Yabani Kuşlar Kuş Gribi Virüsü Hızlı Teşhis: Alanında Taşınabilir RRT-PCR ve Dondurulmuş kuru Reaktifler Kullanımı

Özet

Bu çalışmada, taşınabilir bir RRT-PCR sistemi kullanarak vahşi kuşlarda kuş gribi teşhisi açıklamaktadır. Bu yöntem, bir salgın senaryosunun tipik olmayan bir laboratuar ortamında yabani kuşlar, ekrana dondurularak kurutulmuş reaktifler yararlanır. Moleküler araçlarını kullanın, hızlı tanı için doğru ve hassas alternatifler sunuyor.

Özet

Yabani kuşlar, göç flyways boyunca gözetim isteyen, yüksek derecede patojen H5N1 alt tipi Avian influenza (HPAI) yayılmasını suçlanmıştır. Örnekleme kuş gribi virüsü yabani kuşlar (AIV) genellikle uzak bölgelerde yapılan, ancak sonuçlar genellikle moleküler testler için donanımlı bir laboratuvar numune taşıma ihtiyacı nedeniyle ertelendi. Gerçek zamanlı ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (RRT-PCR), moleküler tekniği AIV tanısı için en doğru ve hassas yöntemlerden birini sunmaktadır. RRT-PCR için gerekli olan, daha önce sıkı laboratuvar protokolleri alan için adapte ediliyor. Islak reaktiflerin düzeyde hassasiyet ile, soğuk zincir gerekmez dondurularak kurutulmuş (liyofilize) reaktifler Geliştirme yerinde pratik bir hedefi uzaktan test getirdi.

Burada liyofilize reaktifler istihdam RRT-PCR ünitesi (İleri Patojen Kimlik Sağlamlaştırılmış Cihaz veya RAPID, Idaho Teknolojileri, Salt Lake City, UT) (İnfluenza A Hedef 1 Taqman kullanarak yabani kuşlar AIV hızlı tanı için bir yöntem mevcut; ASAY -ASY-0109, Idaho Teknolojileri). Reaktifler tek bir tüp içinde uygun konsantrasyonlarda test etmek için tüm gerekli bileşenleri içerir: astarlar, sondalar, enzimler, tamponlar ve iç pozitif kontrol, yanlış depolama veya ıslak reaktiflerin kullanım ile ilgili hataları ortadan kaldırır. Taşınabilir ünite İnfluenza A matrisi gen ve 2-3 saat verim sonuçları hedefleyen bir ekran yapar. Genetik alt tipleme H5 ve H7 astar ile de bu hedef hemaglutinin gen belirler.

Sistemi göçmen shorebird türleri burada gösterildiği gibi, yabani kuşlar toplanan kloakal ve orofaringeal örnekler, Kuzey Kaliforniya yakalanan batı Sandpiper (Calidrus mauri). Için uygundur. Hayvan kullanımı, US Geological Survey Batı Ekolojik Araştırmalar Merkezi ve US Geological Survey Kuş Laboratuvar Bantlama izin Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan protokol izledi. Bu tekniğin en önemli avantajı, uzak bir yerde bir salgın içeren şansı artan, yabani kuşların tanıyı hızlandırmak için. On-site Tanı yabani popülasyonları enfekte bireylerin belirlenmesi ve eğitimi için de faydalı olacaktır. Ev sahibi biyoloji (enfeksiyon immünolojik ve fizyolojik tepki) ve mekansal ekoloji (enfekte kuşların göç performans) hakkında bilgi toplamak için fırsat yabani kuşların uzun mesafelerde AIV için vektörler olarak hareket edebilir ölçüde içgörüler sağlayacaktır.

