野鳥の鳥インフルエンザウイルスの迅速な診断：フィールドのポータブルRRT - PCR及び凍結乾燥試薬の使用

要約

本研究では、ポータブルRRT - PCRシステムを使用して、野鳥における鳥インフルエンザの診断について説明します。方法は、アウトブレイクのシナリオの典型的な非実験室の設定で野鳥をスクリーニングするために凍結乾燥試薬、を活用しています。分子ツールの使用は、迅速な診断のための正確かつ敏感な選択肢を提供します。

要約

野生の鳥は渡り鳥フライウェイに沿って監視を促す、H5N1亜型の高病原性鳥インフルエンザ（HPAI）の拡散に関与している。鳥インフルエンザウイルス（AIV）のための野鳥のサンプリングは、多くの場合、遠隔地で行われているが、結果はしばしば分子検査のために装備研究所にサンプルを輸送する必要が遅延されています。リアルタイムの逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RRT - PCR）は、AIVの診断のための最も正確で高感度のいずれかの方法を提供する分子技術です。 RRT - PCRに必要な以前に厳格な実験室のプロトコルは現在、フィールドに適応されている。ウェット試薬のレベルでの感度を持つコールドチェーンを必要としないフリーズドライ（凍結乾燥）試薬の開発は、実用的な目標に、サイト上のリモートテストをもたらしています。

ここでは、凍結乾燥試薬を採用したRRT - PCRユニット（高耐久性高度病原体識別装置またはRAPID、アイダホテクノロジー、ソルトレイクシティ、ユタ州）（インフルエンザターゲット1タックマンを使用して野鳥のAIVの迅速な診断のための方法を提示する。Asay氏を - ASY - 0109、アイダホテクノロジーズ）。不適切な保管やウェット試薬の取り扱いに関連するエラーを排除し、プライマー、プローブ、酵素、緩衝液および内部陽性対照：試薬は、単一のチューブ内で適切な濃度でテストするために必要なすべてのコンポーネントが含まれています。ポータブルユニットは、2〜3時間でマトリックスの遺伝子と収量の結果を標的とすることでインフルエンザのための画面を実行します。遺伝的サブタイピングは、H5やH7プライマーでも可能です、そのターゲットの血球凝集素遺伝子を設定します。

システムは、渡り鳥シギチドリ類の種をここに示すように、野生の鳥から採取した、ヒメハマシギ（Calidrusマウリ ） は 、カリフォルニア北部でキャプチャされた総排泄腔と咽頭サンプルの使用に適しています。動物の扱いは、米国地質調査所西部生態学研究センターと実験室をバンディング米国地質調査所の鳥の許可の動物実験委員会によって承認されたプロトコールに従った。この技法の主な利点は、遠隔地での発生を含んでいる可能性を高める、野鳥の診断を促進することです。オンサイト診断も、野生の個体群に感染した個体を識別し、研究するために有用であることが分かるでしょう。ホストの生物学（感染症に対する免疫学的および生理学的応答）と空間的な生態学（感染した鳥の渡り​​鳥パフォーマンス）に関する情報を収集する機会は、野生の鳥が長距離のAIVのためのベクターとして動作できる範囲についての洞察を提供します。

プロトコル

1。ミストのネットを使用して野生の鳥の捕獲

1. シギチドリ類の捕獲の場合は、このような湿地、海岸線、または干潟のようなアクティブな採餌場所でミストネットを設定する。
2. スライドトランメルのラインは、ポールの周りに霧のネットの一端のループと泥に垂直にポールを挿入します。
3. ネットを伸ばし、ミストのネットの他の端にトランメルのループを介し番目の極を挿入し、垂直にトランメルのラインが教えていることを確認しながら、泥に棒を挿入。
4. 鳥がキャプチャされると、ネットから鳥を抽出し、バンディングステーションに戻ります。

