好気性菌による制御植物組織の分解のための寒天ブロックの小宇宙

要約

このビデオでは、好気性菌によるリグノセルロース植物組織の劣化を研究するために制御された環境のアプローチを示しています。栄養源と水分を制御する能力は、寒天ブロックの小宇宙の主な利点ですが、アプローチは、しばしば混合成功をもたらします。我々は、再現性、低ばらつきの結果を得るために重要な落とし穴に対処する。

要約

リグノセルロース植物組織の真菌生分解を研究するための2つの主な方法は、木材防腐剤のテスト（;寒天ブロック土壌ブロック）のために開発されました。それは、土壌ブロックの小宇宙がより高い減衰率、少ない水分の問題、研究間のより低い変動、および防腐剤の毒性の高いしきい値が得られることはよく受け入れられている。土壌ブロックのテストは、このように多くの利用技術であり、米国材料試験協会（ASTM）（方法D 1413年から1407年）によって標準化されている。土壌ブロックの設計は、ローカル変数土壌のソースを使用して、減衰の組織に栄養外（外因性）の制御を制限することで、しかし、欠点がある。これらの欠点は、他の、ますます人気が研究目的にこの方法を適用する際の問題として浮上している。これらの近代的な目的は、バイオエネルギー研究のための劣化リグノセルロース、菌糸のネットワークに沿って酸化のメカニズム、およびトラッキング転要素を評価し、共同代謝有害物質のバイオレメディエーションのテストが含まれています。土壌ブロックは、これらのアプリケーションで十分な制御を貸すことはありません。洗練された寒天ブロックのアプローチが必要です。

ここでは、褐色腐朽木材腐朽菌セルプラlacrymansは、低カルシウム寒天と深いペトリ皿を使用して、寒天ブロックの小宇宙で木材を分解するために使用します。我々は、ユーティリティと予想される変動性を実証するために、時系列の崩壊に外因性石膏の役割をテストします。シングルボードリッピング（縦カット）からのブロックは、条件数秤量し、オートクレーブ、およびプラスチック製のメッシュの上に無菌的に導入されています。真菌の接種は、外因性の石膏は、インターフェースで追加して、各ブロックの面にあります。収穫は、最終的な破壊的な収穫まで無菌です。これらの小宇宙は、寒天やシャーレの壁とブロックの接触を避けるように設計されています。縮合は、プレートに注ぐとインキュベーションの間に間に最小化されます。最後に、接種材料/石膏/木の間隔は、しかし接触を可能にすることなく最小化されます。寒天ブロックの設計のこれらの小さい技術的な側面にも失敗し、研究間のばらつきの主要な源の最も一般的な原因です。ビデオの出版物はこの場合にはそのために有用であり、我々は、低ばらつき、高品質の結果を示す。

プロトコル

このプロトコルは、オーブンや空気乾燥の材料にだけでなく、として概説、木質、非木質基材に適用されます。セットアップする前に、しかし、最初のプロトコルを読みます。そこに自分の研究に適用することが提起いくつかのポイントがあり、これらのポイントは（下線）計画が必要になります。また、ある英国規格838と別の勇気（1978）によって提出された木材の保護（IRG - WP）紙の国際研究グループが続く、時折使用されている2つの公開寒天ブロックの方法があることに注意してください。私たちは、主に縮図の設計と寒天培地の制御に変更して、法838に似ているが、もう一度、両方のアプローチは、しばしば無酸素症と変動を引き起こし、木材ブロックの歴史的な水分のコントロールの問題により、回避されます。 838標準を含む寒天ブロックの設計、の議論を含むこれらの試験方法の良い評価は、ニコラス（1973）に記載されています。

1）小宇宙の準備

これらの試験のための小宇宙は、木製ブロックの上にヘッドスペースを増やし、典型的なペトリ皿が1 cm背が高い（深い）です。彼らはその濃度に加えて、絶対的な栄養素の量を制御するために、そして十分に離れて（> 3 mm）のふたから木のブロックを維持するために、寒天のささやかなそして正確な量で満たされます。石膏のテストのこのケースで使用されている寒天は、低カルシウムタイプ寒天ですが、我々はブレークスリーの培地を用いて代表的な結果を示し、テストを維持するためのATCCの推奨培地はセルプラlacrymansの分離株（Wulfen：フライドポテト）シュレーターひずみEMPA 65（ ATCC 32750）。

