ナノ析出法を通じて、ジブロック高分子ナノ粒子の製剤

要約

この記事では、ジブロック共重合体を用いたポリマーをベースとしたナノ粒子を合成するナノ析出の方法を説明します。私たちは、ジブロックの合成共重合体、ナノ析出技術、及び潜在的なアプリケーションについて説明します。

要約

ナノテクノロジーは、活用のスケールでナノメートル（ナノ粒子）の粒子のユニークな特性を含む科学の比較的新しい支店です。ナノ粒子はその大きさ、組成や表面の化学的性質を注意深く制御することができる正確な方法で設計することができる。これは、溶解性、拡散性、体内分布、放出特性と免疫原性のようなそれらの貨物の基本的なプロパティの一部を変更するために前例のない自由を可能にします。世の中に出て以来、ナノ粒子は、薬物送達、イメージング、および細胞生物学^1から4を含む科学や医学の多くの分野で利用されている。しかし、それは完全に知覚される技術的な障壁のために"ナノテクノロジー研究所"の外で利用されていません。この記事では、我々は潜在的なアプリケーションの広い範囲を有するポリマーベースのナノ粒子のプラットフォームを合成する簡単な方法を説明します。

最初のステップは、疎水性ドメインと親水性ドメインの両方を持つジブロック共重合体を合成することである。モデルポリマーとしてPLGAとPEGを使用して、我々は、EDC / NHS化学^5（図1）を使用して結合反応を説明した。我々はまた、ポリマーの精製のプロセスについて説明します。合成したジブロックコポリマーは、疎水性 - 親水性相互作用を通してナノ析出プロセスでナノ粒子に自己集合することができます。

に記載のポリマーナノ粒子は、非常に汎用性があります。ナノ粒子の疎水性コアは、薬物送達experiments6に対して難溶性薬物を運ぶために利用することができます。さらに、ナノ粒子は、DMSOのような溶剤を必要とするワートマニン、などの難溶性分子生物学試薬、のために有毒な溶剤の問題を克服することができます。しかし、DMSOは細胞毒性が、実験の妨げになることがあります。これらの難溶性の薬物や試薬は、効果的に最小限の毒性を有するポリマーナノ粒子を使用して配信することができます。ポリマーナノ粒子はまた、蛍光色素でロードされ、細胞内輸送の研究に利用することができます。最後に、これらのポリマーナノ粒子は、表面のPEGを介してリガンドを標的に結合させることができる。そのような標的ナノ粒子は^{,7 - 10}や細胞内の特定のエピトープにラベルを付けるために利用することができます。

プロトコル

1。 PLGA - B - PEGポリマーの合成

1. ターミナルカルボキシレート基（PLGA -カルボン酸）とポリ（D、L -ラクチド- co -グリコリド）（PLGA）を5mMの濃度で（のような材料のセクションに記載されている）PLGAのための任意の溶媒に溶解させる。 PLGAは、穏やかに攪拌しながらこの濃度で溶解させることができる。
2. NHS（分子量115.09）とEDC（分子量191.7）の両方は、25mMの濃度でPLGA溶液に溶解されています。 （EDCとNHSの両方が、PLGAに比べて5倍の化学量論的過剰量で添加されています）。 PLGA -カルボキシレートは、約1時間穏やかに撹拌しながら、PLGA -カルボン酸液にEDCとNHSを追加することにより、PLGA - NHSに変換されます。
3. 反応生成物PLGA - NHSは、洗浄液のメタノールを添加することにより沈殿させる。メタノールの約10倍の量の過剰がソリューションに追加されます。ソリューションをPLGA - NHS外沈殿、2000 × gで遠心分離し、上清を破棄され（EDCとNHSのトレースを削除します。メタノールで洗浄のこの手順では、少なくとも3回繰り返される。
4. PLGA - NHSペレットは、洗浄溶液の痕跡を除去するために30分間真空下で乾燥させる。
5. PLGA - NHSペレットは現在、PLGAを溶解するために最初に使用したのと同じ濃度で同じ溶媒に再溶解している。ヘテロPEG（アミン- PEG -カルボン酸）は、その後、5mMの濃度のPLGA溶液に添加される（1:1の化学量論比）。混合溶液を絶えず撹拌しながら24時間インキュベートされる。
6. 24時間後、反応生成物PLGA - B - PEGブロック共重合体は、過剰の洗浄液のメタノールを添加することにより沈殿させる。三回上記のように洗浄し、遠心分離処理を繰り返します。これは、すべての過剰な未反応のPEGを削除します。
7. PLGA - B - PEGブロック共重合体は、真空下で乾燥させる。

2。 PLGA - B - PEGナノ粒子の調製

表面にPEGで覆われたPLGAのコアを持つナノ粒子は、これらのジブロック共重合体を調製することができる。別の疎水性薬物の様々なそのようなナノ粒子に封入することができる。蛍光化合物がナノ粒子に封入することができますまたはPLGAに結合させることができるため、これらのナノ粒子は、蛍光イメージングに使用することができます。

