Method Article
この記事では、成熟オリゴデンドロサイト(OLS)を生成するために差別化初代培養におけるマウスのオリゴデンドロサイト前駆細胞体(OPC)の豊かな集団を、導出する方法を説明します。さらに、この報告書はマウス後根神経節ニューロン(DRGNs)の神経突起ベッドの上にマウスのOPCを播種によってマウスmyelinating共培養を生成する手法を説明します。
OL開発の根底にある分子機構を同定することはOL生物学の知識を深めるには重要であるだけでなく、このような多発性硬化症(MS)などの脱髄疾患の病因を理解するための意味を持っています。携帯電話の開発は、一般的に一次細胞培養モデルで研究されている。初代培養細胞は、 生体内に存在する余分な変数の自由、制御された環境を提供することにより、所定の細胞型の評価を容易にする。ラット由来OLの文化がOL生物学への洞察の膨大な量を提供しているが、マウスからOLの文化を確立することで、同様の努力が大きな障害に満たされている。文化マウス一次OLSする方法を開発することは可能なトランスジェニックマウス系統を利用するために不可欠です。
げっ歯類の組織からOPCを抽出するための複数のメソッドは、ニューロスフェアの導出、差動接着精製と1-3免疫精製に至るまで、記載されている。多くのメソッドが成功を提供していますが、ほとんどは大規模な文化の時間および/または高価な機器/試薬を必要とする。これを回避するために、当初はマッカーシー&デVellis 2で説明した方法の適応とマウス組織からOPCを精製することが好ましい。このメソッドは、新生児げっ歯類皮質由来する混合グリア培養液から物理的に分離するOPCを伴います。結果は、OLに富んだ文化に分化することができる精製したOPCの人口です。このアプローチは、その比較的短い文化時間や成長因子またはimmunopanning抗体の不必要な要件のために魅力的です。
精製された文化の中でOL発展のメカニズムを探ることは有益ですが、それは、髄鞘形成を評価するための最も生理学的に関連する環境を提供していません。ニューロンとの共培養のOLSは、軸索のOLを介した髄鞘形成を制御する分子的基盤への洞察を貸すだろう。多くのOL /ニューロンの共培養の研究については、後根神経節ニューロンは(DRGNs)選択肢のニューロンのタイプであることが証明されている。彼らは、抽出、混入細胞の最小限の量、そして緻密な神経突起のベッドの形成の容易さのため、OLSとの共培養に最適です。ラット/マウスmyelinating xenoculturesを用いた研究が4-6を公開されているが、出生後のマウス組織から共培養をmyelinatingなど/ OL DRGNの導出のための方法が記載されていない。ここでは、効果的に予想される結果の例と共に、そのような文化を生産する方法に関する詳細な方法を提示する。これらのメソッドは、OL開発/ myelinating機能に関連する質問に対処するために有用であり、神経科学の分野で有用なツールです。
倫理に関する声明
本研究で使用したマウスは、アニマルケアに関するカナダの協議会(CCAC)のガイドラインに従って世話した。実施した実験のための倫理的な承認は、プロトコル番号OGH - 119の下オタワアニマルケア委員会の大学から得た。
1。解剖 - OPC抽出のための新生児マウスの皮質
2。新生児皮質と混合グリア培養のメンテナンスの解離
注:細胞懸濁液に気泡の導入は、次の手順のすべての間に避けるべきである。
注:アンダー磨砕は、過剰粉砕に悪影響を細胞の生存に影響を与えるのに対し、組織の貧しい解離になります。これは深刻な細胞の生存に影響を与えるとして、溶液中に気泡を導入しないことが重要です。
3。 DRGN分離
注:、共培養DRGNs / OL DRGNsを生成するためには、混合グリア培養の生成後に一日に設立されるべきである。両方の文化のタイプは独立して成長、および9-10日後に結合されます。
注:多くの夾雑細胞は強く、それによってDRGNsのために細胞懸濁液を豊かに、ペトリ皿に付着しているでしょう。
4。 OL -濃縮培養物またはDRGN / OL共培養の確立のための混合グリア培養物からOPCの精製
5。免疫蛍光顕微鏡用培養液の処理
6。 OL -濃縮培養物からの全細胞タンパク質の抽出
7。濃縮OL文化のタンパク質上でSDS - PAGE分析
8。代表的な結果:
このプロトコルでは、OPCは、混合グリア培養内アストロサイト単層上に展開されます。この混合グリア培養は、P0 - P2新生児マウスの大脳皮質から得られます。 in vitroでの 1日目(DIV1)で、混合グリア培養は、位相差顕微鏡(図2a)で見られるように様々な形態を持つ細胞が含まれています。 DIV3で、星状膠細胞単層は、フラスコの底に形成し始める、とDIV8で、OPCは、明らかに単層の表面で観察することができます。 DIV9で、増殖OPCは一夜の高速軌道振とうすることにより精製するのに十分な密度に達している。精製のプロセスが完了すると、結果はOPCに富む細胞集団です。 DIV1ポスト精製では、OPCは少数のプロセス(図2b)を拡張する、シンプルな形態を持っている。 DIV3後の精製で、細胞が未熟なOLSを連想させるプロセスの複雑な網目構造を、拡張しました。 DIV6後の精製では、精製されたOLSは、膜構造リーフレットのようなフラット化して投影している。この形態の開発は、OLSの体外成熟の典型です。
免疫蛍光顕微鏡は、精製された細胞(図3A)OL -系統のものであることを示します。シードは、最初に明示的なコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(NG2)をOPCは、三日後に播種(図3B)内にミエリン関連糖タンパク質(MAG)正の未熟なOLSへと発展する。 DIV6で、多くのOLSエクスプレスミエリン塩基性タンパク質(MBP)、および典型的な成熟したOL形態を持っている。パーセントOL -系統細胞はOL濃縮培養(図3C)の純度を決定するために異なる時点で定量した。 DIV1後の精製では、文化は、50です± 14%NG2 + veの OPCは、無MAG + veまたはMBP + VEの OLSで。これは、精製されたOL -系統細胞は、分化OLSの無視できる数字で、播種時の前駆段階にあることを示します。いくつかは、前駆体の表現型を維持し、NG2ままDIV3で、多くのOLSは、MAG + VEの細胞(24 ± 5.9%)に分化している+(13 ± 8.0%)。 DIV3で、MAG + VE細胞 (3.2 1.2%)の小さな割合もMBPを表明している。 DIV6で、OLSの20 ± 5.9%ですMAG + 12 ± 7.3%がNG2 + VEの OPCはとして保持VEながら。さらに、文化内の細胞の21 ± 9.3%MBPです+この時点でVEの OLS。 SDS - PAGE分析では、さらに末期(図3D成熟OLSに分化する培養中のOPCの能力を示す、2'3' -サイクリック - ヌクレオチド3' -ホスホジエステラーゼ(CNP)と6日間の培養期間にわたってMBPの段階的発現を示しています。 )。総称し、これらのデータは、OPCからOL成熟の研究に適しOL -濃縮培養系を生産する手段としてこの方法を確立します。
このプロトコルはまた、マウスのみの組織源を使用してDRGN / OL共培養を確立する方法を説明します。しかし、共培養を生成するために、DRGNsは、最初に適切な神経突起のネットワークを生成するために単独で培養する必要があります。これらの出生後のマウスニューロン培養を汚染する線維芽細胞およびGLの増殖を防ぐために、10μMのFUDRの補充と、低血清培地で9日間栽培されている IAL細胞。 in vitroでの 9日間のコースで、孤立DRGNsは高密度神経突起のベッド(図4A)を生成する。この神経突起ベッドは、ニューロンのマーカーのニューロフィラメント200(NF)とTuj1(図4B)に対して免疫である。この時点で、精製したOPCは、神経突起ベッドに追加される可能性があります、と共培養myelinating生成するために追加の6日間培養した。
DRGN / OL共培養のDIV6、多くのMBPで+ VEの OLSは、NF + VE DRGNの神経突起(図5a)が間で観察することができます。内実を見ると、OLSは、多くの場合、MBP + VEの膜(図5bを、C)でそれらを鞘、多数のDRGNの神経突起と接触するために証明されています。
図1。新生児マウスの皮質とDRGの分離の特定の側面の解剖顕微鏡像。新鮮な抽出した新生児マウスの脳の(a)の背ビュー。点線は、切開が髄膜層の除去を容易にするために行われる必要がある領域を示している。(B)脳の腹側のビューは、点線は皮質の腹側間脳を満たす領域を示す。深い切開は、皮質の分離を助けるために点線に沿って行う必要があります。(C - C')脳の残りの部分から離れて皮質を詮索する方法の視覚的描写。(d)に新たに単離したP5 - P10マウスの脊椎前には余分な筋肉や骨を(D')離れてトリミングする。脊柱内DRGSの(e)の場所。つのマウスから隔離される必要DRGSの(f)のおおよその数値。要求する長い根を持つ(g)の DRG酵素消化する前にトリミング。点線は、根をトリミングする領域を示します。(G')後根トリミングをDRGの。