Protokol

1. Sis ağları ile yabani kuş yakalama

1. Shorebird yakalamak için, bir bataklık, kıyı şeridi veya çamur düz olarak aktif bir toplayıcı yerinde sis ağları kurmak.
2. Slayt fanyalı hattı kutup çevresindeki sis net bir ucunu döngüler ve dikey kutup çamurun içine yerleştirin.
3. Net dışarı Stretch, sis net diğer ucunda fanyalı döngüler ile ikinci kutup eklemek ve dikey fanyalı hatları öğretilir emin, çamurun içine kutup eklemek.
4. Bir kuş yakalanır sonra, net kuş özü ve bantlama istasyonuna dönün.

2. Kloakal çubukla örnekleme

1. Yakalanmasından sonra hemen kloakal bezlerden toplayın
2. Lağım bulun ve parmaklarınızın çevreleyen tüyler geri itmek için kullanmak
3. Steril dakron veya Polyester uçlu çubukla Unwrap, ilk sonunda kök ve ucu sürüntü büyük kolaylığı için steril viral taşıma medya ile nemlendirin. Nemlendirme sonra, tüm kafa çubukla hafifçe lağım eklenir. Swab yavaş yavaş çubukla twirling ve lağım çubukla kaldırmak lağım iç çevresi.
4. Doğrudan viral taşıma medya örnek şişesine Swabı uç takma; çubukla medya iken başparmak ve işaret parmağı arasında çubukla mili döndürmek. Çubukla ucu flakon kalır ve şaft ile karışmaz, bir asistan, bir makas çubukla arka ucu flakonun ~ 1 cm alttan çekerek prosedürü tamamlamak ve çubukla şaft kesme sağlayın kap kapatılması. Kapağını sıkıca kapatın flakon. Makas kesim çubukla milleri arasında alkol ile dezenfekte edin.
5. Şişeleri ya kuru buz veya buz paketleri içeren bir dondurucu kutusuna yerleştirin.

3. Orofaringeal sürüntü örnekleme

1. Koanal yarık görünür şekilde kuş gagası hafifçe açın
2. Unwrap paketinden Temiz bir bez, ilk sonunda kök ve ucu sürüntü büyük kolaylığı için viral taşıma medya ile nemlendirin
3. Ucu başka herhangi bir yüzeylere dokunmadan, ağız ve çubukla ağız çatısında Koanal açılış takın ve orofaringeal veya boğaz bölgeye yönelik geri devam
4. Swab ucu doğrudan viral taşıma medya şişenin içine yerleştirin. Çubukla medya ise, başparmak ve işaret parmağı arasında çubukla mili döndürün. Yukarıdaki gibi, bir asistan flakonun ~ 1 cm alttan çubukla arka ucu çekin ve bir makas ile çubukla çubukla ucu flakon kalır ve mili kapağı ile karışmaz mili kesmek zorunda kapatılması. Kapağını sıkıca kapatın flakon. Makas kesim çubukla milleri arasında alkol ile dezenfekte edin.
5. Kuru buz veya buz paketleri içeren bir dondurucu kutusunda şişeleri yerleştirin.

4. Kuş taşıma ve serbest bırakma

1. (<20mins) zamanında yakalama ve serbest siteye kuş dönün. Eylemciler, hayvan refahı ilkelerine dikkat ve örnekleme sırasında acı kuş işaretleri (örn. sıyrıklar, miyopati ve hipo-veya hipertermi yakalama) için uyarı olmalıdır. Temel ilk yardım kiti, ekipman listesi dahil edilmelidir.

5. Test hizmetleri

1. Örnekler PCR ünitesi ve ekli bilgisayarı çalıştırmak için bir güç kaynağı (voltaj regüle jeneratör), böyle bir araştırma römork veya çadır gibi her türlü kapalı alanda test edilebilir.

