ニューロスフェアのアッセイを使用して成体マウス神経幹細胞の単離と拡大

要約

このビデオプロトコルは、成体マウスの脳室周囲領域からの神経幹細胞を生成し、拡大するニューロスアッセイ法を示し、一方は再現性のニューロスフェア培養を達成できるように技術的な洞察を提供しています。

要約

成体マウスの脳から推定神経幹細胞（NSC）の単離と拡大は、最初のニューロスアッセイ（NSA）と呼ばれる化学的に定義された無血清培養系を採用した1992年にレイノルズとワイスによって記述されていた。このアッセイでは、分化した細胞型の大部分は、文化の数日以内に死亡するが、成長因子応答性の前駆細胞の小集団は、上皮成長因子（EGF）および/基本的な線維芽細胞増殖因子（bFGF）の存在下で積極的増殖を受ける。これらの細胞は、順番に神経幹細胞のプールを拡大して継代培養することができるニューロスフェアと呼ばれる未分化細胞のコロニーを形成する。また、細胞はニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、すなわち中枢神経系の三大細胞型を生成し、分化を誘導することができます。このアッセイは、in vitro試験とまた治療目的のために使用される可能性未分化のCNS ​​前駆体、の一貫性のある、再生可能エネルギー源を供給する貴重なツールが用意されています。

このビデオでは、成体マウスの脳室周囲領域からのNSCを生成し、拡大するNSA方式を示し、一方は再現性のニューロスフェア培養を達成できるように技術的な洞察を提供しています。手順はNSAで、成体マウスから脳室周囲の領域、組織の準備と文化の顕微解剖を脳の収穫が含まれています。収穫された組織は、最初に化学的にトリプシン- EDTAを用いて消化し、単一の細胞懸濁液とNSAで最終的にメッキを達成するためにNSCの培地にして機械的に解離される。文化の中で7〜10日後、得られた主なニューロスフェアは、将来の実験のために必要な細胞数に到達するためのサブカルチャーのための準備が整いました。

プロトコル

パート1：基本的な解剖に進む前に設定：

適切な量はそれぞれ、9:1の比率でNeuroCult NSC基礎培地とNeuroCult NSC増殖サプリメントを混合して調製される。 NSCの培地は文献に発表されたNSCの増殖培地の組成に基づいて実験室で行うこともできます。 ¹。ラボがメディアを作ると多くの経験を持っていない場合、我々は強く品質（NeuroCult、幹細胞のTechnolgiesの場合です）販売されている前にNSCの成長のために制御されている市販の培地を使用することをお勧めします。
1. 培地は37℃のウォーターバス中で暖めています。
冷HEPES緩衝最小必須培地（HEM）は、解剖や洗浄を目的として作成されています。また、抗生物質の補充とNSC基礎培地はまた、この目的のために使用されることがあります。 30〜40ミリリットル、脳のコレクションのための滅菌50mlチューブに分注しています。
2. いくつかの10cmのプラスチック製のペトリ皿を解剖し、解剖組織を保持するために1つ10センチメートル滅菌ガラスシャーレの中に脳を保持するために必要とされる。
3. 脳（大はさみ、小さな尖ったハサミ、大型ピンセット、小さな湾曲鉗子、および小さなへら）や組織の切開用（小鉗子、湾曲した細かい鉗子、およびメス）を削除するために必要な手術器具は、ガラスビーズ滅菌器を使用して滅菌されています250 ° Cまたは他の利用可能なオートクレーブ方法。
4. 解剖顕微鏡は、70％アルコールで拭き取るとPC2のフード内に設定されています。

