ヒト胚性幹細胞の文化とメンテナンス

要約

このプロトコルは、健康的、未分化ヒト胚性幹（ES）細胞を維持する方法を示します。

要約

ヒト胚性幹（ヒトES）細胞は健康な、未分化の文化を維持するために監視し、世話する必要があります。最低でも、文化が失われた栄養素を補充すると、不要な分化因子の自由な文化を維持するために完全な培地交換を行うことにより、毎日供給する必要があります。分化の少量が正常と幹細胞培養に期待ですが、文化は、日常的に手動で削除し、または差別化の領域を"ピッキング"でクリーンアップする必要があります。識別し、ヒトES細胞培養物から過剰な分化を削除すると、細胞の健康な個体群の維持に不可欠なテクニックです。

プロトコル

1。メンテナンス：顕微鏡下で観察する文化

1. 37℃のインキュベータからヒトES細胞の一つのプレートを取り外し、顕微鏡にもたらす。
2. 全体的な文化の質を評価するために、2倍または5倍の倍率を使用して、低消費電力でのコロニーを観察します。通常の培地の色、目に見える汚れ、全体のコロニーの大きさ、質および密度の欠如、および、他の観測：次の点に注意してください。
3. 培地の色の変化を観察する。 pHの変化とヒトES細胞との一晩のインキュベーション後の培地中の栄養素の枯渇のために、媒体が"わら"色に赤の色相から変わります。培地が紫表示された場合は、基本的なpHのシフトが発生しました。媒体は非常に黄色が表示された場合、媒体が酸性化している。非常に黄色の培地はよくまたは汚染に非常に過密なコロニーの結果である可能性があります。培地は、常に明確に表示されます。培地中の細胞残渣の一定のレベルは正常ですが、それは曇って見えることはありません。細胞残渣の高レベルが観察されている場合は、文化は健全ではないと汚染されることがあります。
4. 文化は保守や継代を必要としない場合、それらは（セクション2を参照）に供給できるように生物学的安全キャビネットに撮影することができます。
5. 培養物が約10％のコロニーを差別化よりも多く含まれている場合は、セルを手動で差別化された領域（セクション3を参照）を削除して"クリーンアップ"する必要があります。
6. 文化は大規模または密集コロニーが含まれている、またはMEFフィーダー層以上12日間経過している場合、セルは（セクション4を参照）継代してください。

2。摂食hES細胞

1. 無菌生物学的安全キャビネット内で、培養皿の蓋を外し、使用済み培地を吸引除去する。ピペットの先端が直接井戸内よりも他の板の任意の部分に触れないようにしてください。汚染の心配がある場合は、新しい、滅菌ピペットに変更。
2. 滅菌ガラスピペットを用いて、各ウェルに加温し、ヒトES細胞培養培地の適切な量を追加します。 6ウェルプレートでの培養のために、ウェルあたり2.5mlの培地を加える。
3. 37℃、5％CO ₂で推移するインキュベーターにプレートを返します。

3。ヒトES細胞培養物から差別を削除する

1. 成形アルコールバーナーの制御された炎上のヒントでピッキングツールに9インチのガラスパスツールピペットを変換します。ピペットの先端が汚染を防ぐために密封し、培養皿のプラスチックに傷をつけないように丸められることを確認してください。生物学的安全キャビネットまたはピッキングの筐体にUV光源を使用して、使用前にピッキングツールを滅菌する。
2. 差別化の領域を削除します。分化は、多くの場合、通常のエッジに沿って、または中央に孤立したスポットとして、ヒトES細胞のコロニーの一部のみで発生します。コロニーのセクションのみが差別されている場合は、唯一の差別化された領域を削除する必要があります。差別は、しばしば"スティッキー"シートでプレートをオフに持ち上げることができる、そしてそれはピッキングツールの終わりに植民地を通る線を描画することにより、コロニーの残りの部分から分化した細胞を最初に分離すると便利です。
3. コロニーの部分が分離されると、静かに不要な細胞を分離するためにプレートに沿って、ピッキングツールを滑ります。この過程で植民地の間にあまりにも多くのMEFフィーダー層のを削り取るように注意してください。
4. 分化した細胞のすべてが、プレート（と培地中に浮遊）から削除すると、生物学的安全キャビネットに文化を返します。分化細胞を含む培地を吸引除去し、新鮮なヒトES細胞培養培地と交換してください。