ナノ析出法は、カプセル化するために必要な貨物は、本質的に疎水性の高い場合は特にナノ粒子を作るために使用されます。

1. PLGA - B - PEGブロック共重合体と薬/貨物は、（カプセル化する）PLGAを溶解する任意の溶媒に溶解されています。 PLGAは、アセトニトリル、DCM、テトラヒドロフラン、アセトンや酢酸エチルなど、多くの一般的な溶剤で溶解させることができる。それはナノ粒子の性質に影響を与えるとして、溶媒の選択は、重要です。したがって、適当な溶媒は、このステップで使用する必要があります。
2. ポリマー/薬剤混合物を次いで、約3 mg / mLの最終的なポリマーの濃度を与える水を攪拌しながら3〜5ボリュームに滴下する。 （図2）
3. 攪拌は、ナノ粒子が自己集合によって形成し、有機溶剤の痕跡を除去できるように、減圧下で2時間継続される。
4. 収穫と精製：ナノ粒子を洗浄し、アミコンフィルター（MWCO 20KDa）を使用して10分間2700 × gで遠心分離によって濃縮し、PBSに再構成されています。これは、すべての非捕捉された薬剤/貨物を削除します。このようなサイズ、表面電荷、および薬物充填効率などの基本的な生物物理学的特性評価は、より良いナノ粒子の特性を理解するために実行することができます。

3。ストレージ

凍結乾燥は、ナノ粒子^11を格納するために一般的に使用される方法です。凍結乾燥は、長期安定性¹²ナノ粒子の物理的および化学的特性を保持します。凍結乾燥プロセスは、粒子へのストレスの原因と処方を不安定にすることができます、凍結保護剤（凍結​​ストレスからの保護）とlyo -保護剤を（乾燥ストレスからの保護）一般的に使用されるように。これらの保護剤の選択は、蓄積時間¹³の所望の長さによって決定されます。

1. 凍結乾燥では、そのTg以下に凍結することにより、サンプルの総凝固があります。
2. 乾燥工程では、氷が昇華によって除去される。温度と圧力は、効率的な凍結乾燥のプロセスを達成するために最適化する必要があります。

4。代表的な結果：

PLGA - B - PEGジブロック共重合体のキャラクタリゼーション

さまざまな手法は、ポリマーの成功共役を確認するために使用することができます。 PLGA - B - PEGの組成は、400 MHzの1H核磁気共鳴（NMR）を用いて特徴づけることができる。形成された生成物（PLGA - B - PEG）の分子量はゲルパーミエーションクロマトグラフィー（GPC）によって確認することができます。 PLGA - B - PEG分子量distribution個の曲線と溶出時間は、PLGAとPEG単独で異なっている必要があります。組み合わせでは、これらの技術は、形成された製品を特徴づけ、抱合反応が成功したかどうかを判断する必要があります。

PLGA - B - PEGナノ粒子のキャラクタリゼーション

粒径と粒度分布は動的光散乱法によって測定することができる。ナノ析出プロセスのさまざまなパラメータは、粒子の大きさに影響を与えます。最初に使用されるポリマー（PLGAとPEGの両方）の分子量は、また粒度分布に影響を与えます。遷移電子顕微鏡（TEM）も、図3に示すようにナノ粒子のサイズ分布と構造を確認するために使用することができます。粒径の範囲は、nmの範囲である。不均一なサイズ分布を持つ大規模な粒子サイズは、抱合反応やナノ析出法のニーズの最適化でエラーを示している可能性があります。さらに、表面のゼータ電位はZetaPALSによって測定することができる。
薬/貨物積載効率は標準HPLCで定量することができる。

粒子は、有機溶剤及びHPLCに溶解させる薬剤/貨物（図4）の吸光度を測定するために実行することができます。ナノ粒子の固定量を30スライド- A - Lyzer MINI透析ユニットで透析されている既知の場所薬物放出動力学的研究を行うことができます。一定の時間間隔で、透析ユニット内のコンテンツが収集され、有機溶剤の等量は、ナノ粒子を溶解するために追加されます。 HPLCは、薬物/貨物コンテンツを定量化するために、これらのサンプルに対して行われます。

図1。 EDC / NHS化学

図2。高分子ナノ粒子を調製するためのナノ析出法は、PEG - PLGAジブロックおよび粒子にロードされる薬物や貨物を含む（アセトニトリルまたはDCM）溶剤の有機溶液をH ₂ Oを攪拌しながら3〜5 mLを滴下する

図3。 nanoparticesの透過型電子顕微鏡。PEG - PLGAはwortaminを含むナノ粒子のTEM像。リンタングステン酸は、造影剤として使用されました。

図4。 PBSで透析後のナノ粒子からのパクリタキセルのナノ粒子からの薬物の放出制御が。リリース。記載時に、粒子は透析カセットから取り出し、アセトニトリルに可溶化。溶液をHPLCで測定した。ナノ粒子の2つの別個のロットを比較した。

ディスカッション

ジブロックコポリマーを用いたナノ析出法は、高分子ナノ粒子を設計するための簡単​​、迅速な方法を表します。得られたナノ粒子は、難溶性化合物の送達に利用することができる疎水性のコアで構成されています。標的リガンドへの潜在的な、さらに結合のための部分を提供しながら、表面親水性層は、優れた水溶性を可能にします。

リポソーム、高分子ナノ粒子?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬	会社	カタログ番号	コメント
EDC	サーモサイエンティフィック	22980	共役試薬
NHS	サーモサイエンティフィック	24500	共役試薬
アミン- PEG -カルボン酸	ライサン島バイオ（株）	NH2 - PEG - CM - 5000	ポリマー（任意のPEG MW、5000がここに記載されている使用可能）
PLGA - carbxylate	Lactel	B6013 - 2	高分子
ジクロロメタン（DCM）	シグマアルドリッチ	34856	溶剤
アセトニトリル> 99％純度	シグマアルドリッチ	34851	溶剤
メタノール> 99％純度	シグマアルドリッチ	34860	洗う