Dendra2 Photoswitching através da janela de imagem mamária

Resumo

Photoswitching intravital e acompanhamento de Dendra2 marcado células tumorais através da janela de imagem mamária é uma técnica que nos permite a imagem do comportamento metastático das células tumorais em microambientes tumorais escolhido em detrimento de uma escala temporal de dias.

Resumo

Na última década, microscopia, intravital de tumores de mama em camundongos e ratos com uma única célula de resolução

Protocolo

1. Geração de tumores fluorescentes usando a injeção de células tumorais mamárias no teclado de gordura:

1. Crescer uma linhagem de células expressando Dendra2 proteínas (como um marcador citoplasmático) para 40-80% confluência.
2. Enxaguar pratos, pelo menos, 3 vezes com PBS w / o Ca ^{2 +} ou Mg ^{2 +.}
3. Adicionar 3 ml de tripsina por 10 centímetros prato e incubar a 37 ° C até que a maioria das células separar e em seguida, bateu o prato contra uma superfície plana para agitá-lo.
4. Lave bem todas as células fora do prato, e use um raspador (policial de borracha) para coletar matriz também. Adicione a 5 ml de PBS. Tomar uma alíquota para contar durante a centrifugação.
5. Centrifugar a 800 g por 5 min.
6. Aspirar e ressuspender em PBS a uma concentração de 5 - 10 ml ^{6 /} 10x. Loja em gelo até injetada (injetar dentro de 30 min).
7. Coloque uma gaiola contendo 4-5 semanas de idade do sexo feminino imunológico camundongos deficientes (por exemplo, SCID) dentro de uma capa estéril.
8. Pulverizar a área ao redor do mamilo (abdominal) 4 com etanol 70%.
9. Injetar 0,1 ml em almofada de gordura mamária. Se um assistente pode ser encontrado, uma pessoa pode manter o mouse no lugar enquanto o outro insere a agulha dentro do pad mamárias gordura. Se você está injetando por si mesmo, coloque o mouse sob anestesia luz usando isoflurano.
10. Uma vez que o tumor cresceu para 5-7 mm, a janela de imagem mamária (MIW) deve ser inserido.
    Nota: Como alternativa, para algumas aplicações, o MIW pode ser inserido na parte superior do pad mamárias saudáveis ​​de gordura e as células podem ser injetadas em seguida. Essa abordagem permite imagens de células transfectadas transitoriamente em um ambiente fisiológico.

2. Fabricação manual da janela de imagem mamária (MIW):

1. MIWs (Figura 1A) são feitos de plástico de grau de tecidos para garantir biocompatibilidade. Para a construção manual, usamos 5 ou 10 pratos cm.
2. Coloque luvas de látex por diante.
3. Aquecer um prato de cultura de tecidos e creat uma superfície curva, empurrando um objeto arredondado duro contra o prato aquecido (usamos um de 1 polegada bit dremmel para isso).
4. Recorte o centro do prato usando uma lâmina aquecida.
5. Use uma pequena, em forma de cone bit dremmel para fazer um buraco no centro da cúpula em forma de base de plástico (6-7mm de diâmetro).
6. Faça as bordas da base de plástico completamente lisa lixando com a dremmel e ainda arquivá-lo.
7. Arquivo na parte superior da base de plástico fazendo uma superfície plana para a lamela de vidro. O diâmetro do arquivado superfície plana e deve ser 9-10mm.
8. Cole a 8 milímetros de vidro circular lamela (número 1) na superfície achatada usando o superglue (cianoacrilato).
9. Aguarde a cola secar (15 minutos).
10. Use uma agulha aquecida 26G para fazer oito furos sutura punção do lado de fora (onde o vidro é) para o interior da base. Buracos devem ser distribuídas uniformemente ao redor da lamela, 0,5-1mm de distância da borda da lamínula.
11. Alargar os furos com uma agulha de sutura 5-0.
12. Perfurando buracos na base de plástico fará a superfície interna irregular. O uso de papel de areia, fazer esta superfície completamente lisa.
13. Alterar as luvas e escova de pequenas partículas de plástico do MIW usando uma escova pequena.
14. Lave o MIW com água deionizada.
15. Lave o MIW utilizando etanol 70%. Usar um Q-dica para limpar o vidro de modo que é completamente transparente. Se houver manchas nebuloso presente desde o vapor de cola, cuidadosamente usar acetona com um Q-Tip.
16. Esterilizar o MIW pela exposição aos raios UV por 3 h em cada lado.

