Культура и поддержание человеческих эмбриональных стволовых клеток

Резюме

Этот протокол свидетельствует о том, как сохранить здоровыми, недифференцированные человеческие эмбриональные стволовые (ЭС) клеток.

Аннотация

Человека эмбриональных стволовых (ЭСК) клетки должны контролироваться и заботу, чтобы поддерживать здоровый, недифференцированной культуры. Как минимум, культуры надо кормить каждый день, выполняя полное изменение среды для пополнения потерянные питательные вещества и поддерживать культуру свободного от нежелательных факторов дифференциации. Хотя небольшое количество дифференциации нормального и ожидаемого в культурах стволовых клеток, культура должна быть регулярной очистке с помощью ручного удаления или "собирание" дифференцированных областей. Выявление и устранение избыточного отличия от культуры ЭСК ячейки необходимы методы в поддержании здоровой популяции клеток.

протокол

1. Обслуживание: Наблюдение культур под микроскопом

1. Удаление одной пластине клеток из ЭСК 37 ° С инкубатор и довести до микроскопа.
2. Соблюдайте колоний при малой мощности, с помощью 2X или 5-кратным увеличением, чтобы оценить общее качество культуры. Обратите внимание на следующее: нормальный цвет среды, отсутствие какого-либо видимого загрязнения, общий размер колонии, качества и плотности, а любые другие соображения.
3. Соблюдайте среды изменяется цвет. В связи с изменением рН и истощение питательных веществ в среде после ночной инкубации с клетками ГЭС, среда изменится с красного оттенка, чтобы "солома" цвет. Если среда появляется фиолетовый, основной сдвиг рН произошло. Если среда представляется крайне желтый, подкисленной среде. Очень желтый среда может быть результатом чрезвычайно переполненных колоний в колодец или загрязнения. Среда должна отображаться яркое во все времена. Хотя определенный уровень клеточного мусора в среде нормально, это никогда не должно появляться облачность. Если высокий уровень клеточного мусора не наблюдается, культура не может считаться здоровым и может быть заражена.
4. Если культуры не требуют технического обслуживания или пассажи, они могут быть приняты для биологических кабинета безопасности, чтобы питаться (см. раздел 2).
5. Если культур содержат более 10% дифференциации колонии, клетки должны быть "очищены" от ручного удаления дифференцированы областях (см. раздел 3).
6. Если культур содержат большие или очень густые заросли, или слой MEF подачи составляет более 12 дней назад, клетки должны быть пассировать (см. раздел 4).

2. Кормление ЭСК клетки

1. В стерильном кабинете биологической безопасности, удалите крышку культуры блюдо и аспирации провел среды. Не позволяйте кончика пипетки, чтобы касаться любой части пластины, кроме непосредственно внутри скважины. Если есть какие-либо озабоченности загрязнения, изменения в новую, стерильную пипетку.
2. Использование стерильной пипетки стекла, добавить соответствующее количество нагревается среду клеточной культуры ЭСК в каждую лунку. Для культур в 6-луночный планшет, добавить 2,5 мл среды на лунку.
3. Вернуться пластину инкубатор остаться при температуре 37 ° С и 5% СО _2.

3. Удаление из Дифференциация культур ЭСК сотовый

1. Преобразование 9 дюймов стекло пипетки Пастера в выборе инструментов путем формовки перевернувшийся контролируемого пламени горелки алкоголя. Будьте уверены, что кончик пипетки запечатана, чтобы предотвратить заражение и закругленными, чтобы не поцарапать пластик культуры блюдо. Стерилизовать сбор инструменты перед использованием использованием УФ-источник света в кабинете биологической безопасности или собирание корпуса.
2. Удалить дифференцированных областей. Дифференциация часто происходит только часть колонии ЭСК клетки, как правило, по краям или в виде отдельных пятен в центре. Если бы только часть колонии дифференциации, только дифференцированные области должны быть удалены. Дифференциация может часто снимите пластину в "липкие" лист, и это полезно в первую очередь отдельных дифференцированных клеток от остальной колонии, рисуя линию через колонию с окончанием сбора инструмент.
3. Как только куски колонии разделены, мягко скользят выбора инструмента вдоль пластины отделить нежелательных клеток. Будьте осторожны, не соскрести слишком много слоев подачи MEF между колониями в этом процессе.
4. Когда все дифференцированные клетки удаляются из пластины (и плавающих в среде), возвращение культуры к биологическому кабинета безопасности. Аспирируйте среде, содержащей дифференцированные клетки и заменить свежей средой клеточной культуре ЭСК.