図2。 OPCは、混合グリア培養内で拡大して精製し、そして続いてOLに富んだ文化として区別されます。 (a)開発の各段階で混合グリア培養の位相コントラスト像を。 DIV1で、細胞はいくつかの平坦化された細胞と円形が表示されます。混合グリア培養の階層化は、アストロサイトはOPCは増殖している時にフラスコの底部に均一な単層を形成するDIV3、から始まります。多くのOPCは、アストロサイト単分子層の表面に付着DIV8(矢印)で見られる。一度混合グリア培養液から精製した(B)、DIV1 OPCは少数のプロセスのみを拡張した。 DIV3で、細胞は中間段階のOLSを連想させる多くのプロセスを、拡張しました。 DIV6で、平坦化されたOLS(アスタリスク)(破線)膜状のシートを生産しているように見える。スケールバーは50μm。
図3。 OL -濃縮文化の特性評価。開発のさまざまな段階で分離されたOLSの(a)の共焦点画像。 MAG + veの OLSは複数の樹木のプロセスを持っているのに対し、NG2 + veの OPCは、単純な形態を持っている。 MBP + veの OLSは、膜ミエリンのようなシートを拡張している。スケールバー、50μmのは。(B)精製OL -系統の細胞は、OPCとして発信、および6 DIV以上MAG + VE、MBP + VEの OLSに分化する。どれもMAG + veまたはMBP + VEない状態DIV1で、すべてのOPCは、NG2 + VEです。 DIV3で、MAG + veといくつかのMBP + veの OLSは明らかです。 OLSの大半は少数の残りのNG2 + VEの OPCのと、DIV6でMAG及びMBP + VEです。スケールバー、100μmのは。(C)の値を平均± 6 DIV上のさまざまな開発段階でのパーセントのSDは、OL -系統細胞。 DIV1で、すべてのOL -系統細胞はNG2 + VE、50会計±文化の中で全細胞の14%です。 DIV3とDIV6で、OL -系統の細胞は、それぞれ36を占めて± 6.8%、32 ±全細胞の8.4%は、NG2 + VE、MAG + veとMBP + VEの OLSの割合を変化させることから成る。(d)の SDS - PAGEを行った6 DIVの培養期間にわたってOLマーカーCNPとMBPの段階的発現を示す濃縮OL -培養物由来のタンパク質に関する。
図4。 DRGN文化プリOPCの播種の特性評価。 (A)9 DIVの培養期間の事前のOPC播種以上DRGNsの位相コントラスト像を。 DRGNsは少数のプロセスを持つ大規模なボディの細胞として発信し、ますます複雑な神経突起のネットワークを作り出す。スケールバー、100μmである。(B)DIV9(プレOPC種まき)に固定されており、ニューロン特異的マーカーTuj1とNF200について染色DRGNの文化の共焦点画像。 DRGNsは、OPCが共培養myelinating DRGN / OLを生成するためにシードされるかもしれない時に神経ネットワークを作成しました。スケールバーは50μm。
このレポートは、OL -濃縮培養物または共培養DRGN / OLの分化のためにマウスOPCを単離するための方法を説明します。単独で培養した場合、OPCはMBPに分化する+ VEの OLSを、膜状のシートミエリンのように生産。神経突起ベッドをDRGNに追加すると、OLSはMBPとDRGNの神経突起を包む+ VEの膜を。このモデルは、OLを介した軸索ensheathmentを支配する複雑な基盤の調査に利益をもたらします。
大きな値の間に、そのような文化の確立が技術的に困難です。特に、要求の厳しい側面が効率的な組織の消化/解離、バランスの培地のpHの維持、およびDRGNメディアの変更が含まれています。消化の長さは、組織の量を消化し、粉砕の量は組織の解離の効果と終了結果に影響されていることを考慮することが重要です。それは、経験豊かな研究者のために解離神経系の組織から、低細胞の収率を得ることが珍しくありません。さらに、マウスOPCは、特にアルカリ性の条件下で、培地のpHの変化に敏感になる傾向があります。 8.5%CO 2で培養の維持は、OPCはより基本的にやや酸性条件に耐えるように見えるので、これを防ぐことを目的としています。給餌DRGNsに関しては、メディアの変更は神経細胞を乾燥させるようにすることを迅速に実行する必要があります、しかし、発展途上神経突起のベッドを混乱させないよう穏やかにする必要があります。突然のメディアの変化は、基板からの神経突起ベッド、およびカバースリップから、その完全な解離の可能性が高い結果が外れる。
