標準的なインクジェットプリンタを使用して一時的な細胞膜孔を作成する

要約

bioprinterにHP DeskJet 500プリンタを変換するために使用されるメソッドの説明を参照してください。プリンタは、膜に一時的な毛穴の原因となる生きた細胞を処理することができます。これらの孔は印刷された細胞に蛍光G-アクチンを含む小分子を、組み込むために利用することができる。

要約

Bioprintingは、組織工学、直接セル·アプリケーションの治療、およびバイオセンサー微細加工などのアプリケーションと重要性の広い範囲を持っています^。1月10日最近では、サーマルインクジェット印刷は、遺伝子トランスフェクションのために使用されています^。8,9サーマルインクジェット印刷プロセスがに示された一時的に細胞の生存に影響を与えずに細胞膜を破壊する。膜の一時的な毛穴は、特に細胞質に、膜を通過するには大きすぎるであろう分子を導入するために使用することができます^{。8,9,11は、}

ここに示されているアプリケーションは、細胞に蛍光標識したG-アクチンモノマーの取り込みのためのサーマルインクジェットプリントを使用することである。細胞内に分子を注入するためにサーマルインクジェット印刷を使用する利点は、技術が細胞に比較的良性であるということです。印刷後^8、12細胞の生存率は、標準セルPLAと同様であることが示されているティンメソッドを^1,8。さらに、インクジェット印刷は、手動マイクロインジェクションよりもはるかに高速である、数分で細胞の数千を処理することができます。印刷によって作成された孔は、約2時間以内に完了することが示されている。しかし、小さなタンパク質および/ ​​または粒子と細胞を注入する手法を制限し、この印刷技術とともに（〜10 nm）で作成された細孔のサイズに制限があります^。8,9,11

プリンタの標準のHP DeskJet 500プリンタは、セルの印刷を可能にするために変更されました^。3、5、8カバーを取り外し、紙送り機構は、機械的なレバーを使用して取り消されました。ステージは、直接プリントヘッドの下に顕微鏡スライドとカバースリップの配置を可能にするために作成されました。インクカートリッジは、開かれたインクを除去し、それらが細胞を使用する前に洗浄した。印刷パターンは、単純な印刷コマンドを使用してプリンタを制御する標準的な描画ソフトウェアを使用して作成されています。 3T3線維爆発は、コンフルエンスまで増殖トリプシン処理し、リン酸塩に再懸濁させた水溶性の蛍光標識されたG-アクチンモノマーと酸緩衝生理食塩水。細胞懸濁液は、インクカートリッジに分注した、細胞の行は、ガラス顕微鏡カバースリップ上に印刷された。生細胞は蛍光顕微鏡を用いて画像化され、アクチンは細胞質全体に発見されました。細胞への蛍光アクチンの取り込みは、短時間細胞骨格ダイナミクスのイメージングを可能にし、幅広い用途に有用である^{。13から15}

プロトコル

1。のHP DeskJet 500を変換する

これは、この手法は多くの市販のインクジェットプリンタで動作するべきであることに注意する必要があります。ただし、古いプリンタでは、彼らが同じように簡単に詰まらせていない大径ノズルとインクカートリッジを使用しており、良い仕事する傾向があります。さらに、古いプリンタにはバイパスが容易である機械的な給紙センサーを使用する傾向があります。オプティカルセンサーを搭載したプリンタがだまされますが、各サイクル中にプリンタの遠端に紙の小片を使用していますが、 "トリック"への機械的なシステムよりも少し困難であることができます。最高の仕事は、現在市販されているプリンタは、低解像度（DPI）を持っています。

高解像度のプリンタでは、より簡単に詰まらせる傾向があります。のHP Deskjet 500の解像度は300 dpiです。 600 DPIの解像度を持っている多くの市販のプリンタ（HP DeskJetのシリーズなど）があります。このタイプのプリンタは、ノズルのわずかな増加に伴って使用することができます（セクション3）慎重にクリーニングを使用して軽減することができる問題を目詰まり。

