2光子顕微鏡を用いてマウスの胸腺の生体内イメージング

要約

我々は、胸腺の生体内イメージング買収のための新たな研究ツールとプロトコルを開発しました。我々の技術は、T細胞の開発が発生した胸腺内で"ニッチ"の同定に役立つはずです。

要約

二光子顕微鏡（TPM）は、組織や器官の奥深くの領域での画像取り込みを提供します。新しい定位ツールや外科的手技の開発と組み合わせることで、TPMは、臓器内部の"ニッチ"を特定し、生きた動物で細胞の"振る舞い"を文書化する強力なテクニックになります。生体内イメージングが最高の臓器内に実際の細胞挙動のような情報を提供していますが、それは多くの手間と技術的に代替のex vivoイメージングの買収よりも、必要な機器/手続きの面で厳しいの両方です。従って、我々は外科手術と私たちは胸腺内でのFoxp3 +細胞の移動を追跡することができる小説"定位"オルガンホルダーを説明します。

Foxp3は制御性T細胞（Treg）の世代のためのマスターレギュレータです。すなわち：また、これらの細胞は、その起源に応じて分類することができます。胸腺分化制御性T Oとして、（nTregs）"天然に存在する制御性T"と呼ばれています末梢変換Tregsの（pTregs）にpposed。研究のかなりの量がこれらのT細胞の表現型と生理学に関する文献で ​​報告されているが、ほとんどは他の細胞とのin vivo相互作用について知られている。この欠陥は、そのような観測を可能にする技法の欠如に起因する可能性があります。このホワイトペーパーで説明されているプロトコルは、このような状況のための救済策を提供します。

我々のプロトコルは、胸腺上皮細胞を含むいくつかの上皮細胞の分化を損なうDNA配列の厳守変異を持っているので、内因性の胸腺を欠くヌードマウスを用いて構成されています。ヌードマウスは、ガンマ線照射されたとFoxp3 - KI ^{GFP / GFP}マウスから骨の髄（BM）で再構成。 BMの回復（6週間）の後、各動物は、腎被膜の内部に胚性胸腺移植を受けた。胸腺受け入れ（6週間）の後、動物を麻酔し、腎臓が含む移植胸腺は、露出して私たちの臓器のホルダーで固定されており、TPMによるin vivoイメージングのための生理的条件下で維持した。我々は、制御性T細胞の発生における薬物の影響を研究するためにこのアプローチを使用している。

プロトコル

1。動物の準備

重要な注意事項：BM細胞懸濁液および胸腺移植は無菌条件下で行った。胸腺移植が私たちの動物施設内にある手術室で行われている間BM懸濁液は、私たちの細胞培養室のフードの内側を調製した。これらの無菌状態を維持し、保証するために、我々はこれらの場所で私たちのビデオを記録することはできませんでした。しかし、全ての手術材料はオートクレーブと外科ベンチは、以前はVirkon（Pharmacal研究所（株））および70％エタノールで洗浄した。すべての手順は、動物実験によって承認され、委員会（IACUC）を使用して、彼らはヨーロッパの実験動物学協会（FELASA）ディレクティブの連盟との合意にであった。承認ID番号がAO10/2010です。すべての画像実験では、ターミナルの手順だったと動物は、画像の終わりの直後に安楽死させ、買収。