4. Пассирования ЭСК клетки

Фермент Инкубационный

1. В стерильном кабинете биологической безопасности, удалите крышку 6-и культуре блюдо и аспирации провел среды из скважин будет пассировать. Не позволяйте кончика пипетки, чтобы касаться любой части пластины, кроме непосредственно внутри скважины.
2. Использование стерильной пипетки стекло, добавляют 1 мл подогретой коллагеназы IV в каждую лунку быть пассировать.
3. Вернуться к пластине 37 ° C инкубатора в течение 5 минут.

Зачистка и Объединение ЭСК клетки

4. После инкубации клеток с коллагеназа, наблюдать колонии под микроскопом. Фермент должен вызывать тонкие, но заметные изменения в колонии края.
5. В биологическом кабинете безопасности, мягко аспирата фермента из каждой лунки и заменить 2,0 мл ЭСК культуральной среды клеток.
6. Совет культуры пластины немного к вам и занимают средний 2,0 мл в первой скважины с 5 мл стеклянные пипетки. Холдинг пипетку перпендикулярно к нижней части пластины, мягко скользить кончиком пипетки через хорошо, медленно выпуская среды.
7. Повторите выскабливание и pipettiнг движение 3-4 раза, пока все колонии были удалены из колодца. Внесите осторожно, чтобы не разбивая колоний в слишком мал штук. Когда клетки были удалены из первой скважины, оставьте содержания в хорошо и начать соскоб клетки от очередного хорошо.
8. Когда все скважины должны быть пассировали были Царапины, бассейн среде, содержащей колонии куски из каждой скважины в стерильные 15 мл коническую трубку.
9. Промыть Царапины скважин путем добавления 1 мл ГЭК среду клеточной культуры в каждую лунку. Сбор этого промыть и трансфер в конической трубе.
10. Внесите клетки мягко в трубке, чтобы разбить колонию весом до нужного размера.
11. Центрифуга клетки в течение 5 минут при 200 х г.

Покрытие Клетки ЭСК сотовый

12. Хотя ЭСК клетки находятся в центрифугу, подготовить новый 6-и MEF подачи пластины. Этикетка пластинки с соответствующей ячейке ЭСК информация: клеточная линия, новый номер прохода, и проход даты. Аспирируйте MEF среды из скважин и добавить 1,0 мл PBS в каждую лунку. Аккуратно водоворот буфер вокруг колодцев и аспирации мыть PBS. Добавить 1,5 мл клеточной культуре ЭСК среду в каждую лунку и установить пластину в сторону.
13. Когда ЭСК клетки закончил центрифугирования, довести трубку обратно в кабинет биологической безопасности. Аспирируйте супернатант, стараясь не мешать свободно упаковке осадок клеток.
14. Ресуспендируют клеток в гранулах с достаточным средством для 1 мл клеточной культуре ЭСК среды на хорошо, чтобы быть покрыты. При разделении на 6 новых скважин, ресуспендируют осадок в 6 мл среды.
15. Аккуратно и равномерно добавить 1 мл клеточной суспензии для каждого хорошо подготовились пластины подачи MEF.
16. Место пластинки в 37 ° C инкубатора и аккуратно вставьте пластину вперед-назад, и стороны в сторону, чтобы равномерно распределить клетки во всем хорошо.
17. Разрешить клетки приложить при температуре 37 ° С в течение ночи.

5. Представитель Результаты:

Недифференцированная клетках ЭСК маленькие, плотно упакованы, и обычно состоят из более крупных, более распространено клеток. Дифференциация может происходить в пределах колонии (рис. 1А) или между колониями (рис. 3В).

Различные morhopologies можно увидеть под малом увеличении под микроскопом. Хорошая морфология клетки, как показано на рис 2А, содержит мелкие, плотно упакованных клеток, которые растут в монослой. Клетки должны иметь чистую, четкими краями, с практически нет дифференциации. Клетки показано на рис 2B готовы к пассажи, и клетки показано на рисунке 2C переполнены.

Рисунок 1. Дифференциация в культуре ЭСК. () Дифференциация колонии (Б) дифференциации между колониями.

Рисунок 2. Морфологии видел в культурах ГЭС. () Хорошая морфология клетки (B) ЭСК клетки, которые готовы к пассажей (C) переполненных камерах.