パート2：収穫成体マウスの脳および顕微解剖：

1. 2月4日大人（5-8週齢）のマウスは3-4イソフルラン％またはペントバルビタールの腹腔内注射（120 mg / kg体重）でを使用して1つの機関の承認された動物プロトコルにしたがって麻酔する。
2. 頸椎脱臼は、動物が苦痛を被ることはないか確認されます。
3. 麻酔マウスは、吸収性ティッシュペーパーで、その腹部に置かれている、と頭がエリアを殺菌するために70％エタノールでリンスする。
4. 大きなハサミはちょうど子宮頸脊髄領域の上に動物の首を切るために使用されます。
5. 小さな尖ったハサミは、中央値尾-吻側カットをするために、頭蓋骨を公開するために使用されます。
6. 皮膚のカットエッジが頭部を保持するために使用され、その後、小さなハサミの各ブレードは、軌道の間に冠状切断を行うために各軌道キャビティに配置されます。
7. エントリポイントとして大後頭孔を使用して、縦のカットは矢状縫合に沿って頭蓋骨を介して行われ、2つの横方向のカットも、側壁の接合部と頭蓋底で行われます。注意は、小さな切り傷を作り、ブレードの角度を確保することによって、基礎となる脳を損傷しないように注意してくださいできるだけ浅いです。
8. それぞれの半球を覆う頭蓋骨を把握し、小さな接液スパチュラを用いて、脳を露出させる湾曲鉗子を使用して外側に剥離され、脳はHEMを含む50 mlチューブに越されている。
この手順が繰り返されます。
9. 脳は、PC2のフードに転送され、血液や髪の毛のような可能性汚染物質を除去するために冷滅菌HEMの十分な量で3回洗浄する。脳は、HEMが含まれている10cmのペトリ皿に移しています。
10. 前脳の脳室周囲領域を細かく分析するために、脳を含む料理を低倍率の実体顕微鏡の下に配置されます。脳は、自分の腹側表面に平らに配置し、微細な曲線鉗子を用いて尾側から行われています。湾曲鉗子の別のセットは、嗅球を除去するために使用されます。
11. 嗅球を除去した後、脳は腹側面を公開するために回転させる。
12. 90 °冠状カットは視交叉のレベルで行われ、脳の尾側の側面は破棄されます。
この手順が繰り返されます。
13. 高倍率では、脳の吻側の側面は、切断面が上方を向くように回転される。最初、中隔が削除され、線条体実質および脳梁を除く、細かい曲面マイクロシザーまたは湾曲した、先の尖ったピンセット、そしてその後心室の側壁を周囲の組織の薄い層が切断されたを使用して破棄されます。解剖組織は10センチメートル滅菌ガラスシャーレにプールされます。
この手順が繰り返されます。

第3部：組織の準備とメッキ細胞：

プールされた組織は、外科用メスの刃を使用して約1〜2分間刻まれている。総量が使用され、みじん切りにした組織のすべては、15 mlのチューブに移しています。 3ミリリットルトリプシン- EDTAでは8匹までから採取した組織の良い消化のために十分です。
1. チューブを37℃の水浴中で7分間インキュベートする。
2. 酵素インキュベーションの終了時に、チューブがボンネットに返され、大豆トリプシン阻害剤の等量のトリプシンの活性を止めるために追加されます。
3. 懸濁液を5分間700rpmで（110 g）で遠心分離によりペレット化してトリプシン不活化を確実にし、上下にピペッティングします。
4. 上清は廃棄され、組織片を滅菌NSC基礎培地を150μlで再懸濁する。滑らかな乳白色の単一の細胞懸濁液が得られるまで200μlにピペットをリセットする、塊は静かにピペッティング（3-7回）で解離する。直接の手順をpippettingの数はみじん切り組織（それはトリプシン活性のために表面積を増加させるように非常に小さな部分に組織をミンチに優れている）中の粒子のサイズによって異なります。長いと積極的な機械的な解離は、神経幹細胞および前駆細胞死のために少なく球の形成につながる可能性があります。
5. 破片と非解離の部分を削除するには、基礎NSC培地を10〜15ミリリットルの合計量に達するまで解離細胞懸濁液に添加される。細胞懸濁液を適切なサイズのチューブに40μmのセルストレーナーに通し、そして5分700回転（110 g）で遠心分離によってペレット化しています。
6. さらに残渣を除去するためには、NSCの培地の10〜15 mlにペレットを再懸濁し、5分間700rpmで（110 g）で細胞懸濁液を遠心分離することをお勧めします。
7. 上清は廃棄されます。その後、細胞は0.2％ヘパリンの20ng/ml EGF、10ng/ml bFGFおよび1μl/mlを補った完全なNSC媒体の適切な量に再懸濁する。
分離した組織は、1つのT25フラスコ（完全培地5mlを含む）に置かれます。細胞を37 ° C、5％COでインキュベートする ₂時間のロスフェアが形成されているすべきで7-10日のため。 one脳から採取した組織は、通常400〜600ニューロスフェアを生成することができます。