Semi-Manual de fabricação da janela de imagem mamária (MIW):

, A fim de fabricar a base de plástico, estamos usando atualmente moldes de silicone de borracha de fundição criado usando hand-made MIWs. O molde é composto de duas partes de borracha de silicone que fazem uma réplica exata de frente e verso do original quando preenchidos com resina de poliéster e logo em seguida se uniram. A resina de poliéster líquido é misturado 09:10 e resulta em uma estrutura dura quando completamente curado em 48h. O plástico é UV protegidas e de arquivo, sem quebrar ou tornar-se amarela ao longo do tempo.
Após a base está curada, 2,8-2,16 passos são feitos da mesma forma que para MIWs manualmente-made.

3. Inserção do MIW:

1. A área ao redor do mamilo 4 ^ª deve ter um pequeno (5-7 mm de diâmetro) tumor vários dias / semanas após a injeção das células tumorais, dependendo do tipo celular (Figura 1B). Quanto tempo se passou após a injeção de células que expressam proteínas Dendra2 photoswitchable ou outras proteínas fluorescentes depende da linha celular utilizada. O tumor não deve ser visivelmente necrotic, e deve ter uma pele intacta com o cabelo em cima do tumor. Camundongos com tumores necróticos devem ser sacrificados.
2. Prepare o espaço estéril para a cirurgia de fixar um pedaço de pano estéril dentro de uma capa estéril. Coloque um pedaço de g estérilauze no meio, e estabelecer uma MIWs poucos e instrumentos esterilizados em torno dele: usamos pequena tesoura standard, tesoura primavera, pinças microdissecting, fórceps microdissecting, porta-agulhas. Manter estéreis Q-dicas, uma garrafa de álcool 70% e luvas estéreis no canto da capa.
3. O mouse está anestesiado na capa estéreis, utilizando injeção IP de Avertin 2,5% (20 l / g) em HBSS ou, alternativamente 10 ketamina mg / kg + 10 mg / g de xilazina (em contato com o Instituto Animal Care para aprovações e ordenação).
   Nota: A solução deve ser preparada Avertin bi-semanal, esterilizado por filtração através de um filtro de 0,22 mM e armazenado como 500 mL em alíquotas de 4 ° C (no escuro).
4. Depilação, raspar a área acima do tumor usando um barbeador de pequenos animais.
5. Remover o resto do cabelo usando Nair creme de depilação (disponível em qualquer farmácia). Limpar a pele utilizando etanol mergulhado Q-dicas.
6. Transferência do animal para a gaze esterilizada e aplicar pomada oftálmica nos olhos para mantê-los a partir de secagem e infecção.
7. Esterilizar a pele com betadine e limpa com álcool 70%.
8. Transferência do animal em um pano cirúrgica estéril dentro do capô estéril.
9. Puxe a pele imediatamente medial ao mamilo usando uma pinça e corte incisão ~ 2 milímetros na pele.
10. Separar os pad mamárias de gordura subjacente da pele com uma tesoura de dissecção e uma pinça. A pele e esticar buraco durante esta etapa de separação para um tamanho que irá acomodar a inserção do MIW.
11. Se acidentalmente um navio é atingido durante sugery, use um estéril Q-dicas para remover qualquer vestígio de sangue que é produzido / para parar o sangramento se torne excessivo.
12. Insira o MIW tal que não é a pele em cima da base MIW e sutura no local usando fio não absorvível e reverter o corte da agulha.
13. Use tecido adesivo ou cianoacrilato para preencher os buracos e proteger a sutura MIW para a pele.
14. Adicionar SMX-TMP mix de antibióticos: (Sulfametoxazol 0,6 mg / ml, Trimetoprima 0,12 mg / ml) para a garrafa de água gaiola por 3 dias antes e depois da cirurgia.
15. O animal permanece sob anestesia por 1-4h após a injeção Avertin IP. Desde a cirurgia normalmente leva ~ 45min, é importante para ajudar o animal recuperar mais tarde:
16. Coloque uma almofada de aquecimento mão (37 ° C) (disponível em farmácias) na parte inferior da gaiola e cubra-a com gaze.
17. Manter o animal em cima da almofada até que fique em seu estômago e começa a andar.
18. Se o animal estiver inconsciente por mais de 3h, injetar 0,3 ml de HBSS via intraperitoneal para a reidratação.
19. O animal é permitido para se recuperar ao longo dos próximos dias 3-4 antes da sessão primeira imagem ocorre.