詳細な手順は次の通りです：

1. 照射（γ-照射装置付き）骨髄（BM）の内部に内因性造血前駆細胞を破壊するために900ラドを8週齢のヌードマウス。あなたが静脈内注射、さらにBM再構築のためにドナー骨髄細胞を調製するまで照射した後、それらのケージに動物を返します。このBMの転送は、照射1時間後に実施した。
2. BMドナー動物を区切ります。つの動物の後肢の脛骨と大腿骨は、一般的に最大3レシピエント動物に再構成するのに十分です。 CO ₂で安楽死した後、後肢を削除してから、骨から皮膚と筋肉を取り除く。
3. 各骨の閉鎖端をカットし、PBSでそれをフラッシュ（またはRPMI）またはBMを削除するにはPBSを2ml（またはRPMI）で、乳棒を用いて、すり鉢ですべてを押しつぶす。
4. 活発な吸引USIの繰り返しによる単一細胞懸濁液中にBM構造を混乱させるP1000ピペットNG。別の方法としては、21G注射針を通して何度もBMを渡すことができます。遠心（400グラム、5分、RT）は、PBSで細胞を再サスペンドし、ヌード照射レシピエントに静脈内注入する。我々の実験で我々はすべての制御性T細胞（Treg）はGFP ^1を発現するFoxp3を- KI ^{GFP / GFP}マウス由来^の BM使用。
5. 非BM -再構成された動物は14日以上生き残ることができないので、ドナーBMの受け入れは、転送後の最初の日で発生します。しかし、1つはすべてBMコンパートメントの完全な回復を可能にするために4〜6週間待つ必要があります。 Bactrim（ロシュ）は、細菌感染症のリスクを減少させるために照射後の最初の週の間に水（2 mg / mlの）に追加されました。
6. 胚性胸腺移植は、既に^2を説明されました。簡単に言えば、同質遺伝子マウスの繁殖ペアを起動し、プラグ（性交の証拠）毎日チェックしてください。 pregnの15日目の別のプラグインの女性とCO ₂安楽死、それらアンシー（プラグの観察は、妊娠の1日目です）。胚および胸腺を削除します。転送されるまで冷PBSで胚性胸腺を置きます。
7. 胸腺移植を実行するには、ケタミン（マウスの体重の120μg/ gの）/キシラジンで麻酔BM -受信者ヌードマウス（マウスの体重の16μg/ gの）と37℃で加熱パッドの上にそれらを保つ° Cが得られるまで意識不明。
8. 外科的に胸腺の移植を実行するために腎臓を公開。最初ChloraPrep（Carefusion社）および70％エタノールで肌をスクラブ。その後、動物の背側体の部分の皮膚をカット1 cmの2ミリメートル怒鳴る最後の胸部肋骨を行います。
9. 腹腔をカットし、この空洞の腎臓を引き出します。手術用メスの刃と腎被膜の小さな表面的なカットを行います。非常に薄いチップで鉗子を使用すると、レシピエントマウスの腎被膜下に袋を作り、このポーチに4胸腺葉まで追加。
10. 腎臓bを置くその代わりにACK、1つまたは2つのステッチで腹腔を縫合し、次に同じ縫合法を使用してマウスの皮膚を閉じます。また、縫合糸は、外科的接着剤を使用して行うことができます。
11. 皮下右動物の苦痛を避けるために、彼らは麻酔から回復し始めるまで加熱パッドで動物を維持するために手術を終えて（5 mg / kgでブトルファノール）鎮痛剤注入。マウスは、糸を除去するから、ケージメイトを防ぐために、移植後最初の3日間は個別にケージに入れています。 1週間後に抜糸する。
12. ヌードマウスはT細胞を持っていない。したがって、血中のCD4 +またはCD8 + T細胞の割合を監視することにより、胸腺移植の受け入れを評価することができます。週一回、胸腺移植後2週間、動物の出血、抗CD4、抗CD8モノクローナル抗体（MAb）と血に染まる。 CD4する場合：CD8比は約2:1である、移植胸腺は（図1）完全に機能します。

"> 2。生体内画像取得

あなたが事前に必要とそれらを脇に置くすべての材料を準備します。

1. ケタミン/キシラジン（項目1.5で説明したのと同じ用量）と37℃の加熱パッドの上にそれらを配置℃で動物を麻酔血流の未来の可視化を可能にするために静脈内ローダミンBイソチオシアネート - デキストラン（PBS中20 mg / mlの）の100μlを注入する。
2. 以前の項目1.6に記載されたプロトコールにしたがって移植胸腺を含む腎臓を公開。
3. 元の位置に戻ってから腎臓を防止するために、針で皮膚の切開の側面を閉じます。
4. それは湿った保つために臓器の上にPBSに浸した綿のピースを置きます。
5. 動物ホルダーの段階（図2A）の上に加温パッドを置く。
6. 動物の所有者、オルガンの上（図2B）に加熱パッドの上に動物を置く。
7. クランプmで、両側で臓器をつまんで薄いアルミ箔のADE（図2C）。
8. 動物のホルダーを閉じて、できるだけ近いあなたの組織（図2D）にトップヒータープローブを置きます。このヒータープローブは常に臓器の温度を測定し、37℃でそれを維持し、電流を調整するヒーターには、この情報を送信します
9. PBSに浸した綿を取り出して、℃のあなたの準備の上に30℃の低融点アガロースを（PBS中2％）に追加します。
10. 上部ヒーター（図2E）と製剤全体をカバーしています。このヒーターの絞りで客観的な（図2F）からアガロースを隔離カバーガラスがあります。マウスの麻酔を監視し、すべての40分をブーストハーフ用量を注入する。画像取得後、CO ₂で動物を安楽死させる。