1. プリンタの底部基地から、いくつかのプラスチック製のクリップのロックを解除し、ゆっくりと上部をオフに持ち上げてプリンタ上部のプラスチックケースを削除します。
2. を外し、ボタン/プリンタの上部からの光パネルを表示し、それはプリンタのマザーボードに接続したまま。
3. 特に、プリンタの内部に、インクカートリッジがかかっていると印刷が発生した領域を清掃してください。
4. 紙送り機構に電力を供給するケーブルを見つけて、マザーボードからそれらのプラグを抜きます。
   1. はHP DeskJet 500で、これらはちょうど正面の左側に向かって給紙トレイの下に発見された。
5. 紙の検出メカニズムを見つけます。手動プルハンドルとして機能する文字列やワイヤループを貼り付けるためのメカニズムをバイパスしてください。
   1. はHP DeskJet 500で、紙の検出機構は、印刷/紙送り機構の上と後ろに見つかった灰色のプラスチック製のレバーです。
6. ただカートリッジのプリントヘッドの下のレベルに所望の印刷スライドを実現するための紙送り機構（用紙はから供給され、堆積される場所）の前にステージを作成します。
   1. 私たちの実験のために、15 mLの遠心分離管の泡の出荷ホルダーは、所望の高さにスライドの最終レベルをもたらすために、印刷領域内の場所で録音し、いくつかの顕微鏡スライドを使用しました。
7. 無菌性を維持するために、プリンタは、標準的なバイオハザードキャビネットまたは卓上層流フードの内側に配置することができます。
8. 市販のインクジェットプリンタを変更すると、通常のプリンタのメーカー保証が無効になりますことに注意することは重要です。

2。変換証券HPインクカートリッジ（HP 26ブラックインクカートリッジ）

1. 当分の間、プリンタの連絡先やプリントヘッドを覆っている保護テープを残して、そのパッケージからカートリッジを取り外します。
2. 体を安定させるクランプまたは万力（単にしっかりと通常同様に働いて手でカートリッジをつかんで）のいずれかのカートリッジ（黒部分）の、いずれかの障害の緑の上を明確に残します。
3. ペンチやモンキーレンチを使用して、カートリッジの緑色の上部をつかみ、それを自由に中断するまで、前後に数回ねじります。
   1. これは非常に力を取るべきではありませんが、上部は必要なくなったので、それを削除するとき、それが起これば、それは大丈夫です。
4. ドライバーを使用して、現在露出した透明なプラスチック部分を無理に外そう。
   1. 繰り返しますが、これは非常に力を取るべきではありませんが、それは必要なされませんので、取り外しの際に壊れたときにそれは大丈夫です。
5. 貯水池から残りを空にします。
6. プリンタの連絡先やプリントヘッドを覆っているビニールの保護テープを取り外します。
7. 徹底的に水で貯水池をフラッシュします。
   1. チャネルを介して水をプッシュするピペットまたはシリンジを使用しています。
   2. 水の可能性が高い時に印字ヘッドから漏れます。このプロセスは、これは許容範囲内で、カートリッジの機能に損傷を与えることはありません。
8. 水がきれいに実行すると、カートリッジが乾燥することができます。

3。インクカートリッジのクリーニング

1. きれいな印刷環境を維持するために、インクカートリッジは使用前と使用後に洗浄する必要があります。
   1. これは、閉塞を引き起こす可能性がカートリッジ内に塩及びその他の生物材料の結晶化を回避に役立ちます。
2. 完全に水没脱イオン水を完全にビーカー内のカートリッジ、印刷前と後の15分間超音波洗浄します。
3. 超音波処理した後、水からカートリッジを取り出し、余分な水を振る。
4. より多くの無菌環境を作成するためのカートリッジに70％エタノールをスプレーします。
   1. エタノールはbioink印刷ソリューションを追加する前に乾燥していることを確認します。

4。細胞懸濁液を作る - "バイオインク "

