A Novel RFP Reporter in der Visualisierung des Eye Imaginalscheibe in Aid Drosophila</em

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein neuartiges rot fluoreszierendes Protein (RFP) Reporter, der speziell in den Ausdruck Drosophila Auge. Wir Detail eine Methodik für die Präparation des Auges Imaginalscheibe und wie diese Reporter lässt sich in der Präparation und Identifizierung von spezifischen Zelltypen in den Entwicklungsländern Auge zu unterstützen.

Zusammenfassung

Die

Protokoll

1. Erster Platz ein Tropfen PBS auf eine Sylgard Teller unter einem Binokular.
2. Weiter zu entfernen mehreren wandernden dritten Larvenstadium aus einem Fläschchen oder eine Flasche mit einem Spatel und legen Sie sie in der PBS.
3. Zu Beginn der Präparation mit der linken Hand Pinzette (wenn Sie Rechtshänder sind) zu begreifen, eine Larve zwei Drittel des Weges in Richtung der hinteren und dann das andere Paar auf die dunkle Mundhaken am vorderen Ende zu halten.
4. Jetzt ziehen Sie vorsichtig die Larve auseinander, indem beide Pinzetten voneinander entfernt. Die Mundwerkzeuge kommen sollte weg vom Rest des Körpers mit dem Auge / Gehirn komplexe befestigt.
5. Für das Auge Discs für Immunfluoreszenz fix die Scheiben an diesem Punkt, indem man sie in 4% Paraformaldehyd / PBS-Lösung für 30-45 Minuten auf Eis Fleck. Dann waschen Sie die Scheiben viermal mit PBST und Fleck dann mit entsprechenden Antikörpern.
6. Am einfachsten ist es für das Auge Discs direkt auf einer Folie zu sezieren. Geben Sie einen Tropfen PBS auf einem Objektträger und bewegen Sie die Scheiben auf die Tropfen PBS, indem Sie die Mundwerkzeuge.
7. Die imaginalen Gewebe sind durchscheinend und so auf den ersten Blick die Scheiben sind schwer zu identifizieren. Um es einfacher zu identifizieren mit einem Binokular mit Fluoreszenz-Fähigkeit. Mit dem Eye-RFP-Reporter Linie das Auge Discs können eindeutig als rot fluoreszierende Gewebe Überlagerung der sphärischen optischen Loben (Abbildung 1) zu sehen.
8. Wenn Sie mit einem faseroptischen Kaltlichtquelle lenken das Licht in einem schrägen Winkel auf die Folie, so erhalten die Scheiben größeren Kontrast. Das Auge / Fühlerglied Discs sind die optischen Loben über den optischen Stiel an der hinteren und die Mundwerkzeuge über einen Stiel aus dem Fühlerglied Scheibe am vorderen befestigt.
9. Zu sezieren das Auge Scheiben halten die Mundwerkzeuge mit einer Pinzette und nutzen das andere Paar auf das Auge-Discs aus dem larvalen Gehirn zu trennen. Next separaten Auge Discs aus dem Mundwerkzeuge. Schließlich entfernen Sie die Mundwerkzeuge von der Folie, da diese das Deckglas aus flach zu verhindern.
10. Wenn Sie seziert alle Augen Scheiben vorsichtig kippen die Folie trocken und das überschüssige PBS. Dann fügen Sie einen Tropfen Vectashield und sanft Ort ein Deckglas auf.
11. Die Scheiben sind jetzt bereit, entweder durch Epifluoreszenz oder konfokalen Mikroskopie (Abbildung 2) abgebildet werden.

Repräsentative Ergebnisse

Wenn seziert richtig die Augen / Fühlerglied Scheibe liegen sollte auf der Folie frei von jeglichen fremden Gewebe wie das Gehirn flach. Die dorsalen und ventralen Pole des Auges Scheibe gewölbt sind und so eher zu falten, aber dies kann anhand eines Z-Serie auf einem konfokalen Mikroskop und das Weglassen dieser Abschnitte aus der Projektion vermieden werden. Obwohl die Scheibe einer Monoschicht Epithel der variablen Positionen der Kerne erfordern eine Z-Serie Projektion zu einem Gesamtbild der Scheibe zu bekommen. Eine Projektion eines typischen Augen-RFP Schutzbrille / Fühlerglied Disc auf einem konfokalen Mikroskop aufgenommen ist in Abbildung 2 dargestellt. Wir in der Regel nehmen Sie 1 um Schnitte durch die Disc mit einem 20x oder 40x Objektiv. Das Auge-RFP Reporter nuklearen lokalisiert und so das Muster in Abbildung 2 zu sehen ist die Kerne der Zellen, die RFP.

Abbildung 1. Initial Dissektion der Auge / Gehirn-Komplex aus einem Auge-RFP dritten Larvenstadium Drosophila Larve. Das Auge / Fühlerglied Imaginalscheibe (skizziert) zu sehen an der Mundwerkzeuge (MP) und Überlagerung der optischen Lobus (OL) des Gehirns. Das Bild wurde mit einem Fluoreszenz-Präpariermikroskop die RFP Ausdruck in den Augen Disc zeigen. Anterior ist links. Maßstab: 300 um.

Abbildung 2. Expression des Auges-RFP-Reporter in die Augen Imaginalscheibe. Eine dritte Larvenstadium Auge (ED) / Fühlerglied Disc (AD) von einem Auge-RFP Larve zeigt RFP Expression (rot) seziert. Die Scheibe wurde mit Phalloidin (grün), die Flecken apikalen Zelloberfläche und zeigt die morphogenetische Furche (Pfeilspitze) gefärbt. RFP ist in Vorläuferzellen rund um die MF zum Ausdruck, in Photorezeptoren 1,6,7 und Zapfen. Anterior ist links. Maßstab: 25 um.

Diskussion

Dissektion der Drosophila Auge Imaginalscheibe ist einfach, aber kann die Zeit zu meistern. Die entscheidenden Schritte sind die Identifikation des Auges Disc und ihre dissection vom larvalen Gehirn. Bezeichnung des Auges Disc wird dadurch erleichtert, mit dem Eye-RFP line hier beschrieben. Mögliche Änderungen werden dem Fühlerglied Disc oder der peripodial Membran zu entfernen, oder zur optischen Lappen an der PR Axone in das Gehirn zu visualisieren lassen.

Das Auge-RFP Linie wu...