2。総排泄腔スワブのサンプリング

1. 撮影直後の総排泄腔スワブを収集する
2. 排出腔を見つけて、周囲の羽毛をプッシュバックする指先を使って
3. 滅菌ダクロンまたはポリエステル先端綿棒をラップ、第一の端部をステム、およびスワブでより容易にするために滅菌ウイルス輸送媒体と先端を湿らせ。湿潤した後、綿棒の頭全体を穏やかに排出腔に挿入されます。ゆっくり綿棒をくるくると総排泄腔から綿棒を削除することにより総排泄腔のスワブは、内側の円周。
4. ウイルス輸送のメディアのサンプルバイアルに直接綿棒の先端を挿入、綿棒がメディアにある間、親指と人差し指の間に綿棒シャフトを回転させる。アシスタントは、バイアルの底から戻って綿棒の先端を引いて手順〜1 cmを完了し、綿棒の先端がバイアルに残っているとシャフトが干渉しないようにハサミで綿棒の軸を待ち構えているキャップ閉鎖。しっかりとキャップのバイアル。綿棒の軸を切断の間にアルコールではさみを消毒する。
5. ドライアイスやアイスパックのいずれかを含む冷凍ボックスにバイアルを置きます。

3。口腔咽頭スワブのサンプリング

1. 後鼻孔スリットが見えるように優しく鳥のくちばしを開いて
2. パッケージから綿棒をラップ、第一の端部をステム、およびスワブでより容易にするためにウイルスの輸送媒体と先端を湿ら
3. 他の表面に先端に触れることなく、口と綿棒口の屋根の上に後鼻孔の開口部に挿入し、咽頭や喉の領域に向かって戻って続ける
4. 直接ウイルス輸送のメディアバイアルに綿棒の先端を置きます。綿棒がメディアにある間に親指と人差し指の間に綿棒シャフトを回転させる。上記のように、アシスタントがバイアルの底から綿棒の背面の先端部約1 cmをプルし、綿棒の先端がバイアルに残っているとシャフトがキャップに干渉しないようにハサミで綿棒の軸を待ち構えている閉鎖。しっかりとキャップのバイアル。綿棒の軸を切断の間にアルコールではさみを消毒する。
5. ドライアイスやアイスパックを含む冷凍ボックスにバイアルを置きます。

4。鳥の扱いとリリース

1. タイムリーに（<20分）でのキャプチャとリリースのサイトに鳥を返します。ハンドラは、動物福祉の原則を認識し、（すなわち擦り傷、ミオパシーや低刺激や温熱療法を取り込む）、サンプリング中に苦しんでいる鳥の兆候を警戒しなければならない。基本的な救急箱は、機器のリストに含まれる必要があります。

5。試験設備

1. サンプルは、PCR装置と接続されたコンピュータを実行するための電源（電圧安定化電源の発電機）で、このような研究のトレーラーやテントなどの密閉空間でテストすることができます。

6。 RNA抽出

1. RNAの抽出は、スパックマンら以下のメーカーの指示に若干変更してRNeasyミニキットで行われた^1。
2. 渦3月5日のための綿棒培地2 mlのマイクロチューブに350μlを移す。注：PCR陽性検体は、再スクリーニングする必要があるかH5のテストを実行する必要がある場合には氷の上で、残りのサンプルを保管してください。
3. 350 RLTバッファーの液（β- MEを含む）、5秒間ボルテックスを追加します。
4. RNAグレードの70％エタノール350μlを添加する。
5. 5分間5000 × gで遠心する。
6. 2 mlのコレクションチューブに配置されたスピンカラムに上清600μlを添加する。試験管ラック内の残りのサンプルを保持する。
7. 10,000 xgで20秒間遠心とフロースルー捨てます。
8. すべてのサンプルをスピンカラムを通過されるまで繰り返します17-18繰り返します。
9. きれいな2 mlのコレクションチューブにスピンカラムをセット。
10. スピンカラムにRW1バッファー700μlを加え、10,000 × gで25秒遠心しフロースルーを捨てる。
11. 10,000 × gで25秒用スピンカラムや遠心に500μlのRPEバッファーを追加します。フロースルーを捨てる。
12. RPEバッファーで2回洗浄の合計のためのステップ22を繰り返します。
13. 14,000 × gで追加の2分間のスピンカラムを遠心コレクションチューブを捨てる。
14. 1.5 mlのマイクロ遠心チューブにスピンカラムをセットし、ヌクレアーゼフリー水50μlのを追加します。 60秒室温でインキュベート
15. 万xgfで60秒間回転させて溶出RNAまたは60秒場所は、氷上でサンプルを精製する。

