절연 및 Neurosphere 어세를 사용하여 성인 마우스 신경 줄기 세포의 확장

요약

이 비디오 프로토콜은 성인 마우스 periventricular 지역에서 신경 줄기 세포를 생성하고 확장 neurosphere 분석 방법을 보여줍니다, 그리고 하나는 재현성 neurosphere 문화를 달성할 수 있도록 기술적인 통찰력을 제공합니다.

초록

성인 murine 두뇌에서 putative 신경 줄기 세포 (NSCs)의 분리 및 확장 먼저 neurosphere 분석 (NSA)으로 알려진 화학적으로 정의된 혈청 무료 문화 시스템을 채용 1992 년 레이놀즈와 바이스에 의해 설명되었다. 이 분석에서 차별화된 세포 유형의 대부분이 문화의 몇 일 이내에 죽을 성장 인자 반응 전구체 세포의 작은 인구는 표피 성장 인자 (EGF) 및 / 기본 fibroblastic 성장 인자 (bFGF)의 존재에서 활약 확산을 받고있다. 이러한 세포가 차례로 신경 줄기 세포의 수영장을 확장 subcultured 수 있습니다 neurospheres 불리는 undifferentiated 세포의 콜로니를 형성하고 있습니다. 또한, 세포는 CNS의 즉, 뉴런, astrocytes, oligodendrocytes 및의 세 가지 주요 세포 유형을 생성 차별화하는 유도하실 수 있습니다. 이 분석은 체외 연구에서 또한 치료 목적으로 사용할 수 undifferentiated CNS의 엽 성의 전구 물질의 일관성 재생 소스를 제공하는 소중한 도구를 제공합니다.

이 비디오는 성인 마우스 periventricular 지역에서 NSCs를 생성하고 확장하는 NSA 방법을 보여줍니다, 그리고 하나는 재현성 neurosphere 문화를 달성할 수 있도록 기술적인 통찰력을 제공합니다. 절차는 NSA의 성인 마우스, periventricular 지역의 미세 해부, 조직 준비와 문화의 머리를 수확이 포함되어 있습니다. 수확 조직 처음 화학적으로 단일 세포 현탁액을 달성하고 마지막으로 NSA의 도금에 NSC 매체에서 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 그리고 기계 dissociated를 사용하여 소화됩니다. 문화 70~10일 후, 그 결과 기본 neurospheres 앞으로 실험에 필요한 세포의 양을 도달 subculture에 대한 준비가되어 있습니다.

프로토콜

1 부 : 기본 해부하기 전에 설정 :

적절한 볼륨이 각각 9시 1분 비율 NeuroCult NSC 기초 중간 및 NeuroCult NSC 확산 보조 식품을 혼합하여 준비가되어 있습니다. NSC 매체는 또한 문학에 발표된 NSC 성장 매체의 구성을 기반으로 실험실에서 만들 수 있습니다 ¹. 귀하의 연구실 중간 만들기로 많은 경험이 없다면, 우리는 강력하게 품질 (NeuroCult, 줄기 세포 Technolgies의 경우 어떤) 판매되고 이전에 NSCs의 성장을위한 조절되어 상업적으로 이용 가능한 매체를 사용하는 것이 좋습니다.
1. 매체는 37 ° C의 물을 욕조에 워밍업이다.
콜드 HEPES - 버퍼 최소 필수 매체 (앙)은 절개와 세탁 목적을 위해 준비가되어 있습니다. 또한, 항생제의 보완과 함께 NSC 기초 매체는 또한 이러한 목적으로 사용할 수 있습니다. 30-40 ML은 두뇌 수집 무균 50 ML 튜브에 적절합니다.
2. 여러 10cm 플라스틱 배양 접시는 절개와 해부 조직을 보유 한 10cm 살균 유리 페트리 접시 동안 두뇌를 잡아 필요합니다.
수술 도구는 유리 비드 살균기를 사용하여 살균 아르 250 ° C 또는 기타 가능한 압력솥 방법.
3. 해부 현미경은 70 % 알코올로 닦아 및 PC2 후드 내부에 설정됩니다.