6. RNA ekstraksiyon

1. RNA ekstraksiyon Spackman ark üreticinin talimatlarına küçük değişiklikler ile RNeasy Mini kiti ile yapıldı. ¹
2. Vorteks çubukla 3-5 s için orta ve 2 ml mikrosantrifüj tüp 350 ul transfer. Not: PCR-pozitif örnekler rescreened veya H5 testi çalıştırmak gerekir halinde geri kalan örnek buz üzerinde tutun.
3. 350 RLT tampon ul (β-me ile birlikte) ve 5 s. girdap ekle
4. RNA notu% 70 etanol 350 ul ekleyin.
5. 5 dakika boyunca 5.000 xg'de santrifüjleyin.
6. 2 ml toplama tüpüne yerleştirilen bir spin kolon süpernatant 600 ul ekleyin. Test tüpü rafta kalan örnek saklayın.
7. 20 s için flow-through 10.000 xg ve atın santrifüjleyin.
8. Tüm örnek spin kolon üzerinden geçti kadar bu işlemi tekrarlayın 17-18 adımları.
9. Spin kolon temiz bir 2 ml toplama tüpü yerleştirin.
10. RW1 tampon 700 ul spin kolon ekleyin ve 25 sn santrifüj 10.000 x g. Flow-through atın.
11. 10.000 x g. 25 sn spin kolon ve santrifüj 500 ul RPE tampon ekle Flow-through atın.
12. RPE tamponu ile iki yıkar toplam 22 adımı tekrarlayın.
13. 14.000 x g. ek bir 2 dakika spin kolon Santrifüj Toplama tüpüne atın.
14. Temiz bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp spin kolon yerleştirin ve nükleaz ücretsiz su 50μl eklemek. 60 saniye süreyle oda sıcaklığında inkübe
15. 10.000 XGF az 60 sn iplik Zehir RNAveya 60 sn Buz üzerine yerleştirin arıtılmış örnek.

7. Negatif kontrol hazırlanması

1. Liyofilize reaktifler TaqMan Problar İnfluenza A Hedef 1 (ASAY-ASY 0109) Idaho Teknolojileri Freeze-Kuru Reaktif Tanıma Kiti talimatlara göre PCR testi kullanımı için hazırlanmıştır.
2. Pelet altındaki sağlamak için negatif kontrol reaktif şişesine (kırmızı) 3 s santrifüjleyin.
3. Kapağını çıkarın, görsel olarak, emin pelet altındaki olun.
4. 2 X Sulandırma Tamponu ve 20 ul Reaktif Sınıf Su 20 ul ekleyin.
5. Recap ve 5 s maksimum hızda karıştırın.
6. Flakon alt sıvı getirmek için 3 sn santrifüjleyin.
7. Görme 31-32 adımları tekrarlayın pelet, rehidrate kontrol edin.
8. Pipet 19 ul LightCycler kapiller tüpe sulu karışımı, bir kopyasını elde etmek için ikinci bir kılcal damar içine pipet adımı tekrarlayın.

8. Test numunelerinin hazırlanması

1. Pelet altındaki sağlamak için 3 sn bilinmeyen reaktif şişesine (mavi) santrifüjleyin.
2. Kapağını çıkarın, görsel olarak, emin pelet altındaki olun.
3. Saf RNA 40 ul ekleyin.
4. Recap ve 5 s maksimum hızda karıştırın.
5. Flakon alt sıvı getirmek için 3 sn santrifüjleyin.
6. Görme 38-39 adımları tekrarlayın pelet, rehidrate kontrol edin.
7. Pipet 19 ul LightCycler kapiller tüpe sulu karışımı, bir kopyasını elde etmek için ikinci bir kılcal damar içine pipet adımı tekrarlayın.

9 - Pozitif kontrol hazırlanması

1. Pelet altta olmasını sağlamak için pozitif kontrol reaktif flakon (yeşil) 3 s santrifüjleyin.
2. Kapağını çıkarın, görsel olarak, emin pelet altındaki olun.
3. 2 X Sulandırma Tamponu ve 20 ul Reaktif Sınıf Su 20 ul ekleyin.
4. Recap ve 5 s maksimum hızda karıştırın.
5. Flakon alt sıvı getirmek için 3 sn santrifüjleyin.
6. Görme 45-46 adımları tekrarlayın pelet, rehidrate kontrol edin.
7. Pipet 19 ul LightCycler kapiller tüpe sulu karışımı, bir kopyasını elde etmek için ikinci bir kılcal damar içine pipet adımı tekrarlayın.