この設計では、離れて寒天の接触から離れて皿の蓋と壁から植物組織を保持します。リグノセルロース基質の変数濡れは、寒天ブロックのテストの変動の重要なソースです。水分含有量を増加させる湿潤剤無酸素症を作成し、抑制あるいは停止好気性の微生物分解。また、木材分解の責任茶色と白色腐朽菌の酸化メカニズムを研究する人に問題が生じます。プレートの蓋に結露は無料の水滴の形であれば問題ですし、基板を濡らす。 80％を超える（乾燥重量ベース）で水分の内容につながると好気的分解を停止するときに接触して、同様に、木材や他の組織では、寒天から急速に水を"芯"になります。組織は、糸状菌が、見つけるの接続、および基板内の湿気を制御できるように、これらの水源からの距離を保たなければならない。

1. それぞれ、20mlの寒天でペトリ皿の数を埋めるのに十分な寒天培地を加えます。我々は過去の結果を使用して電力解析によって決定される治療あたり5複製（N = 5）を、使用してください。
2. カルシウムと鉄を含まないタイプの寒天では、1.0グラムNH ₄ NO _3、1.0グラム一塩基KH ₂ PO _4、0.25グラムのMgSO ₄ xで修正された約400mlの脱イオン水を入れた500mlのメスフラスコに15gの寒天を追加7H ₂ O、および1.0gのブドウ糖。混合物に、我々は、微量栄養素​​を追加するには、ストック溶液を使用してください。我々は、H ₃ BO _4（0.057グラム/ 100ml）およびZnSO _4（0.031グラム/ 100ml）を各50μlを加える。我々は_、6カ月7 O _24（0.018グラム/ 100ml）を50μlのMnCl _2を （0.036グラム/ 100ml）をそれぞれ、CuSO _4を （0.039グラム/ 100ml）を追加し、（NH _4）。かつての栄養素を500mlのラインにメスフラスコを埋める、追加されます。
3. この場合の典型的なカルシウム添加は、0.05グラムのCaCl _{2 ×} 2H ₂ O / 500 mlである。私たちのケースでは、5 mMの最終濃度と、治療法として寒天のカルシウムを使用してください。我々は、他の小宇宙のNaCl 5mMのを追加することにより、イオン強度と塩化物の添加の増加を打ち消す。同様に、我々はこのデモのために鉄を含まない培地を使用しますが、鉄が含まれている場合には、我々は2 mlの脱イオン水でのFeSO ₄の0.112グラムを混ぜるとすぐにボルテックスした後、この新鮮な溶液50μl（在庫切れ）を追加します。あなたが栄養素の添加を制御する任意のメディアでは、それは、オートクレーブの前にpHをテストすることが賢明です。酸性又は塩基性の追加（例えばFeCl _3を ） _は凝固に影響を与えます。
4. フラスコにメディアを移し、121℃、20分間の16 psiで培地をオートクレーブ。我々はテストプレートにそれのすべてを管理する前に、寒天が固化を避けるために、500mlのボリュームを（1000 mlのフラスコあたり）超えないようにしてください。
   
   （注：最初にテスト菌がその上に成長することを確認するには、特に代替メディア、追加した基底塩と最小限の栄養寒天培地を使用しているときそれは賢明である高イオン強度と成長を阻害するかも、あなたのテストが分離殺すことができる。）
5. バイオセーフティキャビネット内で無菌的に寒天を転送するポータブルピペットエイドと10 mlの滅菌ポリスチレンのピペットを使用して、一度クールフラスコ。触れないようにメディアがクールさせるのが結露を最小限に抑えるため、ここが重要です。さらに、それらは蓋で無料の水を最小にする、注ぐしているとして高いプレートを積み重ねる。結露は、通常の培養では迷惑ですが、ここでそれは大きな問題を表しならDROpletsフォームと木材ウェット。 80％以上、水分含量（MC）（乾燥重量ベース）は、組織中に好気性菌による制限の減衰を無酸素症を作成し、変動性が増加します。次のようにMCを計算します。
   
