のアイ成虫原基の可視化を支援するために新しいRFPレポーターショウジョウバエ</em

要約

我々は、特異的に発現される新規の赤色蛍光タンパク質（RFP）レポーターの説明ショウジョウバエ目。私たちは、細部目成虫原基の解離のための方法論をどのようにこの記者は、解剖、発展途上の目で特定の細胞型の同定を支援するために使用することができます。

要約

市販

プロトコル

1. まず場所解剖顕微鏡下Sylgard皿にPBSのドロップ。
2. 次のスパチュラを用いてバイアルやボトルからいくつかの放浪三齢幼虫を除去し、PBS中に置いてください。
3. 解剖は、幼虫の後部に向かって3分の2を把握してから前方端に濃い色の口のフックを保持するために他のペアを使用する（あなたは右利きの場合）左手のピンセットを使用開始する。
4. 今すぐ静かに互いから離れてピンセットの両方のペアを移動して離れて幼虫を引き出します。口器は、添付の目/脳、複雑で体の他の部分から離れて来る必要があります。
5. 氷上で30-45分のための4％パラホルムアルデヒド/ PBS溶液に配置することにより、この時点でディスクを固定する免疫蛍光のために目のディスクを染色する。その後、PBSTでディスクを4回洗浄し、適切な抗体として染色。
6. 直接スライドに目のディスクを分析するのが最も簡単です。スライド上でPBSのドロップを配置し、口器を持って、PBSのドロップにディスクを移動します。
7. 成虫の組織は、半透明と目のディスクが識別するのが難しいので、最初です。それは容易に蛍光機能を備えた解剖顕微鏡を使ってそれらを識別するように。アイ- RFPレポーターラインを使用して目のディスクは、明らかに球状の光のローブ（図1）オーバーレイの赤色蛍光組織として見ることができます。
8. これがディスクをより大きなコントラストを与えるように、スライドに対して斜めの角度で光を導く光ファイバ冷光源を使用している場合。アイ/触角ディスクは、後部で眼茎を経由して光のローブにして前方で触角ディスクからの茎を経由して口器に接続されています。
9. 目のディスクは、ピンセットのペアを1つ使用して口器を保持解剖し、幼虫脳から目のディスクを分離するために他のペアを使用するには。次の口器から目のディスクを切り離す。最後に平らにカバースリップを防ぐことができますこれらのようにスライドから口器を削除します。
10. あなたが解剖したときにすべての目のディスクが軽くスライドを傾けて、余分なPBSをふいて乾かす。その後Vectashieldのドロップを追加し、軽く上にカバースリップを配置。
11. ディスクには、今落射蛍光または共焦点顕微鏡（図2）のいずれかの方法でイメージを作成する準備が整いました。

代表的な結果

正しく解剖すると眼/触角ディスクは、脳などの余分な組織の明確なスライド上に平らになるように置いてください。目のディスクの背側と腹側のポールを湾曲し、そのフォールドする傾向があるが、これは共焦点顕微鏡のZシリーズを取り、投影からこれらのセクションを省略することで回避することができますされています。ディスクは、単層上皮であるが、原子核の変数の位置は、ディスクの全体像を得るためにZシリーズの投影が必要です。共焦点顕微鏡で撮影した代表的な目- RFPの眼/触角ディスクの突起を図2に示されています。我々は通常、20倍または40倍レンズを使用してディスクを介して1μm以下のセクションを取る。アイ- RFPのレポーターは、ローカライズされた核であり、したがって、図2に見られるパターンは、RFPを発現する細胞の核を表しています。

図1。目RFP三齢ショウジョウバエの幼虫から目/脳、複雑なの初期の解剖。眼/触角成虫原基は（概説）口器（MP）に接続されていると脳の視葉を（OL）オーバーレイ見ることができます。画像は、目のディスクでのRFPの発現を示す蛍光解剖顕微鏡を用いて撮影された。前方は左にあります。スケールバー：300μmである。

図2。目成虫原基の眼- RFPのレポーターの発現。三齢の眼（ED）/触角ディスク（AD）。ディスクは、ファロイジン（緑色）で染色し、その染色頂端細胞の表面と形態形成の溝（矢印）を示していた。 RFPは、光受容体1,6,7と錐体細胞で、MFの周り前駆細胞に発現している。前方は左にあります。スケールバー：25μmである。

ディスカッション

ショウジョウバエの眼成虫のディスクの解離は簡単ですが、マスターに時間がかかることがあります。重要なステップは、離れて幼虫脳から目のディスクとその解剖の同定です。目のディスクの識別は、眼- RFPのラインは、ここで説明を使用して容易になります。実行可​​能な変更は、触角ディスクまたはperipodial膜を除去する、または脳に入るPRの軸索を可視化するために接続され?...