注：アルミホイルのクリップと上部ヒーターの写真を図3に示されている。

3。二光子イメージング買収

私たちは、直立"プレーリーアルティマXY"二光子顕微鏡を使用。我々のシステムは、Tiが搭載されています：サファイアレーザー、同時最大4チャンネルの買収のための4つの最上位光電子増倍管と20倍の水浸対物レンズを。

1. チタンをオンにする：サファイアレーザーと全体の顕微鏡システムを。
2. 所望の波長に応じてダイクロイックミラーとフィルターセットを追加。我々のケースでは565 nmのダイクロイックミラーを含むオリンパス- BX2クロマホルダー、一50分の525 nmフィルター（Foxp3を- GFPの信号用）、および1 50分の595 nmフィルターを（血管の内側デキストラン-ローダミン- B信号の使用）。使用するレーザーの波長範囲は880から900nmの間であった。
3. 顕微鏡に動物のホルダーを追加し、接続して、すべてのヒーターをオンに、慎重に水の中に目標を下げて、容器または一部GFP - Tregsのに焦点を当て、上部ヒーター開口部に水を加える。
4. 顕微鏡でのx、y、zの外部コントロールは、迅速に領域を見つけるために組織を調査興味のある。
5. 色分解を最適化し、背景の上に十分な信号を達成するために必要なレーザーの量を最小限に抑えるために光電子増倍管のゲインを調整します。あなたの組織の光損傷を避けるために、レーザーの最小量を使用するようにしてください。
6. 興味の領域が特定されると、タイムラプスイメージングを開始する。私たちのケースでは、典型的な5D（X、Y、Z、T、および色）買収のプロトコルは4.0μm、Z -手順、xと140μmのyの長さに分け、50μmの深さの組織ボリュームの連続した​​画像を取得で構成されていますそれぞれ。各ボリュームには、取得するのに30秒かかります。したがって、60の買収は、画像取得の約30分を実行します。
7. 機関のサーバーにデータを転送し、多次元のレンダリングとセルのトラッキングを実行するにはImageJの、Imaris、またはVolocityソフトウェアを使用してください。

4。代表的な結果

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図1。 。胚の胸腺の受け入れと機能は、BM回復した後、胚の胸腺は、BM再構成された動物に移植し、2週間胸腺移植後に、これらのマウスは、抗CD4または抗- CD8を染色することによってT細胞のサブタイプの割合を監視するために、週に一度採血したモノクローナル抗体。我々は、胸腺が正常CD4を持つ動物に受け入れられたとみなさ：1.5-2.0:1周りCD8比（）。その機能を確認するために、我々はいくつかの胸腺移植動物を屠殺し、WTマウス（B）と異なる胸腺細胞亜集団の割合を比較した。ダブルネガティブ（DN; ^- CD8 ^- CD4胸腺細胞）の割合サブポピュレーション（抗CD25および抗CD44モノクローナル抗体で染色することによって）、ダブルポジティブ（DP、CD4 ⁺がCD8 ⁺胸腺細胞）と、シングルポジティブ（SP）CD4 ⁺またはCD8 ⁺胸腺細胞、これらの動物間で類似していた。

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図2。アニマルホルダアセンブリ。深く麻酔した後、動物は、以前は動物ホルダーのステージ（）の上部に取り付けられた、加熱パッドの上に置かれます。移植胸腺を含む腎臓は、（B）上を向いている。アルミ箔のクランプは、繊細にその場所で保つために全体の腎臓（C）をつまみ。図。 1Cの挿入は、詳細にクランプを示しています。動物のホルダーの上部は場所（D）に置かれます。 PBSに浸した綿は暖かい低融点アガロースで置き換えオルガンの上、から削除され、上部ヒーターは（E）が追加されます。最後に、全体のアセンブリは、ここでの目的（F）で表される、顕微鏡に転送されます。

図3。ホルダー部分の詳細。これらの写真は、腎臓を保持しているアルミ箔のクランプを（）（B）を示す。移植胸腺が配置されている地域にも注意してください。これは、約領域を示しています胸腺カプセルをカットし、胚の胸腺を入れるポケットを作るために。トップヒーターのカバーガラス（C）はその底の部分（D）へのシリコーン接着剤で固定した。