   MC * = [（生重量X乾燥重量）/乾燥重量] × 100
   
   *（ - これは、MCを計算するために奇妙な方法に思えるかもしれませんが、標準である三菱商事は100％を超えることができます）
   1. 代替小宇宙は：植物組織（例えば、トウモロコシの茎葉の茎や葉、一緒に）事前に粉砕し、篩別する必要がテストされている場合、我々が使用する2つの皿のオプションがあります。分割されたペトリ皿は、2または4つのセクションで利用可能であり、寒天、粉末とコンパートメントから除外することができます。固化した寒天もカットすることができると栄養状況を制御する場合、粉末の余地が、ケアを残すために削除される部分は、残りの等しい寒天の量を維持するために注意する必要があります。
6. 寛大に徹底的に洗浄し、オートクレーブグリッドは無菌的に追加使用して、プレートの表面にプラスチック製のメッシュのグリッドをカット追加。私たちは、メッシュのために、製品、樋ガード（35 × 50ミリメートル、厚さ2mm）を使用して、石鹸と水で洗浄後に清浄な表面を表示すると真菌浸透性の欠如を示す走査型電子顕微鏡を使用している。我々は、ガラス繊維フィルター付きとウィッキングの問題に起因する直接開発した菌糸上に積みブロック、両方との混合成功を収めている。あなたは、減衰が得られますが、ばらつき（CV）のあなたの係数は統計的に弱い治療の比較を行う、ハイになります。我々は以前にガラス棒を使用していましたが、ブロックはjostled時に寒天と接触してブロックを残して、ロッドをオフにスライドの影響を受けやすくなっています。一つの良い代替手段は、接種を取り込むために1つの端を切断、板を合わせて完全な円をカットすることです。一般的には、グリッドは、独自のセットアップに合わせてカットし、彼らはペトリ皿に完全にフラットなレイアウトを確認してください。

2）"ブロック"基板を準備する

これらのプロトコルは、固体の木材のために開発されたが、他の植物組織のために適応可能であるされています。質量損失は、糸状菌によって分解木材の腐朽進行のための標準的な指標です。従って、我々のアプローチは、質量損失を決定するために前後の崩壊オーブン乾燥重量を使用しています。しかし、フォーカスが植物組織化学上の任意のバイオエネルギーの研究、のために、多くの組織を乾燥空気が好適であることがわかります。ここでは、あなたの寒天ブロックの文化がオーブン乾燥出発材料を使用するが、固体基板の代わりに粉体処理することも、乾燥や大気への代替情報を与えるために準備するためのプロトコルを示す。

1. このデモでは、我々は、サザンイエローパイン（SYP）を使用してください。 SYPは、それは4つのマツの種のいずれかです米国での住宅で使用されている木材の大半を代表する商業的に入手可能な木材です。無処理木材が使用され、結び目のないブロックは、木目に沿って、単一のリッピング（縦カット）（19 × 19 mm）のからカットされています。これは、木材の化学物質の変動を最小限に抑えます。この長さは19 mm ^3のブロックに切断される。我々は土壌ブロックの試験のためにこのサイズを使用して、そして見てテーブルの上に、単一のセッションで多くのブロックをカット。
2. 寒天ブロックの小宇宙で使用される、19 mm ^3のブロックはさらに、ノミとハンマーではなく、のこぎりを使用して、穀物に沿って半分に分割されています。これは、1つの大まかなブロックのエッジがプラスチックメッシュ、およびラベルへのスムーズなトップエッジで下に直面することができます。ラベルブロックを鉛筆を持つ。あなたが基板にラベルを付けることができない場合は、サンプルに追いつくためにシステムを考案してください。 （再び、我々は治療ごとにN = 5を使用）して治療を満足させるだけでなく、汚染のモニターとして、また並行してコンディショニングベースラインデータのサンプルが、としても使われる非接種対照十分なブロックをカット。
3. 100℃対流オーブンでオーブン乾燥材料、場所のサンプル℃で48時間。空気乾燥材が必要な場合は、条件が一定の湿度と温度とチャンバーや部屋内のサンプル。我々は、65％RHと20℃を使用して、そして我々は通常、材料に応じて、10〜14日間のコンディショニングに数える。
4. 初期オーブン乾燥または生体重を決定するためにサンプルを事前に量る。オーブンからのサンプルと、単にそれらを冷却し、重量を量るデシケーターにサンプルを移す。
   1. 空気乾燥の代替：空気乾燥材を使用すると、5つのサンプルを取る（N = 5;犠牲これらは小宇宙で使用されない）、それらは上記のようにオーブンで乾燥、それらは新鮮重、乾燥後に再度重量を量る。次のように2つのブロックのそれぞれの水分補正係数を計算します。
      
