースリップがこのレベルより下のわずか数ミリメートルでなければならない一方MIWのベースは、イメージングボックスのドアと同じレベルにする必要があります。下部の扉ボックスに平行、スライドドアを底面との間MIWの位置はカバースリップ（MIWのガラス部分）が平らになることを保証することを確認してください。これは、適切なピント合わせが保証されます。
6. 上のボックスの配置のためのスペースを可能にするために、顕微鏡対物レンズを下げる顕微鏡ステージの上。
7. 顕微鏡ステージ上にボックスを配置し、MIWのカバースリップが目標より上になるように段階を調整する。
8. 客観的にフォーカスし、イメージングを起動します。
9. イソフルランの使用中に、動物が呼吸の周波数の目視検査によって監視する必要があります。これは、または画像コレクション（これらは、データ収集を妨げることができる）中に出現する呼吸のアーチファクトの頻度を監視することによって、視覚的に行うことができます。 MouseOxパルスオキシメトリーシステム（スター生命科学コーポレーション）が正常に使用されています。そうすればデータは、動物にチェックするために部屋の上のライトをオンにすることなく継続的に収集することができます。
   注：各画像のセッションの後、動物の回復がガーゼまたはキムワイプで小さな手の加熱パッドをラップし、ケージの中に動物の下に置くことによって促進されるべきである。
   注：浸対物レンズがMIWを通してイメージするために使用されている場合は、液浸媒体（グリセリン、水、油が）画像ウィンドウをオフに洗浄する必要があります。 MIWは、撮像中に発生した可能性のある亀裂やその他の損傷がないか点検してください。これは、複数のイメージングセッション中にデータを収集するために重要です。

6。 Dendra2 -標識細胞のPhotoswitchingとイメージング

手順は、ライカSP5共焦点顕微鏡のために説明されています。最適化するためのガイドとして使用される他の共焦点顕微鏡を使用するか、多光子イメージングをセットアップするときに焦点面でのレーザーのパワー、使用可能な目標とソフトウェアオプションは変わるため、プロトコルは以下のとおりあなたの顕微鏡での実験。

1. 緑色の蛍光フィルターとアイピース（10倍）を介して腫瘍を観察することによって、目に見えて流れると同じ焦点面に平らに敷設されている主要な血管を探します。
2. PMT検出へのフィールドとスイッチの中央の船の一つの位置。
3. 2つのチャネルを連続イメージングのコレクションを設定します。チャネルの1つは488nmのレーザーライン（10％消費電力）を使用し、Dendra2（505 - 540nm）の緑色の形から細胞外マトリックス（480 - 495nm）と排出量からの散乱を収集します。番目のチャネルは、543nmのレーザライン（90％消費電力）を使用し、Dendra2の赤の形（555 - 600nmの）からの発光を収集します。 3D画像プリphotoswitchingを収集する。
4. フォトスイッチに405nmのレーザーラインを（30％の電力、20-40スキャン）を使用してセルの選択された人口をROIスキャンオプションを使用します。スイッチングを監視するタンパク質の赤形の放射を収集する。
5. 6.3のと同じシーケンシャルルーチンを使用して、ポストスイッチング3D画像を収集する。
6. 腫瘍内の複数の領域をphotoswitching場合、それは緑と赤の両方のチャンネル（図3A、B）で、デジタルカメラを使用して、接眼レンズを通して写真を撮影することをお勧めします。これにより、その後のイメージングセッション中に方向に役立ちます。
   注：さらに、血管が一時的に蛍光デキストラン（カスケードブルー又はAlexa Fluor 647、両方10kDa）の尾静脈注射を用いて標識することができます。注射後数時間、デキストランは血管を残し、恒久的にマクロファージにラベルを付けます。

代表的な結果：

図3Cは、血管（無蛍光）からの相対直交指向長方形photoswitchedの領域（赤）を示しています。細胞外マトリックスからの散乱が紫のときに非photoswitched細胞は、緑色です。画像はZ軸（20-50μmの深さ）に沿って4つのイメージの最大強度投影です。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS w/o Ca, Mg	GIBCO, by Life Technologies	14190-144
Trypsin	GIBCO, by Life Technologies	25300
HBSS	GIBCO, by Life Technologies	14025
DMEM media (MDA-MB-231 cells)	GIBCO, by Life Technologies	11965
Isoflurane(Aerrane)	Baxter Internationl Inc.	# NDC 10019-773-40
SCID mouse	National Cancer Institute	N/A
Culture dishes	BD Biosciences	353003	Custom Order
Circular coverslip 8 mm	Scientific, Inc.	8CIR-1-FIS