Обсуждение

Стерильность должна поддерживаться во все времена при работе с клетками ГЭС. Чистота и стерилизации биологических кабинета безопасности, и все оборудование перед использованием. Все реагенты должны быть отфильтрованы с помощью 0,22 мкм поры фильтра размером до использования. Использование antiboiotics в культуре клеток ЭСК не является необходимым и его следует избегать.

Отдельная среда должна быть создана в качестве назначенного сбора станции. Стерильные корпуса для станции может быть статическим корпус (таких, как рабочая станция ПЦР) с УФ-источник света, капот ламинарного потока, или биологические кабинета безопасности. Рассекает микроскопом внутри сбор станции необходимо наблюдать колонии дифференцированных областей удаляются. Передняя панель из стекла статического корпус или кабинет биологической безопасности должны быть модифицированы, чтобы обеспечить окуляры микроскопа продлить через панель без ущерба для надлежащего потока воздуха и стерильность.

Для поддержания здоровой клетки ЭСК культур, клетки должны быть пассировать в оптимальные сроки, как правило, каждые 4-7 дней. В это время в колонии достигли своего максимального размера и может быть началом для объединения. Объединенные колонии может увеличить скорость дифференциации в культуре. Сплит отношения как правило, делятся между 1:3 и 1:5, в зависимости от количества колоний покрытие, скорость расширения, и условия культивирования. Overplated колоний (Коэффициент распределения слишком низко), скорее всего, слияние преждевременно, и их необходимо пассировать не дожив до своего максимального размера.

Культуры на слой MEF подачи, что составляет более 2 недель должны быть пассировать на новые MEFs, которые будут поддерживать недифференцированный рост и пролиферацию.

С дифференциацией естественно происходит в культуре ЭСК клетки, небольшого количества не ожидается. Частое или чрезмерной дифференциации может произойти, если культуры не получают адекватной медицинской помощи. Клетки должны питаться каждый день, разрастание между переходы следует избегать. Всегда используйте свежие реагенты. Все средства массовой информации, MEFs и реагенты должны использоваться в течение 14 дней, чтобы избежать недифференцированные ЭСК клетка роста. Новый много реагентов, таких как нокаут сыворотки Замена, ФПС и MEFs, должны быть обследованы до начала использования. Помните, что все дифференцированные клетки не удаляются до пассажи будут переведены на новые культуры. Кроме того, старайтесь держать клетки при 37 ° С при любой возможности. Свернуть времени клетки проводят вне инкубатора (например, на столике микроскопа или в кабинете биологической безопасности.) Нагревательный столик микроскопа может быть очень полезно, если клетки будут инкубатора в течение длительных периодов времени.

При наблюдении культур ЭСК клетки под микроскопом, сначала оценить общее качество и размер колоний просматривать с помощью малой мощности (2x или 5x) цели. Если потенциально дифференцированных клеток наблюдаются при малой мощности, подтвердите дифференцированной морфологии использованием большем увеличении цель (10X).

Сразу же после удаления дифференциации, краев колонии могут появиться зубчатые или поврежден. Инкубируйте колоний на ночь в свежую среду, чтобы оставшиеся недифференцированные клетки для восстановления. Без влияния дифференциации в культуре, эти оставшиеся колонии будут продолжать размножаться в обычном режиме.

Если это возможно, начать эксперименты с использованием низких прохождения ЭСК клетки. Кариотип клетки до и после всех основных экспериментов.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
D-MEM	Invitrogen	11965-092	For MEF medium
Fetal Bovine Serum (FBS), Certified	Invitrogen	16000-044	Heat-inactivated For MEF medium
D-MEM/F-12	Invitrogen	11330-057
Knockout™ Serum Replacement	Invitrogen	10828-028	Pre-screen to ensure support of hES cells
bFGF	Stemgent	03-0002	Use at [4 ng/mL] final
Non-essential Amino Acids	Invitrogen	11140-050
L-glutamine	Invitrogen	25030-081	200 mM (100X) Use at [1X] final
PBS	Invitrogen	14190-250	Without Ca2+ or Mg2+
Collagenase IV	Invitrogen	17104-019	Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890	Type A, Porcine
Fetal Bovine Serum (FBS), Defined	Hyclone	SH300.70.01	For freezing medium
6-well plates	Nalge Nunc international	140675	For general culture
4-well plates	Nalge Nunc international	176740	For thawing
5 mL glass pipets	Fisher Scientific	13-678-27E	Individually wrapped
15 mL conical tubes	Corning	430052	Polypropylene
Pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D	9” glass