      MCの補正係数=乾燥重量/生体重
      
      例：2.46グラム（ドライ）/ 2.68グラム（新鮮）= 0.918は、そう、3.0 g新鮮ブロックは2.75 gのオーブン乾燥です。
      
      平均的な5つのサンプルを平均的補正係数を取得する。その後、あなたの空気乾燥のブロックのすべての重量を量る。初期オーブン乾燥重量を決定するために平均的なMCの補正係数で、各重みを掛ける。
5. オートクレーブは121でサンプルを標識した℃、より大きなサンプルで1時間、またはより長い場合は16 PSI。しっかりと濡れを最小限に抑えるために箔。
   1. AlternatiVEの滅菌：可能な場合はガンマ放射線が、滅菌するために使用することができます。我々は一緒にない強さの損失や色の変化で、ヘミセルロースの損失に対する温度の影響については以前に​​トウヒやブナの木をテストし、そして何を発見した。しかし、これは基板とあなたの好み/ニーズによって異なる可能性があります、とガンマ線照射は、実績のある代替手段です。
6. このデモでは、我々は松（SYP）試料の分解に固体石膏の役割を（1％のFeSO ₄対純粋な）テストを行っています。これらは、再びそれらの濃度に加えて、それらの可用性を制御するために、正確な表面積とボリュームを持つディスクとして作られています。これらは別々にオートクレーブし、接種工程の間に追加されます。我々は、データブロックごとに1ディスクを必要とし、我々は2つ​​の収穫を可能にするために、ペトリ皿あたり2つのブロックを追加しています。

3）接種＆ラベリング

寒天ブロックの小宇宙を接種すると、土壌ブロックのjarを接種するよりも時間がかかります。私たちにとって、私たちは3分を取るそれぞれの接種を数える。寒天を含むペトリ皿に、これは、メッシュ、木、任意の外生的な栄養源（ここで、石膏ペレット）、および真菌用のほかのポイントです。ために蓋が開いている時間の量と内側の訪問者数の汚染の可能性が高まっている。一般的にこの段階で行われており、これらが最良のテキストとビデオを結合することによってカバーされているいくつかの重要なミスもあります。ビデオを見る。

1. 無菌のバイオセーフティキャビネット内で、お空の寒天料理、あなたの真菌接種（我々は2週間の培養を使用）、メッシュ、植物基質（木）、外因性物質、抜け目のないやつ、パラフィルムストリップ、および転送ツールのソースプレートを組み立てる。我々は、70％エタノールを使用して火炎を殺菌し、我々は、ブロックとメッシュのための接種物および鉗子のための転送ツールを使用してください。パラフィルムは、エッジ上の任意のニックを避けるために、カミソリで切断する必要があります。シール時にパラフィルムでニックスは、休憩につながる、とこれはサンプルをゆすりますと再入国が必要になります。
2. 以下を追加する前に、火炎伝播ツールや鉗子（この順序で）：
   1. プラスチック製のメッシュ。
   2. 木材基板。私たちのデモでは、我々は朝早くから夜遅くまで収穫からデータをペアにすることができますので、分割されたのと同じ初期ブロックの両方から、メッシュの長さに沿った2つの木のブロックを追加します。これらのブロックは、菌接種源の点が直面している穀物の終わり（木断面積）で、並んで追加されます。
   3. 外因性物質。ここで、我々は、糸状菌による腐敗に石膏の役割をテストしています。したがって、我々は、木に到達する前にこれらの石膏ディスクに遭遇する菌をするため、メッシュの上にそれぞれ接種ポイントとブロックの間に1石膏ディスクを追加します。これは縮図あたり2ディスクを追加することを意味します。ディスクと木材の間の接触を可能にするが、それらが閉じ保持しないでください。
   4. 真菌接種。我々は、20mlの寒天で育った2週間培養物からプラグを作るために7mmの直径を持つ第4位コルクボーラーを使う。これは、接種量を制御するのに役立ちます。非接種コントロールの場合、それは無菌プレートからプラグインを追加することをお勧めします。我々は通常、寒天にこれらのプラグを追加ではなく、メッシュに。接種と外因性基質または木のどちらかの間の接触を可能にするが、再び、彼らが一緒に閉じて置いたりしないでください。ブロックごとに接種のプラグがあります。
      