7。ネガティブコントロールの準備

1. 凍結乾燥試薬はTaqManプローブインフルエンザターゲット1（Asay氏 - ASY - 0109）のためのアイダホテクノロジー凍結乾燥試薬の検出キットからの指示に従ってPCRアッセイで使用するために調製した。
2. ペレットが下部になってしまうため3秒のための陰性コントロール試薬バイアル（赤）を遠心してください。
3. キャップを外し、視覚的にペレットが底にあることを確認してください。
4. 2 Xの再構成バッファと20μlの試薬グレード水20μlを添加する。
5. 最大速度で5秒要約と渦。
6. バイアルの底に液体をもたらすために3秒間遠心します。
7. 視覚的にペレットをチェックする手順31から32を繰り返していない場合、再水和している。
8. ピペットライトサイキャピラリーチューブに水和液の19μlを、重複を取得する2番目のキャピラリーにピペットのステップを繰り返します。

8。準備テストサンプル

1. ペレットが下部になってしまうため3秒間不明試薬のバイアル（青）を遠心してください。
2. キャップを外し、視覚的にペレットが底にあることを確認してください。
3. 精製したRNA 40μlを添加する。
4. 最大速度で5秒要約と渦。
5. バイアルの底に液体をもたらすために3秒間遠心します。
6. 視覚的にペレットをチェックする手順38から39を繰り返していない場合、再水和している。
7. ピペットライトサイキャピラリーチューブに水和液の19μlを、重複を取得する2番目のキャピラリーにピペットのステップを繰り返します。

9。ポジティブコントロールの準備

1. ペレットが下部になってしまうため3秒のための陽性対照試薬バイアル（緑）を遠心してください。
2. キャップを外し、視覚的にペレットが底にあることを確認してください。
3. 2 Xの再構成バッファと20μlの試薬グレード水20μlを添加する。
4. 最大速度で5秒要約と渦。
5. バイアルの底に液体をもたらすために3秒間遠心します。
6. 視覚的にペレットをチェックする手順45から46を繰り返していない場合、再水和している。
7. ピペットライトサイキャピラリーチューブに水和液の19μlを、重複を取得する2番目のキャピラリーにピペットのステップを繰り返します。

10。キャピラリーチューブを遠心分離し

1. 一度にすべてのバッチのためのキャピラリーチューブのは、キャピラリーのアダプタを装備したミニ遠心機にそれらをロードする準備されている。
2. 1秒のパルスボタンを押すことで最小の設定で遠心これはテストの準備のために底に液体が転送されます。

11。 RAPIDを操作する

1. 新しいファイルを作成します。ラベルポジティブコントロール、ネガティブコントロール、そして試料（それらのID番号によって）。
2. プログラム1：RNAサンプルの調製ホールド
   1. サイクル数= 1
   2. 分析モード=なし
   3. ターゲットの温度= 40
   4. インキュベーション時間= 30分
   5. 温度遷移レート= 20 ° C /秒（デフォルト）
   6. 二次温度ターゲット= 0（デフォルト）
   7. ステップサイズ= 0（デフォルト）
   8. ステップ遅延= 0（デフォルト）
   9. アクイジションモード=なし（デフォルト）
3. プログラム2：RNA変性
   1. サイクル数= 1
   2. 分析モード=なし
   3. ターゲットの温度= 94
   4. インキュベーション時間= 120秒
   5. 温度遷移レート= 20 ° C /秒（デフォルト）
   6. 二次温度ターゲット= 0（デフォルト）
   7. ステップサイズ= 0（デフォルト）
   8. ステップ遅延= 0（デフォルト）
   9. アクイジションモード=なし（デフォルト）
4. プログラム3：RNAの増幅
   1. サイクル数= 45
   2. 分析モード=自動解析
   3. ターゲット温度、セグメント1 = 94、セグメント2 = 60
   4. インキュベーション時間、セグメント1 = 0秒、セグメント2 = 20秒
   5. 1＆2をワンセグ温度遷移レート、= 20 ° C /秒（デフォルト）
   6. 二次温度ターゲット、ワンセグ1＆2 = 0（デフォルト）
   7. ステップサイズ、ワンセグ1＆2 = 0（デフォルト）
   8. ステップ遅延、ワンセグ1＆2 = 0（デフォルト）
   9. アクイジションモード、=なしセグメント1、セグメント2 =シングル
5. 蛍光パラメータ
   1. 表示モード：蛍光チャネル2（CH2 / 1）
      ゲイン：
      1. チャネル1（F1）= 1
      2. チャンネル2（F2）= 8
      3. CH 3（F3）= 1
   2. 各サンプルのリアルタイム蛍光データを表示するには、関心のサンプルを選択し、画面下部の"グラフの表示"ボタンをクリックします。
6. それぞれのキャピラリーの場合、結果は次のとおりです。
   • ＃ - カルーセルのカルーセル位置を識別します。
   • サンプル名は、 - サンプルの名前を提供します。
   • 制御 - 各サンプルのサンプルの種類が識別
   • スコア - サンプルの蛍光と、試料中のバックグラウンド蛍光のレベルとの関係を用いて計算
   • 結果は - サンプルの全体的な結果が表示されます。