1. 通路に準備ができるまで培養細胞。
   1. 10％ウシ胎児血清（FBS）とDulbeccos改変イーグル培地（DMEM）で約1.3×10 ⁴細胞/ cm ²でT-75フラスコにシード細胞：3T3線維芽細胞のために。 37℃インキュベーターで2日間培養細胞℃、5％CO _2。
2. リン酸緩衝液（PBS）中の濃度を50μg/ mlの蛍光G-アクチンのストック溶液を作成します。
3. 継代細胞。
   1. 3T3線維芽細胞の場合：フラスコから培地を取り除き、PBSで2回すすいでください。 5分のために5ミリリットル、0.25％トリプシン+ EDTAとインキュベートした細胞をカバーしています。
   2. 新鮮培地5mlを加え、5分間1000rpmで15 mlコニカル遠心チューブと遠心分離機に細胞懸濁液をピペットで。吸引は、媒体を過ごしました。
4. bioinkを作成するために蛍光灯G-アクチンのストック溶液をPBSで細胞を再懸濁します。
   1. Bioinkは10μg/ mlのG-アクチンの最終濃度と細胞の共同が必要です^{1×10 5}細胞/ mlのncentration。この濃度は、プリンタヘッドのドロップすると、目詰まりあたりのセルの量を制限するために最適化されています^。8
   2. bioink250μlの図2に示すパターンを持つ3つのカバースリップを出力することに注意してください。

5。 Bioprinting

1. の電源をオンにして、プリンタがウォームアップしましょう​​。
2. ステップ1.6で調製したステージの中央の上に置き、目的の印刷面（ここでは、我々は22ミリメートル×22 mmのカバーガラスを使用します）。
3. 印刷パターンファイルを作成します。
   1. 開いているMicrosoft Word（または他の描画ソフトウェア）、および所望のパターンを描画します。
   2. 既成のファイル内のセルの印刷の所望の印刷パターンを選択します。
4. 所望の細胞懸濁液を調製したカートリッジをロードします。
   1. よくカートリッジのコンパートメントの下部にある小さな円形のピペットの懸濁液。溶液を約100から120μlを使用しています。印刷された液滴サイズは130程度であるピコ^8。
5. HP DeskJet 500プリンタを使用してファイルを印刷します。
   1. 最良の結果を得るには、ワードプロセッシングプログラムで希望するコピーの量を変化させることにより、より小さなパターンを複数回（5）を印刷します。
6. プリンタが再びウォームアップされ、次にカートリッジは "レディポジション"に移動します。
7. カートリッジの準備が位置（わずかに下回ったインク滴の左側に、そこに留まる）に移動したとき、紙送り機構のワイヤ上でプルアップし、印刷は開始すべきである。
   1. 印刷の複数のコピーを、紙送り機構は、毎サイクル、またはページが印刷された後に解放する必要があります。カートリッジは、 "準備完了"の位置に戻りますと、紙送り機構のワイヤが再び提起されるべきである。
8. プリンタが（ 図2を参照）、ステップ5.2での印刷ステージの中央に置かカバースリップの上に印刷されます。

6。代表的な結果

標準的な既製のHP Deskjet 500の全体の変換プロセスの代表的な結果は、標準のHP 26シリーズカートリッジは、前に述べたように分析の多くの種類のセル·ソリューションの印刷機能を持つプリンタを作成します。変換後の完了したプリンタは、顕微鏡カバースリップの上に配置し、印刷段階で、 図3に示されています。プリンタは、次のような多くの分野での分析に有用であるが、これらに限定することはできません。単一細胞力学、組織工学、遺伝子導入、バイオセンサー微細、直接細胞療法^{1-10、16から22。}

この例では、HP DeskJet 500プリンタおよびHP 26シリーズのインクカートリッジはbioprintingために変更されました。 G-アクチンモノマー溶液中で線維芽細胞懸濁液から成るbioink、このプリンタのセットアップを使用して、細胞をガラス顕微鏡カバースリップ上に印刷された。 図1は、代表的な解像度を示しています組み込まれた蛍光アクチン単量体を示すプリント繊維芽細胞のults、。結果は、細胞がカスタマイズ可能なパターンに印刷された制御された無菌環境下で得られた。