      注：これは、木のブロックと蓋の壁、そしてそのあなたのプラスチック製のメッシュの間に少なくとも3 mmの距離があることが、ヘッドスペースの3 mm以上あることを確実にするために開始する前に、寒天の皿の中でこれらの内容を組み立てることが賢明です。寸法は、簡単に基板を収容する。
3. パラフィルムの料理は、アルコールの炎燃焼を維持し、それらを封印し、鉗子準備をする。滑らかな連続的な動きで水平板とラップパラフィルムを保持する。パラフィルムブレーク場合や内容押しのける、削除パラフィルムの場合、再入力して、内容を組み立て、もう一度やり直してください。
4. 直接それぞれの基板の上にブロック番号をラベリング、アルコール耐性マーカーを使用して皿の蓋にラベルを付けます。我々はまた、石膏ディスク上の円を描きます。木の崩壊としては、おそらく基板上にラベルを読み取る機能が失われます。皿の位置に追いつくためには重要です。また、劣化や金属など他の材料の種類、無数のコロニーを形成する菌のための能力を過小評価しないでください。
5. あなたがメッシュに繊細な集まりがある場合は、インキュベーターを慎重にプレートを転送する。我々は、一度だけ、ドアのジャムに対するプレートのビンをぶつかり、組み立て直す板にあった。お時間がかかるし、ルートをプロット。それは一回限り心配なので、この一度で面倒を見る。

4）インキュベート＆収穫

プレートは、真菌に合わせてインキュベートすることができますが、可能であれば、温度変化による結露を避けるために、生物学的なインキュベーターで維持する必要があります。時系列の収穫は、最後の収穫を除き、無菌的に行われています。これらの中間的な収穫は、上に成長した後に行われている場合基板には意味がある、プレートを処理すると菌糸の相互リンクの基質ので簡単です。

1. 私たちのデモでは、我々は、20℃で、暗所で培養する。週5収穫の時点で、我々は、全体の治療の多くを削除する70％エタノールでそれぞれの底部と上部をスプレーし、バイオセーフティキャビネット内物質を除去するために燃え上がる鉗子を使用してください。
2. いかなる形態またはメラニン化に焦点を当て、寒天プレートを破棄する前に写真を撮りましょう。
3. あなたのニーズに応じて扱われるようにブロックを削除します。過剰菌糸を（ニトリル手袋）離れてロールに指を使用しますが、腐った材料を紛失しないように注意してください。我々は、通常、アルミニウムのオーブンで乾燥したブロックは、過度のウィッキングを監視するコントロールの新鮮な重量と乾燥重量を用いて、質量損失を決定するためにパンを量る。これは、このアプローチは、次の最小である必要がありますが、我々はまた、明らかに水をログに記録されているすべてのダークブラウンのブロックにラベルを付け、追跡する。質量損失データは、ゲージの崩壊の進行を支援し、元素濃度が後で、グラム重量に基づいて計算される場合は、それは重要なデータです。また、割合のデータは統計のために正規化する必要があることに注意してください。次のように我々は計算してください。
   