2 부 : 착취 성인 마우스 두뇌와 마이크로 해부 :

1. 2-4 어른 (5-8주 세) 마우스 3-4% isoflurane이나 pentobarbital의 내부 복막 주사로를 사용하여 하나 기관 승인 동물 프로토콜에 따라 anesthetized 아르 (120 MG / kg).
2. 자궁암 전위는 동물이 고통과 고통을 경험하게하지 않도록하기 위해 수행됩니다.
3. anesthetized 마우스는 흡수성 티슈에 미치는 복부에 마련되며, 머리는 지역을 소독하기 위해 70 %의 에탄올로 씻어서 있습니다.
4. 큰 가위가 방금 경추 척수 지역 위에있는 동물을 참살하는 데 사용됩니다.
5. 작은 뾰족한 가위는 중간 꼬리 - 주동이의 절단을하고 두개골을 노출하는 데 사용됩니다.
컷 가장자리가 머리를 잡아하는 데 사용되는 다음 작은 가위의 각 블레이드는 궤도 사이의 코로나 상처를 만들기 위해 각 궤도 곳에 위치합니다.
6. 진입 점으로 구멍의 매그넘을 사용하여 세로 절단은 화살 봉합 함께 두개골을 통해 만들어 두 측면 인하도 측면 벽의 교차점과 두개골의 기지에서 만들어집니다. 주의 작은 상처를 만들고 날개의 각도가 가능한 얕은 수 있습니다함으로써 기본 뇌를 손상하지 않도록해야합니다.
7. 각 반구를 overlying 두개골은 파악하고 작은 침수 주걱을 사용하여 머리를 폭로 곡선 집게를 사용하여 밖으로 벗겨이며, 두뇌가 앙을 포함한 50 ML 튜브로 훔쳐입니다.
이 절차는 반복됩니다.
8. 두뇌는 PC2 후드에 전송하고 혈액과 머리카락과 같은 가능한 오염 물질을 제거하는 차가운 살균 앙의 충분한 볼륨을 세 번 씻어 있습니다. 두뇌는 다음 앙을 포함 10cm 페트리 접시로 전송됩니다.
9. forebrain의 periventricular 영역을 해부하다하려면, 두뇌를 포함하는 요리는 낮은 배율로 해부 현미경으로 배치됩니다. 두뇌는 그들의 복부 표면에 평평하게 위치하고 멋진 곡선 집게를 사용하여 꼬리쪽으로 개최하고 있습니다. 곡선 포셉 또 다른 세트는 후각 구근을 제거하는 데 사용됩니다.
10. 후각 구근 제거 후, ​​두뇌는 복부 측면을 폭로 회전합니다.
11. 90 ° 코로나 컷은 광학 chiasm 수준에서 만들어이며 두뇌의 꼬리 부분이 삭제됩니다.
이러한 절차를 반복합니다.
12. 더 높은 배율에서, 두뇌의 주동이의 측면 회전은 상처의 표면이 위쪽으로 얼굴을 너무합니다. 첫째, 심장이 제거되고 striatal 실질과 코퍼스의 callosum 제외 훌륭한 곡선 마이크로 가위 또는 곡선, 지적 포셉 다음 심실의 측면 벽 주변 조직의 얇은 층이 절단을 사용하여 삭제합니다. 해부 조직은 10cm 살균 유리 페트리 접시에 풀링됩니다.
이러한 절차를 반복합니다.

제 3 부 : 조직 준비와 도금 세포 :

풀링 조직은 메스 블레이드를 사용하여 1-2 분 동안 다진 것입니다. A 총 볼륨 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)이 사용되며, 다진 조직의 모든 15 ML 튜브로 전송됩니다. 3ml 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)은 8 쥐를 최대의 수확 조직의 좋은 소화를 위해 충분하다.
1. 튜브는 37 ° C의 물 목욕 7 분 incubated입니다.
2. 효소 배양의 끝에서, 튜브가 후드에 반환하고 대두 트립신 억제제의 동일한 볼륨 트립신의 활동을 중지에 추가됩니다.
3. 정지까지 pipetted 아래 트립신 불활 성화를 보장하고 5 분 700 RPM (110g)에서 원심 분리에 의해 다음 pelleted 있습니다.
4. 뜨는은 무시되고 조직 조각은 무균 NSC의 기초 매체 150 μl에 resuspended 있습니다. 200 μl에 피펫 재설정, 대단히 짧은 시간 동안 부드럽게 부드러운 밀키 단일 세포 현탁액을 얻을 때까지 (3-7 회) 아래 pipetting과로 dissociated 있습니다. pippetting 단계의 수는 직접 다진 조직 (트립신의 활동을위한 표면적을 증가로 너무 아주 작은 조각으로 조직을 말하다하는 것이 더 좋습니다)에서 입자의 크기에 따라 달라집니다. 장기와 활발한 기계적 분리는 신경 줄기 및 전구 세포의 죽음으로 인해 감소 영역의 형성으로 이어질 수 있습니다.
5. 파편을 취소 dissociated 조각을 제거하려면, 기초 NSC 매체 10 - 15ml의 총 볼륨에 도달 dissociated 세포 현탁액에 추가됩니다. 세포 현탁액은 적절한 크기의 튜브에 40μm 셀 스트레이너 통과하고, 5 분 700 RPM (110g)에서 원심 분리에 의해 다음 pelleted 있습니다.
6. 더 잔해를 제거하려면, 그것은 NSC 매체의 10-15 ML의 펠렛을 resuspend하고 5 분 700 RPM (110g)에 세포 현탁액을 원심 분리기하는 것이 좋습니다.
7. 뜨는은 삭제됩니다. 그러면 세포는 0.2 % 헤파린의 20ng/ml EGF, bFGF 10ng/ml과 1μl/ml와 보충 전체 NSC 매체의 적절한 볼륨 resuspended 있습니다.
Dissociated 조직은 한 T25 플라스크 (전체 매체의 5 ML을 포함)으로 들어가게된다. 세포 그런 다음 37 ° C, 5 % CO에 incubated 아르 ₂ 시간 neurospheres이 형성해야하는 70~10일하십시오. 일사불란에서 수확 조직은 일반적으로 400-600 neurospheres를 생성할 수 있습니다.