このモデルシステムの潜在的なメリットは大きく、その技術的な要求の性質を目立たなくします。このシステムの利点の一つは、胚組織を採取するために繁殖の女性を犠牲にする必要性を回避して、細胞培養の導出のための産後のマウスの使用です。もう一つの利点は、OPCの拡大のための増殖因子のための要件の欠如(GFS)です。混合グリア培養物は、アストロサイト由来の栄養因子の存在のためにおそらくOPCは、の伝播をサポートする環境を提供しています。このようなニューロスフェアを7,8を介して導出などの他の方法は、、そのような塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、上皮成長因子(EGF)とOPCの拡大のための血小板由来増殖因子(PDGF)などのGFSの分裂促進特性に依存しています。同様に、出生後(P5 - 10)DRGNsのためのマウスを使用すると、神経成長因子(NGF)、胚DRGNs 9、10のin vitroでの生存のために必要な神経栄養因子と培地を補充する要件を回避することができます。それはDRGNs 4で培養した場合にマイナスOLSのmyelinating能力に影響を与えるとして、NGFの使用を避けることは興味深い。大規模で使用すると、これらの試薬は高価になるとGF添加培地の使用を避けることにより、また、経済的利益を持っています。
おそらく、この培養モデルの最も重要な利点は、このようにトランスジェニックマウス系統の多種多様なOPCはとDRGNs両方を導出する機会を提供し、マウスのみの組織からの派生です。これはDRGNおよび/または髄鞘形成を支配するOPC固有のプロパティの両方の研究が可能になります。これは、軸索のOLを介した髄鞘形成を調節する受容体/リガンド相互作用を解明するために特に重要になります。すべてでは、この手法は、髄鞘形成の根底にある分子の手がかりを知るため、そのアプリケーションが原因で神経科学の研究に関しては大きな価値があります。
利害の衝突は宣言されません。
このプロジェクトは、カナダの多発性硬化症協会からRKRWOへの助成金によって賄われていたカナダの多発性硬化症協会から学生の身分の受信者です。 SDRは、健康研究のカナダとカナダの研究所の多発性硬化症協会からポストドクトラルフェローシップの受賞者です。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
製品名 | 会社 | 製品番号 | |
ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM) | マルチセル | 319から005 - CL | |
ハンクス平衡塩類溶液(HBSS) | インビトロジェン | 14170-112 | |
最小必須培地(MEM) | GIBCO | 12360-038 | |
ウシ胎児血清(FBS) | GIBCO | 10091-148 | |
ペニシリン - ストレプトマイシン(ペン/連鎖球菌) | GIBCO | 15140-122 | |
グルタミン | インビトロジェン | 35050-061 | |
ポリ- L -リジン | シグマアルドリッチ | P2636 | |
ウシ血清アルブミン(BSA) | シグマアルドリッチ | A4503 | |
人間merosin精製タンパク質(LN2) | ミリポア | CC085 | |
組換えラット毛様体神経栄養因子(CNTF) | ぺプロ | 450から50 | |
L -チロキシン | Biochemika | 89430 | |
ホロトランスフェリン | シグマアルドリッチ | T0665 | |
B27サプリメント | GIBCO | 0080085 - SA | |
ウシインスリン | シグマアルドリッチ | I6634 | |
3,3',5 -トリヨード- L -チロニン | シグマアルドリッチ | I6634 | |
プロゲステロン | シグマアルドリッチ | P8783 | |
プトレッシン | シグマアルドリッチ | P7505 | |
亜セレン酸ナトリウム | シグマアルドリッチ | S5261 | |
5 - フルオロ-2' - デオキシウリジン(FUDR) | シグマアルドリッチ | F0503 | |
パパインのソリューション | ワージントン | LS003126 | |