   ％の質量損失= [（初期重量最終重量）/初期重量] × 100
   1. 代替空気乾燥：あなたが空気乾燥が必要な場合は、生物学的にさらに材料を扱うことを目標とすると、2.3節から再調整する調整制度を使用する必要があります。あなたが大量の損失を決定する必要がある場合、それは水分量の測定を必要とする、一つの解決策は大規模と小規模な部分にブロック（または粉末）を分割することです。両方の重量を量るが、ほんの小さな部分をオーブンで乾燥させます。上記のように、含水率の換算係数を計算し、小+大部分（総ブロック新鮮重量​​）の合計生体重に適用します。前の糖化や他のプロセスへの真菌に材料を前処理する場合は特に、質量損失は、質量バランスの後に決定と菌によって消費される炭水化物のためのアカウントをお届けします。
4. オートクレーブ袋の文化を破壊するが、プラスチック支持体のメッシュと将来の実験で使用するためにリサイクルすることができ、他のコンポーネントを保存します。

5）結果の解釈

リグノセルロースの組織は通常、寒天ブロックデザインに遅い減衰しますが、この時点であなたも、中程度の減衰レベルで比較的低い可変性を持つ必要があります。また、コントロール組織における中等度（20-50％）、高くは水分が必要です。

1. 真菌にさらされていない木材の含水率は、（乾燥重量基準で）このデモでは40％前後、通常は中程度です。これは、リグノセルロース、二次細胞壁内にバインドされている水の過剰にある自由水があることを意味松の繊維飽和点（FSP）（通常は約24％）、上にあります。これはまた、いくつかのウィッキングが可能性が発生することを意味します。 100％RHは、まだ木のMCは、FSPを超えないようにしてはいけません。デザインは、基板とメッシュの選択に応じて異なる結果を得ることができる。キーは、乾燥重量ベースで、85％程度以下に水分を保つことです。
2. これらの寒天ブロックの小宇宙で劣化した木材の％の質量損失は、通常、ほとんどの菌類のための16週後に約30％です。選択菌類の場合は、このケースセルプラのlacrymansで、菌類はこの時点で、> 60％の質量損失を完全に劣化を達成します。 S. lacrymansが少しリグニンを除去し、褐色腐朽菌である、この裁判のため62％質量損失は、崩壊が近いか過去完了であることを意味します。白色腐朽菌がリグニンを除去し、質量損失は、種だけでなく、基板に依存する。
3. 菌糸形態を記録するように注意してください。このデモンストレーションでは、菌糸の形態は本質的にいずれかの治療の成功または失敗を示していないが、メラニンの色が重要であった。それは、私たちはネイティブの材料を試験したとこの"さび"カラー化が観察された場所ローらのような古い研究（2000）、に石膏の不純物としての鉄の役割を関連付けることができました。カルシウムと鉄分の役割は（2000）。ローらの議論、そしてここで我々は鉄ではなく、カルシウム、およびこれらの同じさび色の菌糸で強化された減衰を参照してください。れました
4. この劣化した木材で何かの濃度を測定する場合、それは大量の損失を補正するために最適です。の場合、50％減衰し、例えば、カルシウムは、どちらもインポートされていないか、木からエクスポート、重量ベースでその濃度は、時間ゼロから最終的な収穫に倍増すると表示されます。粉末1gが、今では時間ゼロでよりも倍の木材量を表すためです。真菌は、密度の減少、行列の50％を消費していました。次のように、質量損失を補償するために、任意の濃度（例えばミリモル/ g）を正規化：
   
   正規化濃度=ミリモル/ GX [1 - （％の質量損失/ 100）]
   
   例：10ミリモル/ gの木材中のCa低下し20％、対時間ゼロでも7ミリモル/ g。
   
   質問：減衰時のCa含有量の増加をしましたか？
   
   10ミリモル/ gは、明らかに3ミリモル/ gの増加、43％の増加が、Oです密度が低いと劣化した木材から粉のNEのグラムは、より大きなボリュームを表します。正規化は、同じ木のボリュームに最初と最後のCa含有量を比較するために必要です。
   