この例で使用されるパターンは、Microsoft Word（ 図2）で作成されました。このパターンは、顕微鏡スライドの大半にわたって印刷ソリューションの連続線を作成しました。 図4は bioinkと細胞が相互に堆積された直線を示しています。それは細胞が中断されているbioinkソリューションは、無料の過剰蛍光アクチン単量体を含んでいるため、すぐに印刷した後、バックグラウンド蛍光の増加があることに留意すべきである。このバックグラウンド蛍光が大幅に基板から過剰のモノマーを洗浄細胞（ 図1）、上に増殖培地を添加した後に減少します。

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図1：3時間変更されたインクジェットプリンタを使用して印刷した後、3T3線維芽細胞の代表的な画像。細胞の内部には組み込まれ蛍光標識アクチン単量体を示しています。スケールバーは50μmを表す。

図2デザインbioinkを印刷するために使用されます。

図3。発泡スチロール段と変換後のプリンタ。中央のオレンジ色の線は、紙送りレバーセンサーをバイパスします。

図4。ローカライズされた印刷ゾーンで印刷3T3線維芽細胞の代表的なイメージ。顕微鏡画像は、20倍の倍率で印刷した後、5分を撮影。

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図5：3時間内在蛍光アクチン単量体と線維芽細胞を示す印刷後に撮影した蛍光画像（40×倍率）。スケールバーは50μmを表す。

図6 15分の印刷後に採取細胞の蛍光顕微鏡（20倍の倍率）。画像はG-アクチン（緑）、核（青）の両方を示しています。左から右へ：G-アクチンのAlexa Fluor 488、核DAPI、両方のオーバーレイである。

図7。3時間、印刷後にラインパターンの2つの線維芽細胞を示す蛍光顕微鏡。左の画像は、細胞内の蛍光標識アクチン単量体を示しています。右の画像は、表示する背景画像と蛍光チャンネルのオーバーレイですが、ここではそのスライド（左下隅）のいくつかの破片があるかもしれません、それは蛍光を発することはありません。サイズは一番右が蛍光標識モノマーで3時間インキュベートした非印刷のセルのコントロール群であることが示されていない場合のスケールバーは50μmを表す。このコントロールは、単量体は、細胞印刷で膜透過せずに細胞膜を貫通することができなかったことを示すことである。

ディスカッション

bioprintingための標準的なインクジェットデスクトッププリンタを変換するプロセスは、特に難しいことではありません。最も困難なステップは、使用するプリンタのブランドやモデルに依存している紙送り機構をバイパスする方法を決定しています。ここで説明したように、給紙センサは機械的である場合ただし、これは比較的簡単です。光フィードセンサー付きモデルの場合、他の技術は、紙を使用している思考にプリンタをだますために採用する必要があるかもしれません、それは顕微鏡スライド上に印刷されながら、たとえば、1つはプリンタによって紙の小片を実行することができます。紙送り機構をバイパスすると、別のプリンタモデルにこれらの手順を適用する際の最も困難なステップとなる可能性があります。

印刷用カバーガラスを保持するためのステージを構築するときに、それは適切なアライメントと高さを確保することが重要です。ステージでは、印刷領域の中央に配置されるカバースリップを許可する必要があります。また、PLすべきエースプリントカートリッジは、それを中断せずにスライドを渡すためのクリアランスを可能にするために十分な高さでカバースリップ。ステージの正確な高さは、プリンタのモデルによって異なります。

印刷された細胞は洗い流さされないことを確認するために、スライドは、追加の細胞増殖メディアが追加される前に細胞接着を可能にするために約30分間印字直後インキュベーターに入れた。細胞をPBSを大量に含む溶液に印刷されたため細胞が乾燥して生存していませんでした。細胞は、細胞内のタグ付きG-アクチンモノマー（ 図1、図5-7）の分布を可視化する蛍光顕微鏡を用いて撮像した。 3T3線維芽細胞で印刷する場合、 図5は、アクチンが蛍光を発するための細胞の多くの原因が、増加した明るさのラインを披露して、代表的な結果を示しています。細胞骨格に蛍光標識G-アクチンの取り込みです。細胞骨格のダイナミクスと細胞の力学の研究に有用である^。12-15この手法の制限は、約10nmより小さい直径を有する分子とタンパク質にのみ適用ということです。