10 Kılcal tüpler santrifüj

1. Bir kez tüm toplu iş için kılcal tüpler içine kılcal adaptörleri ile donatılmış mini santrifüj yük hazırlanmıştır.
2. 1 saniye aşağı darbe düğmesi basılı tutarak en düşük ayarda Santrifüj Bu test için hazırlık alt sıvı aktarır.

11. HIZLI Çalışma

1. Yeni bir dosya oluşturun. Etiket pozitif kontrol, negatif kontrol ve örnekleri (kimlik numarası).
2. Program 1: RNA Numune Hazırlama tutun
   1. Çevrimleri = 1
   2. Analiz Modu = Yok
   3. Hedef Sıcaklık = 40
   4. Kuluçka Zaman = 30 dakika
   5. Sıcaklık Geçiş Oranı = 20 ° C / s (varsayılan)
   6. İkincil Sıcaklık Hedef = 0 (varsayılan)
   7. Adım Boyutu = 0 (varsayılan)
   8. Adım Gecikme = 0 (varsayılan)
   9. Toplama Modu = Yok (varsayılan)
3. Program 2: RNA denatürasyonu
   1. Çevrimleri = 1
   2. Analiz Modu = Yok
   3. Hedef Sıcaklık = 94
   4. Kuluçka Zaman = 120s
   5. Sıcaklık Geçiş Oranı = 20 ° C / s (varsayılan)
   6. İkincil Sıcaklık Hedef = 0 (varsayılan)
   7. Adım Boyutu = 0 (varsayılan)
   8. Adım Gecikme = 0 (varsayılan)
   9. Toplama Modu = Yok (varsayılan)
4. Program 3: RNA Amplifikasyon
   1. Çevrimleri = 45
   2. Analiz Modu = Otomatik Analizi
   3. Hedef Sıcaklık, Segment 1 = 94, Segment 2 = 60
   4. İnkübasyon Süresi Segment 1 = 0 s Segment 2 = 20 s
   5. 1 ve 2 Seg Sıcaklık Geçiş Oranı = 20 ° C / s (varsayılan)
   6. İkincil Sıcaklık Hedef, Seg 1 ve 2 = 0 (varsayılan)
   7. Adım Boyutu, Seg 1 ve 2 = 0 (varsayılan)
   8. Adım Gecikme, Seg 1 ve 2 = 0 (varsayılan)
   9. Toplama Modu, Segment = Yok 1, Segment 2 = tek
5. Floresan Parametreler
   1. Ekran Modu: floresan kanal 2 (Ch2 / 1)
      Kazançlar:
      1. Ch 1 (F1) = 1
      2. Kanal 2 (F2) = 8
      3. Bölüm 3 (F3) = 1
   2. Her numune için gerçek zamanlı floresan verileri görüntülemek için, faiz örnek seçin ve ekranın alt kısmında, 'Göster Grafik' düğmesini tıklatın
6. Her kapiller için, sonuçlar şunlardır:
   • # - Atlıkarınca carousel pozisyonunu tanımlar
   • Örnek adı örnek adını sağlar
   • Kontrolü - her numune için numune tipi indentifies
   • Skoru - numune örnek floresan ve arka plan floresan düzeyi arasındaki ilişki kullanılarak hesaplanmıştır
   • Sonuç - örnek için genel sonuç görüntüler

12. Temsilcisi sonuçları:

Olası sonuçlar şunlardır:
Bugün: / bilinmeyen örnek bir test için kırmızı 'mevcut' diyoruz, bu örnek hedef tespit ve denetimlerin başarılı olduğunu gösterir .
Tespit Not: test / bilinmeyen bir örnek için yeşil bir 'tespit' bu örnekteki hedef tespit ve test kontrolleri başarılı olduğunu gösterir .
Lütfen tekrar: A 'lütfen tekrarlama', pozitif ya da negatif kontrol başarısız olduğunu gösterir .