4 부 : Passaging 및 NSCs 확장 :

1. neurospheres가 subculture (직경 150-200 μm의)에 대한 준비가되면, 중지 분야와 매체는 flasks에서 삭제 적절한 크기 무균 조직 배양 튜브에 배치하고, 5 분 700 RPM (110g)에 centrifuged입니다 상온에서.
2. 뜨는가 삭제되고 분야는 0.05 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 ML에 resuspended 있습니다. 또는 neurospheres도 기계적 또는 화학적 분해 방법을 사용하여 passaged 수있는 것은 문학에 설명되어 ^2,3.
3. 세포 현탁액을 37 incubated 있습니다 ° 대두 트립신 억제제의 동일한 음량이 트립신의 활동을 중지하는 데 사용되는 다음 2-3 분에 대한 물 목욕으로 C.
4. 세포 현탁액은 부드럽게 트립신가 완전히 inactivated되었는지 확인하기 위해 아래 pipetted하고 있습니다.
5. 세포 현탁액은 5 분 700 rpm으로 centrifuged입니다. 그런 다음, 표면에 뜨는이 제거되고 세포는 NSC 매체 1 ML에 resuspended 있습니다.
10μl는 셀 카운트를 수행하는 trypan 블루 90μl와 혼합됩니다.
6. 세포는 5x10의 농도에 비쳐지게 만들려합니다 ⁴ 세포 / 적절한 크기의 조직 문화 플라스크에 0.2 %의 헤파린의 20ng/ml EGF, bFGF 10ng/ml과 1μl/ml와 보충 전체 NSC 매체에 ML. T175 flasks에 대한 T75 40 ML에 대한 T25, 20 ML에 대한 5ml 매체를 사용하십시오.
2 차 neurospheres은 5-7일에 형성되는 5 % CO와 humidified 인큐베이터에서 ° C ₂.

5 부 : 대표 결과 :

기본 성인 NSC 문화에서, 세포의 대부분 2-3 일하지만, 성장 인자 반응 전구체 (줄기 및 전구 세포를 포함) 세포가 세포 분열 따위에 의해 번식합니다 (그림 1) 이후 죽고 6-8일 후 undifferentiated 세포의 식민지를 생성합니다. 이러한 문화권에있는 파편의 상당 금액은 일반적으로 원형 모양을 얻기 수 존재하고, neurospheres에 대한 오해하실 수 있습니다. 파편의 금액은 마이크로 해부 및 조직 준비 기법에 직접 종속되어 있습니다. 진정한 neurospheres 밝은 단계 (발광)하고 (비디오 참조) 크기의 증가와 같은 구형이된다. 70-10일 후, 구체는 둥글게하지만 압축되지되어야하며 150 사이 200 μm의 측정해야하며 높은 배율 (그림 2)에서 주변에 까다로운 마이크로 스파이크가 있어야합니다. neurospheres 너무 커질 수있다면, 그들은 구체의 중심에 의한 세포 죽음에 색깔이 어두운된다. 대형 neurospheres는 떼어 놓다 어려울 수 있으며 결국에는 기판에 연결하고 차별 시작합니다.

그림 1. 기본 성인 NSC 문화. 화살표는 proliferative NSCs 작은 식민지를 보여줍니다. 원본 확대, 20x.

그림 2. 패시지 한 성인 neurosphere. 분야의 주변에있는 마이크로 스파이크를 적​​어 둡니다. 원본 확대, 20x.

토론

neurosphere 분석 ² CNS ^4-5에서 고립과 NSCs의 연구뿐 아니라 유방 ^6과 마음 ⁷ 등 많은 조직에서 putative 줄기 세포의 다른 종류의 격리를 위해뿐만 아니라 연구 커뮤니티의 광범위한 관심을 얻게하고있다 뇌, 유방 및 결장 종양의 줄기 세포이 문화 시스템은 체세포와 체내 종양 전구체 세포 집단의 숫자에 적용할 수있는 제안 ^8-9의 식별. 이 방법의 장점 중 일부는 ...

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