DNaseI | ロッシュ | 1010159001 | |
L -システイン | シグマアルドリッチ | C7352 | |
24ウェル組織培養皿 | Cellstar | 662から160 | |
ベントキャップ付T25 -組織培養フラスコ | コーニング | 430639 | |
10cmの組織培養皿 | コーニング | 430167 | |
10cmペトリ皿 | フィッシャーサイエンティフィック | 0875713 | |
コラゲナーゼ | ロッシュ | 103578 | |
CellTrics50μmのフィルター(オプション) | PARTEC | 04-004-2327 | |
ミエリン塩基性タンパク質(MBP)抗体 | ABD Serotec | MCA409S | |
NG2抗体 | ミリポア | AB5320 | |
ミエリン関連糖タンパク質(MAG)抗体 | ミリポア | MAB1567 | |
2'、3' -サイクリックヌクレオチド3' -ホスホジエステラーゼ(CNP)抗体 | Covance | SMI - 91R - 100 | |
アクチンパンAB - 5抗体 | フィッツジェラルド | 10R - A106AX | |
ニューロフィラメント- 200(NF)抗体 | シグマアルドリッチ | N4142 | |
チューブリンβ- 3チェーン(Tuj1)抗体 | ミリポア | MAB5544 | |
のAlexa Fluor ® 488ヤギ抗ウサギIgG(H + L)二次抗体 | インビトロジェン | A11008 | |
のAlexa Fluor ® 555ヤギ抗マウスIgG(H + L)二次抗体 | インビトロジェン | A21422 | |
のAlexa Fluor ® 647ヤギ抗ラット抗体(IgG)(H + L)二次抗体 | インビトロジェン | A21247 | |
ヤギ抗マウスIgG(H + L)- HRP標識二次抗体 | BioRad社 | 170-6516 | |
ヤギ抗ラットIgG(H + L)- HRP標識二次抗体 | サンタクルスバイオテクノロジー | SC - 2065 | |
4'、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール(DAPI) | シグマアルドリッチ | D9542 |
メディアのレシピ
100X OL -補足*
成分 | 追加する量 |
DMEM | 100mLの |
BSA | 1.02グラム |
プロゲステロン | 0.6mgの |
プトレッシン | 161 mgの |
亜セレン酸ナトリウム | 0.05mgの |
3,3',5 -トリヨード- L -チロニン | 4mgを |
-80 * ° Cで保存250μL分注し
T"> OLメディア成分 | 追加する量 |
DMEM | 23.75 mLの |
100X OL -サプリメント | 250μL |
ウシインスリン(1 mg / mLの在庫から) | 125μL |
グルタミン | 250μL |
ホロトランスフェリン(33 mg / mlストックから) | 37.5μL |
B27サプリメント | 500μL |
FBS | 125μL |
CNTF(50 ng /μLの在庫から) | 25μL |
混合グリア培養培地(DMEMで構成される)
成分 | 最終濃度 |
FBS | 10パーセント |
ペン/咽頭(株式から0.33%) | 33ユニット/ mlペニシリン、33μg/ mlストレプトマイシン |
グルタミン | 一パーセント |
DRGN培地(DMEMで構成される)
成分 | 最終濃度 |
FBS | 10パーセント |
ペン/咽頭(株式から1%) | 100単位/ mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシン |
消化溶液のレシピ:
OPCパパイン溶液(MEMで構成される)
成分 | 最終濃度 |
パパインのソリューション | 1.54 mg / mLの |
L -システイン | 360μg/ mLの |
DNaseI | 60μg/ mLの |
DRGパパイン溶液(HBSSで構成される)
成分 | 最終濃度 |
パパイン | 1.54 mg / mLの |
L -システイン | 360μg/ mLの |
DRGコラゲナーゼ溶液(HBSSで構成される)
成分 | 最終濃度 |
コラゲナーゼ | 4 mg / mLの |
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