第4部：継代し、NSCの展開：

1. ニューロスフェアは、サブカルチャー（直径150から200ミクロン）のための準備ができたら、一時停止球と培地は、フラスコから除去し、適切なサイズの滅菌組織培養チューブに入れ、そして5分間700rpmで（110 g）で遠心分離され室温で。
2. 上清を捨て、球は％0.05トリプシン- EDTA 1mlに再懸濁する。また、ニューロスフェアは、文献に記載の機械的または化学的解離法を用いて継代することができます ^2,3。
3. 細胞懸濁液を37℃でインキュベート°回転して2〜3分、大豆トリプシンインヒビターの等量のための水浴中でCは、トリプシン活性を停止するために使用されます。
4. 細胞懸濁液を穏やかにトリプシンが完全に不活化されていることを保証するために上下にピペッティングしています。
5. 細胞懸濁液を5分間、700 rpmで遠心分離される。その後、上清を除去し、細胞はNSCの培地1mlに再懸濁する。
10μlをは、細胞数を数えるために、トリパンブルーの90μlと混合される。
6. 細胞は5 × 10の濃度でメッキされています ^{4細胞/ ml。 、T25用T175フラスコのためのT75、40 mlの20 mlを5ミリリットル培地を使用してください。}
7. 二次ニューロスフェアは、37℃でインキュベート5〜7日間で5％のCOとの加湿インキュベーター中、Cに形成されています ₂。

パート5：代表的な結果：

主要な成人NSCの文化では、細胞の大部分は2〜3日後に死亡しますが、反応前駆体（幹細胞および前駆細胞を含む）細胞は6〜8日後に増殖する（図1）と未分化細胞のコロニーを生成する成長因子。これらの文化では破片のかなりの量は、通常、球状の形状を獲得する可能性が存在し、ニューロスフェアのために誤解することができます。残骸の量は、顕微解剖と組織の調製技術に直接依存します。真のニューロスフェアは、明るい相（明るい）ですと（ビデオを参照）のサイズが増加するにつれて、より球形になる。 7〜10日後、球は丸めが圧縮されませんする必要があります。と150〜200μmを測定する必要がありますし、また、高倍率（図2）における外周部に硬質のマイクロスパイクが必要です。ニューロスフェアが大きくなりすぎないために許可されている場合、それらは球の中心に細胞死に起因する色で暗くなる。大規模なニューロスフェアは解離することが困難であり、最終的に基板に付着し、分化し始める。

図1。プライマリ大人NSCの文化。矢印は増殖NSCの小さなコロニーを示す。オリジナルの倍率、20倍。

図2。パッセージ。球の周辺部のマイクロスパイクに注意してください。オリジナルの倍率、20倍。

ディスカッション

ニューロスフェアのアッセイ^2は、乳癌^6、心臓⁷として、単離および多数の組織から推定される幹細胞の他のタイプの分離^4-5でなく、中枢神経系からのNSCの研究のためだけでなく、研究コミュニティで広く注目を集めていると脳、乳房および結腸腫瘍幹細胞の培養系が体細胞と体全体に腫瘍前駆細胞集団の数に適用できることを示唆して^8-9の識別のため...

資料