12。代表的な結果：

考えられる結果は次のとおりです。
現在：テスト/未知のサンプルの赤"現在"の呼び出しは、ターゲットがそのサンプルに識別し、コントロールが正常に行われたされたことを示します。
検出されない：テスト/未知のサンプルのための緑の"検出されない"の呼び出しは、ターゲットがそのサンプルに識別し、テストのコントロールが成功したされていないことを示します。
繰り返してください："してください繰り返しますが"正または負の制御が失敗したことを示します。

RAPID 7200で成功した解析の例を図4に示されています。ポジティブコントロールは増幅され、約25サイクル（x軸）で検出可能な蛍光（y軸）を生成しています。サイクル閾値（CT）> 35ほとんどのAIVのリファレンス研究施設のための合意されたカットオフです。したがって、このメソッドのポジティブコントロールには、AIVの検出のためのサイクルの受け入れ数（0から35）内の蛍光シグナルを作り出した。対照的に、ネガティブコントロールでも45サイクル後の蛍光シグナルを生成しません。同様に、西部のシギから収集twelveのサンプルは、鳥がAIVのために陰性であることを示す蛍光シグナルを生成しませんでした。従来の実験室内のすべての陽性試料のフォローアップ試験は、偽陽性が誤って生成されないことを保証するために推奨されています。

ミストのネットを用いて図1。シギチドリ類の捕獲。

図2。少なくともシギから総排泄腔と咽頭サンプルのコレクション。

図3。RNA増幅のためにRAPID 7200をプログラミング。

図4。RAPID 7200ポータブルRRT - PCRは、どのようにポジティブとネガティブコントロールを示すことによって生成されたFluorogramは成功したアッセイに表示されます。 フルサイズの画像を表示するにはここをクリック

ディスカッション

ここで紹介する迅速な診断の方法は、AIVのサーベイランスのための野生の鳥のサンプルの時間効率と正確なテストを容易にします。液体窒素の荷主またはドライアイスが使用できない場合は、コールドチェーンの維持が不可能な場合がありますどこポータブルRRT - PCRのはるかに少ない厳しい試料のストレージ要件は、リモートの状況に適しています。さらに、我々は実験室ベースの分子解析?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント（省略可能）
RNeasyミニスピンカラム	キアゲン	74106	RNeasyミニキットに含まれる
コレクションチューブ（1.5＆2 mL）中	キアゲン	74106	RNeasyミニキットに含まれる
バッファRLT	キアゲン	74106	RNeasyミニキットに含まれる
バッファRW1	キアゲン	74106	RNeasyミニキットに含まれる
バッファーRPE	キアゲン	74106	RNeasyミニキットに含まれる
RNaseフリー水	キアゲン	74106	RNeasyミニキットに含まれる
14.3 Mβ-メルカプトエタノール溶液	フィッシャーサイエンティフィック	BP176100
100％エタノール	フィッシャーサイエンティフィック	NC9602322
渦魔神2、120V	サイエンティフィックインダストリーズ	SI - 0236
タックマンインフルエンザターゲット1（加水分解プローブ）	アイダホテクノロジー	Asay氏 - ASY - 0109
ライトサイ20ミリリットルキャピラリーチューブ	ロシュダイアグノスティックス	04929292001
2 mlのチューブ用ローテーター付きマイクロ遠心	アイダホテクノロジー		RAPIDキットに含まれています
耐久性の高い高度な病原体識別装置（RAPID）7200	アイダホテクノロジー		RAPIDキットに含まれています
Windows XP Professionalを搭載したPentiumベースのラップトップ	アイダホテクノロジー		RAPIDキットに含まれています
ライトサイデータ解析ソフトウェア	アイダホテクノロジー		RAPIDキットに含まれています