その細胞は実際に変換されたプリンタによって処理されていたことを確認するには、DAPI（PBSで1:5000）は純粋なPBSの体積の半分の代わりにbioinkに追加されました。蛍光染色法DAPIは核内に位置するDNAのアミノ酸の豊富な部分に結合する。したがって、DAPIは、印刷された細胞の蛍光イメージング核の染色に有用である。 図6は、両方のオーバーレイイメージを使ってのAlexa Fluor®488（アクチン）およびDAPI（核）蛍光の両方を表示するセルの代表的なイメージを示しています。 図7は、またどのように示していますサンプルに寄託されている非生物学的物質が原因absencの蛍光を発するものではありませんが、細胞はG-アクチンモノマーが組み込まれている一度蛍光を発するG-アクチンモノマーのe。

bioprintingための重要な考慮事項の1つはbioinkに使用される水性媒体です。それは血清で標準的な細胞増殖培地を使用すると、矛盾する結果をもたらしたことが判明した。これが最も可能性の高い血清タンパク質によるプリントヘッドのノズルの目詰まりによるものです。 PBSの使用は、印刷パターンの一貫性を増加し、細胞の数は、堆積させた。 PBSを用いて1つの欠点は、細胞が長時間懸濁状態に残されるべきではないということです。しかし、これらの例では線維芽細胞は、細胞生存率の変化なしで少なくとも1時間のためにbioink条件を許容することができました。これは、サーマルインクジェット機構を介して印刷された細胞が高い生存率を有することが示されていることを報告し、いくつかの事前調査結果と一致している^2-8

この変更されたプリンタのセットアップは、セルの印刷以外の用途に使用することができます。コラーゲンやfibroneとして^16から22のマトリックスタンパク質、ctinはは、容易に細胞のパターニングのために役に立つことができ、この技術を持つ基板上に印刷することができます。例えば、コラーゲンタイプIはパターンがin vitroでの細胞培養研究のために使用することができます整列コラーゲン基質になりますラインに出力されます。成長因子を含むマトリックスタンパク質、他の分子に加えて^、17は確実に細胞研究のための基板上に局在化させることができるおよび潜在的な治療への応用^18。

上記の手順で説明したデザインの主要な制限は、このプリンタが複数の次元で印刷することができないということです。これは、足場印刷などのパターン化アプリケーションで使用するための可能性を制限します。 3Dプリントを可能にするために、専門の段階では、使用する必要があります。ステージでは、bioinkのレイヤーバイレイヤーの堆積のためのインクリメンタル高さ調整を持っている必要があります。

Bioprintingは、組織工学のための効率的かつ費用対効果の高い方法として約束を示している、遺伝子トランスフェクション、微細とマイクロアレイ製造^{1-12、16から22まで}このタイプのデバイスの将来のアプリケーションは、数多くのとおりです。足場の上に制御し、パターン化細胞の微小環境、細胞質に高分子の取り込み、細胞の膜の作成と自然にまたは効率的に発生しない構造。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
のHP DeskJet 500	ヒューレット·パッカード	C2106A	メーカーから中止した。改装されたDECのトレーダーを購入しました。
HP 26インクカートリッジ黒	ヒューレット·パッカード	51626A
ウサギ筋肉からアクチンのAlexa Fluor®488コンジュゲート、200μgの	インビトロジェン	A12373
リン酸緩衝生理食塩水（PBS）	MPのバイオメディカル	ICN1860454
Dulbeccos改変イーグル培地（DMEM）	サーモフィッシャーサイエンティフィック	SH3002201
ウシ胎児血清	Sigma-Aldrich社	F4135
アムホテリシンB	Sigma-Aldrich社	A2942	細胞培養培地で0.5％で使用
ペニシリン - ストレプトマイシン	Sigma-Aldrich社	P4333	細胞培養培地で0.5％で使用
一方向のフロークリーンベンチ	Envirco	VLF 797	プリンタは無菌維持するためのオプションの住宅