4。継代ヒトES細胞

酵素のインキュベーション

1. 無菌生物学的安全キャビネット内で、6ウェル培養皿の蓋を取り外し、継代される井戸から使用済み培地を吸引除去する。ピペットの先端が直接井戸内よりも他の板の任意の部分に触れないようにしてください。
2. 滅菌ガラスピペットを用いて、継代される各ウェルに加温し、コラゲナーゼIVの1 mLを加える。
3. 5分間37℃のインキュベーターにプレートを返します。

ヒトES細胞を掻き取りとプーリング

4. コラゲナーゼで細胞をインキュベートした後、顕微鏡下でコロニーを観察。酵素は、コロニーの端で微妙だが目に見える変化を引き起こす必要があります。
5. 生物学的安全キャビネット内で、静かに各ウェルから酵素を吸引し、2.0 mLをヒトES細胞培養用培地と交換してください。
6. 先端わずかに向かって培養プレートと5mLのガラスピペットで最初のウェルに2.0 mlの培地を取る。徐々にメディアのリリース中にプレートの底にピペットに対して垂直に保持する、静かにも渡っピペットチップを滑ります。
7. こするとpipettiを繰り返しますngの動き3-4倍は植民地のすべてまでもから削除されています。ピースの小さすぎるにコロニーを破壊を避けるために穏やかにピペッティング。細胞が最初に井戸から削除されているときは、よくで内容のままにしても次の細胞を掻き始める。
8. 継代される井戸のすべてが削り取られて、プール滅菌15 mLコニカルチューブの各ウェルからコロニーの部分を含有する培地を。
9. 各ウェルにヒトES細胞培養の培地1mLを加えることによって掻き井戸をすすぐ。これはリンスとコニカルチューブに移す集める。
10. ピペットで静かにチューブ内の細胞が目的のサイズにコロニーの部分を分割する。
11. 200 × gで5分間、細胞を遠心分離

hES細胞のセルをめっき

12. ヒトES細胞は遠心分離している一方で、新しい6ウェルMEFフィーダープレートを準備。細胞株、新しい継代数、および通過の日付：適切なhES細胞の情報をプレートにラベルを付けます。井戸からMEFの培地を吸引除去し、各ウェルに1.0mLのPBSを加える。ゆっくりと渦は井戸の周りにバッファとPBSの洗浄を吸引除去する。各ウェルに1.5 mLのヒトES細胞培養培地を追加し、プレートを横に置きます。
13. ヒトES細胞を遠心分離が終了したら、生物学的安全キャビネットにチューブを戻す。ゆるく充填された細胞ペレットを乱さないように注意しながら、上清を吸引除去する。
14. ウェル当たり1 mLのヒトES細胞培養の培地は、被めっきするための十分な培地でペレットに細胞を再懸濁します。 6新しい井戸に分割するときは、6 mLの培地でペレットを再懸濁します。
15. 優しくして均等にMEFフィーダープレートの各ウェル準備に細胞懸濁液1 mLを加える。
16. 37℃のインキュベーターにプレートを置き、慎重に均等によく中の細胞を配布する側にバックアップするために前方にプレート、そして側面をスライドさせます。
17. 細胞は37℃で一晩にアタッチすることができます。

5。代表的な結果：

未分化hES細胞は小さく、密集している、と通常は細胞外より大きく、より広がりで構成されています。分化は、コロニー（図1A）内にまたはコロニー（図3B）の間に発生する可能性があります。

異なるmorhopologiesは、顕微鏡下で低倍率で見ることができます。図2aに示すように良好な細胞形態は、単層で成長小さな、すし詰め状態の細胞が含まれています。細胞は分化がほとんどで、清潔で、定義されたエッジを持つ必要があります。図2Bに示すように、細胞は継代のための準備ができて、そして図2Cに示すように細胞が過密している。

図1。ヒトES培養における分化。（）コロニーの間にコロニー（B）分化の分化。

図2。ヒトES文化に見られる形態 。 （A）良好な細胞の形態（B）（C）過密状態の細胞を継代のための準備ができているヒトES細胞。

ディスカッション

無菌性は、ヒトES細胞を扱うすべての回で維持する必要があります。生物学的安全キャビネットと使用前に全ての機械を洗浄し、滅菌する。すべての試薬は使用前に0.22μmの孔径のフィルターを使用してフィルタ処理する必要があります。ヒトES細胞培養でantiboioticsの使用は必要ではなく、避けるべきです。