4. Construção de imagens Box

A caixa de imagem garante que o MIW está sentado plano, logo acima da objetiva do microscópio. Além disso, facilita o controle de temperatura e fluxo de ar através de anestesia constante de isoflurano. A caixa é feita de acrílico e colados usando solda de plástico. Está equipado para a fase microscópio específico e, portanto, a forma de seu fundo varia de acordo com o microscópio utilizado (Figura 2 mostra o esquema da caixa montado Leica estágio do microscópio SP5).
Dimensões da caixa em centímetros são l = 11,4 cm, w = 7,6 cm, h = 4,4 cm (Figura 2A). A parte inferior da caixa consiste de uma placa oca, 12.7x8.4 cm de tamanho, o que se encaixa dentro do estágio do microscópio Leica SP5, e duas de correr "portas", 5,7 X 5,7 cm_each, que formam uma abertura circular (d = 2,22 centímetros ) quando fechado. O MIW se encaixa nessa abertura. A parte frontal contém o orifício de entrada para a entrega da anestesia, enquanto uma das partes laterais contém um orifício de saída que leva ao vácuo.
Note-se que o condensador eo suporte de slides precisam ser removidas antes da colocação caixa de imagem.

5. Box imagem Use

1. Colocar o animal sob anestesia com isoflurano e aplicar pomada oftálmica nos olhos.
2. Anexar o isoflurano escape do aparelho de anestesia para a frente da caixa de imagem, do lado de fora do orifício de entrada (Figura 2B).
3. Anexar um segundo tubo para o orifício de saída da caixa de imagem. Este tubo deve ser conectado ao filtro de gás e depois para o vácuo.
4. Abra a tampa da caixa e abrir as portas caixa e colocar o animal, MIW lado voltado para o fundo, e as portas deslizantes na caixa.
5. Segure a caixa e ajuste as portas inferior de modo que a base é mantida MIW e imobilizado entre eles. A base MIW deve estar no mesmo nível que as portas caixa de imagem, enquanto a lamela MIW deve ser apenas alguns milímetros abaixo deste nível. Certifique-se que o posicionamento do MIW entre o fundo portas de correr garante que as lamelas (parte de vidro da MIW) está flat, em paralelo com as portas de fundo da caixa. Isto irá assegurar foco adequado.
6. Inferior a objetiva do microscópio, para permitir espaço para a colocação da caixa nosuperior do palco microscópio.
7. Coloque a caixa sobre o estágio do microscópio, e ajustar o estágio para que a lamela MIW está acima do objetivo.
8. Foco o objetivo e começar de imagem.
9. Durante o uso de isoflurano, o animal deve ser monitorado por inspeção visual da freqüência respiratória. Isto pode ser feito visualmente, ou através do monitoramento da freqüência de artefatos de respiração que aparecem durante o exame de coleta (estes podem interferir com a aquisição de dados). O MouseOx sistema de oximetria de pulso (Starr vida Sciences Corp) tem sido utilizado com sucesso. Dessa forma, os dados podem ser coletados continuamente, sem acender as luzes na sala para verificar o animal.
   Nota: Depois de cada sessão de imagens, recuperação de animais deve ser facilitada envolvendo uma almofada de aquecimento pequena mão em gaze ou kimwipes e colocá-lo sob o animal na jaula.
   Nota: Se uma objetiva de imersão é usado para a imagem através do MIW, o meio de imersão (glicerol, óleo, água) deve ser removido da janela de imagem. O MIW devem ser inspecionados por qualquer rachaduras ou outros danos que possam ter ocorrido durante o exame. Isto é crítico para a coleta de dados durante as sessões de imagens múltiplas.