ムービー1。酸素と温度の生理的なレベル（37℃）が全体のプロセス中に保持された胸腺内のFoxp3を- GFP +胸腺細胞の生体内イメージング。血流とTregsのの動きに注意してください。これらの速度を測定し、公表データと比較することができます。 ムービーを表示するにはここをクリック。

映画（2）の画像を30で取得された胸腺内部の制御性Tの生体内イメージング℃に血流の維持にもかかわらず、動きと細胞の丸い形がないことに注意してください。 ムービーを表示するにはここをクリック。

ディスカッション

本稿では、生きている動物内の胸腺細胞の二光子励起イメージングのための手順を示した。我々はまた、血流の継続と撮像法の間に臓器の温度のメンテナンスとして、1つは注意深く制御する必要のあるいくつかのパラメータを説明した。それにもかかわらず、臓器を安定に保つために慎重な努力にもかかわらず、そのような"臓器漂流"のようなモーションアーチファクトが発生する可能性があります。後部画像補正は、この目的のために特別に設計されたアルゴリズムの開発によって行うことができます。さらに画像解析には、エラーを最小限にしようと新しいプロトコルの開発の源である可能性があります。

胸腺は、すべてのT細胞が産生される器官であると、したがって、その免疫がγδの世代を理解することに興味がある臓器、CD4、またはCD8 T細胞は、彼らの注意を焦点を当てます。 T細胞に関するほとんどの研究は、これらのC言語の数字の違いおよび/または安定性に基づいています。in vitroで/ in vivoでの操作で別の後にells。しかし、唯一のin vivoで可視化した後、我々は、恒常性^3-7を維持に伴う免疫系の細胞との相互作用を観察できる。従って、胸腺細胞のin vivoでの観察に優れたT細胞生物学を理解することがおそらく最も重要な情報が欠落しての一つです。生体内TPMは、T細胞の動きとの相互作用の詳細な画像を提供し、我々は、それが詳細な胸腺細胞の研究のために使用する方法をここに示しています。しかし、すべての技法には制限があります。生体内イメージング買収は体内の細胞の振る舞いを反映するための最も正確なシステムですが、それは臓器の植画像取得が少ない労力で、免疫システム^8,9に関する重要な情報を収集するために使用されていることも事実である。さらに、1つは、生体内イメージング法は、麻酔動物での組織や血管を露出させる手術を必​​要と否定することはできませんそれ自体はこれは、全臓器生理学¹⁰の変化を引き起こす可能性があります。それにもかかわらず、開発されている外科手術¹¹および新しい方法に起因するアーティファクトを廃止し非侵襲的な方法がありますそれより^12を使用される動物は、事前に準備する。したがって、新しい外科的処置と通行料が最小化またはバイパス生体内イメージング買収の実際の制限をし、より多くの科学コミュニティにアクセスできるようになります。

我々は我々が説明した方法は実現可能であり、それは我々が使用していることを、in vivoでの全身操作、そのような薬剤投与にすべて報告していることを実証している。従って、我々は、胸腺細胞の開発に関する更なる研究を補完し、強化するためにすでに利用可能なex vivoでのテクニックと一緒に、このメソッドの使用方法を示唆している。

資料

試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
Name	Company	Catalog Number	Comments
ローダミンB ishothiocyanate -デキストラン	シグマアルドリッチ	R9379	20 mg / mlのに在庫を準備
二光子顕微鏡	プレーリーテクノロジーズ株式会社	プレーリーウルティマXY
チタン：サファイアレーザー	コヒーレント社	カメレオンウルトラファミリー
20x/1.00 NA液浸対物レンズ	オリンパス（株）	XLUMPLFLN 20XW
ホルダー（フィルター/ダイクロイック）	クロマテクノロジー株式会社	91018 BX2（U - MF2）
525 nm/50フィルター	クロマテクノロジー株式会社	ET525/50m
595 nm/50フィルター	クロマテクノロジー株式会社	ET595/50m
565 nmのダイクロイック	クロマテクノロジー株式会社	565dcxr
Imarisソフトウェア	ビットプレーンAG社	Imaris
Volocity	パーキンエルマー社	Volocity
ImageJの	NIH、米国	ImageJの