別々の環境は、指定されたピッキングステーションとして設定する必要があります。ステーションのための無菌エンクロージャはUV光源、層流フード、または生物学的安全キャビネットを持つ静的エンクロージャ（PCRなどのワークステーションなど）することができます。ピッキングステーション内部の解剖顕微鏡は、差別化の領域が削除されるコロニーを観察するために必要です。静的な筐体または生物学的安全キャビネットの前面のガラスパネルは、適切な通気と無菌性を損なうことなく、パネルを貫通する顕微鏡の接眼レンズを可能にするために変更する必要があります。

健康なヒトES細胞培養を維持するために、セルごとに4〜7日一般的に、最適な時点で継代する必要があります。この時点ではコロニーが彼らの最大サイズに達しているとマージし始めてされることがあります。マージされたコロニーは、培養中の分化の割合を増やすことができます。スプリット比は、一般的に植民地メッキ、膨張率、および培養条件の数に応じて、1:3および1:5の間になる。 Overplatedコロニーは（スプリット比が低すぎる）可能性が途中でマージし、彼らが最大サイズに達する前に継代する必要があります。

2週間以上古いですMEFフィーダー層上で培養物を、未分化の成長と増殖をサポートする新しいMEFをする上で継代する必要があります。

差別化が自然にヒトES細胞培養で行われるため、少量が期待されている。培養物は、適​​切な治療を受けていない場合は、頻繁にまたは過度の分化が発生する可能性があります。細胞が毎日供給する必要がある、通路との間の増殖は避けてください。常に新鮮な試薬を使用してください。メディア、MEFをと試薬のすべてが未分化hES細胞の増殖を防ぐために14日以内に使用する必要があります。このようなノックアウト血清代替、FBSおよびMEFを、などの試薬の新しいロットは、使用前にスクリーニングすべきである。継代する前に削除されていない任意の分化細胞が新しい文化に転送されることに注意してください。また、° C、可能な限り37℃で細胞を維持しようとします。細胞は細胞が長期間培養器からなる場合は加熱された顕微鏡のステージは非常に有益であることができる（顕微鏡のステージ上または生物学的安全キャビネット内など。）インキュベータの外に費やす時間を最小限に抑えます。

顕微鏡下でヒトES細胞培養を観察すると、最初のコロニーの全体的な品質と大きさを評価する低消費電力（2倍または5倍）対物レンズを用いて表示。潜在的に分化した細胞は、低消費電力で認められた場合には、より高い倍率の目標を（10X）を使用して差別化された形態を確認してください。

すぐに差別を除去した後、コロニーの縁がギザギザまたは破損して表示されることがあります。残りの未分化細胞が回復できるように新鮮な培地で一晩コロニーをインキュベートする。文化の分化の影響を受けず、これらの残りのコロニーでは、正常に増殖していきます。

可能であれば、低継代ヒトES細胞を用いた実験を始める。すべての主要な実験の前と後の細胞を核型。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
D-MEM	Invitrogen	11965-092	For MEF medium
Fetal Bovine Serum (FBS), Certified	Invitrogen	16000-044	Heat-inactivated For MEF medium
D-MEM/F-12	Invitrogen	11330-057
Knockout™ Serum Replacement	Invitrogen	10828-028	Pre-screen to ensure support of hES cells
bFGF	Stemgent	03-0002	Use at [4 ng/mL] final
Non-essential Amino Acids	Invitrogen	11140-050
L-glutamine	Invitrogen	25030-081	200 mM (100X) Use at [1X] final
PBS	Invitrogen	14190-250	Without Ca2+ or Mg2+
Collagenase IV	Invitrogen	17104-019	Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890	Type A, Porcine
Fetal Bovine Serum (FBS), Defined	Hyclone	SH300.70.01	For freezing medium
6-well plates	Nalge Nunc international	140675	For general culture
4-well plates	Nalge Nunc international	176740	For thawing
5 mL glass pipets	Fisher Scientific	13-678-27E	Individually wrapped
15 mL conical tubes	Corning	430052	Polypropylene
Pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D	9” glass