6. Photoswitching e imagem de Dendra2 marcado com células

O procedimento é descrito para o microscópio confocal SP5 Leica; a potência do laser no plano focal, os objectivos e opções disponíveis variam de software ao utilizar outros microscópios confocal ou imagem multifotônica configurar e, portanto, o protocolo descrito a seguir deve ser usado como um guia para otimizar a experiência no seu microscópio.

1. Ao observar o tumor através da ocular (10x) com o filtro de fluorescência verde, localizar os vasos sanguíneos principais que são visivelmente fluindo e deitado no mesmo plano focal.
2. Posição de uma das embarcações no centro do campo e mudar para a detecção PMT.
3. Estabelecer a recolha de imagens seqüenciais para dois canais. Um dos canais utiliza linha de laser 488nm (10% de energia), e coleta de dispersão da matriz extracelular (480-495nm) e de emissão a partir do formulário verde do Dendra2 (505-540 nm). O segundo canal usa a linha de laser 543nm (90% de energia) e coleta de emissão a partir do formulário de Dendra2 vermelho (555-600nm). Coletar imagens em 3D pré-photoswitching.
4. Use o ROI opção de digitalização para photoswitch uma população escolhida de células usando a linha de laser de 405nm (30% de potência, scans 20-40). Colete de emissão do formulário de vermelho da proteína para monitorar a mudança.
5. Usando a mesma rotina seqüencial como no 6.3, coletar pós-mudança das imagens 3D.
6. Se photoswitching mais de uma região do tumor, recomenda-se para tirar fotos através do oculares usando uma câmera digital, em ambos os canais verde e vermelho (Figura 3A, B). Isso vai ajudar na orientação durante as sessões de imagem subseqüentes.
   Nota: Além disso, os vasos sanguíneos podem ser temporariamente rotulados com cauda veia-injeção de dextran fluorescentes (Cascade azul ou Alexa Fluor 647, ambos 10kDa). Poucas horas após a injeção, dextranos vai deixar os vasos sanguíneos e permanentemente rótulo dos macrófagos.

Resultados representativos:

Figura 3C mostra uma região retangular photoswitched (vermelho) orientada ortogonalmente em relação ao vaso sanguíneo (ausência de fluorescência). Não photoswitched células são verdes, enquanto a dispersão da matriz extracelular é roxo. Imagem é uma projeção de intensidade máxima de quatro imagens ao longo do eixo Z (20-50 profundidade mm).

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS w/o Ca, Mg	GIBCO, by Life Technologies	14190-144
Trypsin	GIBCO, by Life Technologies	25300
HBSS	GIBCO, by Life Technologies	14025
DMEM media (MDA-MB-231 cells)	GIBCO, by Life Technologies	11965
Isoflurane(Aerrane)	Baxter Internationl Inc.	# NDC 10019-773-40
SCID mouse	National Cancer Institute	N/A
Culture dishes	BD Biosciences	353003	Custom Order
Circular coverslip 8 mm	Scientific, Inc.	8CIR-1-FIS