HIZLI 7200 başarılı bir analiz bir örnek Şekil 4'te gösterilmiştir. Pozitif kontrol amplifiye ve yaklaşık 25 devir (x-ekseni) (y-ekseni) saptanabilen floresan oluşturur. Döngüsü eşik (BT)> 35 kararlaştırılan cut-off çoğu AIV referans laboratuvarları için. Bu nedenle, bu yöntem için pozitif kontrol AIV tespiti için kabul sayısı (0-35) döngü içinde bir floresan sinyal üretti. Buna karşılık, negatif kontrol, 45 döngüsünden sonra bile bir floresan sinyal üretmez. Benzer şekilde, batı sandpipers toplanan on iki örnek kuşlar AIV için negatif olduğunu gösteren bir floresan sinyal oluşturmak vermedi. Geleneksel bir laboratuvarda tüm pozitif örnekler takip testleri hiç yanlış pozitif yanlış olduğundan emin olmak için teşvik edilmektedir.

Şekil 1 sis ağları kullanarak Shorebird yakalama.

Şekil 2 en sandpipers kloakal ve orofaringeal numunelerin toplanması.

Şekil 3 HIZLI 7200 Programlama RNA amplifikasyonu için.

Şekil 4 HIZLI 7200 taşınabilir RRT-PCR pozitif ve negatif kontrolleri başarılı bir tahlil nasıl görüneceğini gösteren tarafından oluşturulan Fluorogram tam boyutlu resim görmek için buraya tıklayın

Tartışmalar

Burada sunulan hızlı tanı yöntemi AIV gözetim yabani kuş örnekleri zaman verimli ve doğru test kolaylaştırır. , Taşınabilir RRT-PCR daha az katı numune depolama gereksinimleri, sıvı azot nakliyatçılar veya kuru buz mevcut değilse, bir soğuk zincir bakım pratik olabilir uzaktan durumlar için uygundur. Buna ek olarak, alan biyologlar tarafından en az bilgiye sahip laboratuar tabanlı moleküler analiz yapılacak kadar basit oldu dondurularak kurutulmuş reaktifleri ile bu numune analizi bulundu. Bu ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifin Adı	Şirket	Katalog Numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
RNeasy minivan spin kolon	Qiagen	74106	RNeasy Mini Kit dahil
Toplama tüpleri (1.5 & 2 mL)	Qiagen	74106	RNeasy Mini Kit dahil
Tampon RLT	Qiagen	74106	RNeasy Mini Kit dahil
Tampon RW1	Qiagen	74106	RNeasy Mini Kit dahil
Tampon RPE	Qiagen	74106	RNeasy Mini Kit dahil
RNaz-bedava su	Qiagen	74106	RNeasy Mini Kit dahil
14.3 M β-mercaptoethanol çözüm	Fisher Scientific	BP176100
% 100 etanol	Fisher Scientific	NC9602322
Vortex Genie 2, 120V	Bilimsel Sanayi	SI-0236
Taqman İnfluenza A Hedef 1 (Hidroliz Probe)	Idaho Teknolojileri	ASAY-ASY-0109
LightCycler 20ml kılcal tüpler	Roche Uygulamalı Bilimler	04929292001
2 ml tüpler için rotator Mikro-santrifüj	Idaho Teknolojileri		HIZLI kiti dahil
Sağlamlaştırılmış Gelişmiş Patojen Tanımlama Cihazı (RAPID) 7200	Idaho Teknolojileri		HIZLI kiti dahil
Windows XP Professional ile Pentium tabanlı dizüstü	Idaho Teknolojileri		HIZLI kiti dahil
LightCycler Veri Analizi yazılımı	Idaho Teknolojileri		HIZLI kiti dahil