   10 × [1 ×（20％/ 100）] = 8ミリモル/ g正規化
   
   回答：はい、Caが増加していたが、14％、ない43％。
   
   （データは、密度を掛けて、モル/ cm ^3の 、木のボリュームごとに表現することができます。

図1寒天ブロックの縮図、などのインキュベーションの前に、このデモで設定された。

図2寒天接点上にブロックを高めるためにプラスチック製のメッシュで休むパイン材のブロックを植民地セルプラのlacrymans。この菌糸体は、木材及び外因性栄養/要素のソースとの間の重要な接続を表し、寒天や固体材料としてこれらの外因性物質の源を制御することに対する土壌ブロックの設計、寒天ブロックの設計の重要な利点です。

図3％の体重減少を意味し、寒天ブロックの小宇宙の松と5と15週間のインキュベーション後セルプラlacrymansによる木材の腐朽の程度の尺度として。治療はいずれも（CA -フリー）、5mMのCaCl _2では、寒天（CaCl _2で ）に追加されなかった、> 99％純粋な石膏（CASO _4）、または1％は、石膏、鉄、修正。保護されたANOVAで比較はα= 0.05で、Tukeyのテストを使用していたことを意味します。それぞれの収穫のために、同じ文字の下のバーが大きく異なるものではありません。エラーバーは標準偏差。シリング（2010）に掲載。

すべての5つの図4。オーバーヘッドの画像は（）と同じ褐色腐敗病のテストの真菌、セルプラlacrymansだけでなく、ブロック（B）を除去し、オーブン乾燥による崩壊の15週で複製します。純粋なカルシウムの治療で黄変、および鉄 - 改正された治療における錆の外観は、Ca -フリー治療でメラニンの欠乏に注意してください。治療法は、比較のために（B）非接種されているブロックのコントロールで、図3のように表示されています。

図5。高鉄濃度の培地、ブレークスリーの麦芽寒天を使用して別の試験からのオーバーヘッドの画像。図4と比較して観測されたメラニンの損失を、注意してください。ブロックを除去し、秤量は、体重減少には治療効果を示さなかった。これは、これらのブロックの試験の外因性成分の影響のデモンストレーションとして提示されます。これらの効果は、これらの外因性の入力を制御することが難しすぎる土壌ブロックの瓶のデザイン、でテスト可能ではないでしょう。

ディスカッション

私たちの寒天ブロックセットアップ（図1）を使用してセルプラlacrymansは （図3制御褐色腐敗松のブロックで60％以上の体重減少につながる、石膏表面にと木製のブロック（図2）への直接接触で育った）。でこれは簡単に崩壊で> 50％の減衰のASTM標準目標を満たしており、変動の平均係数（C _V）16週で0.055であった。このデータは、シリング⁷に公開されています。再び?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Petri dishes	Nalge Nunc international	4014	25 x 150 mm
Agar, Type A	Sigma-Aldrich	A4550
Ammonium nitrate, NH4NO3	Millinckrodt	3436-12
Potassium phosphate, KH2PO4	JT Baker	3246-01
Magnesium sulfate 7-hydrate, MgSO4•7H2O	Sigma-Aldrich	230391
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Dextrose
Boric acid, H3BO4	Mallinckrodt Baker Inc.	2549-04
Zinc sulfate 7-hydrate, ZnSO4•7H2O	Mallinckrodt Baker Inc.	8880-12
Manganous chloride 4-hydrate, MnCl2•4H2O	JT Baker	2540-04
Copper(II) sulfate 5-hydrate, CuSO4•5H2O	Sigma-Aldrich	209198
Ammonium heptamolybdate 4-hydrate, (NH4)6Mo7O24•4H2O	Sigma-Aldrich	431346
Calcium chloride dihydrate, CaCl2•2H2O	Mallinckrodt Baker Inc.	4160-12
Sodium chloride, NaCl	Mallinckrodt Baker Inc.	7581-12
Ferrous sulfate 7-hydrate, FeSO4•7H2O	Mallinckrodt Baker Inc.	5056-12
Pipet-aid	Drummond Scientific	4-000-110	Cordless EtOH the surface
10 ml sterile polystyrene pipette	BD Biosciences	357551
Gutter Guard	Thermwell Products Co.	VX620	Pre-scrubbed with soap Hardware store
Calcium sulfate hemihydrate, CaSO4•0.5H2O	Acros Organics	385355000
#4 cork borer	Boekel Scientific	1601
Parafilm "M"	Pechiney Plastic Packaging	PM-996