Создание Переходные поры клеточной мембраны с помощью стандартных струйных принтеров

Резюме

Описание методов, используемых для преобразования HP DeskJet 500 принтеров в bioprinter. Принтер способен обрабатывать живые клетки, что приводит к переходной поры в мембране. Эти поры могут быть использованы включить малые молекулы, в том числе люминесцентные G-актин, в печатных клеток.

Аннотация

Bioprinting имеет широкий спектр применения и значение, в том числе тканевой инженерии, прямое применение терапии клетки, и биосенсоров микротехнологий. ^1-10 Недавно тепловой струйной печати также используется для генной трансфекции. ^8,9 теплового процесса струйной печати было показано, что временно нарушить клеточные мембраны без ущерба для жизнеспособности клеток. Переходные поры в мембране может быть использован для внедрения молекул, которые иначе были бы слишком велики, чтобы пройти через мембрану, в цитоплазме клеток. ^8,9,11

Применение демонстрируется здесь является использование тепловой струйной печати для включения флуоресцентно меченных г-актина в клетках мономеров. Преимущество использования тепловой струйной печати для введения в клетки молекул является то, что метод является относительно доброкачественный к клеткам. ^{8, 12} Жизнеспособность клеток после печати было показано, что похожа на стандартную ячейку плаTing методов ^1,8. Кроме того, струйная печать может обрабатывать тысячи клеток в течение нескольких минут, что значительно быстрее, чем ручной микроинъекции. Поры созданы печати были показаны, чтобы закрыть в течение примерно двух часов. Однако, есть ограничение на размер пор создал (~ 10 нм) с этой техникой печати, которая ограничивает прием инъекционных клетки маленькие белки и / или частиц. ^8,9,11

Стандартный HP DeskJet 500 принтеров был изменен, чтобы обеспечить клетки печати. ^{​​3, 5, 8} крышку принтера была удалена и механизм подачи бумаги была обойдена с помощью механического рычага. Этапе был создан, чтобы обеспечить размещение микроскоп слайды и покровные непосредственно под печатающей головкой. Струйные картриджи были открыты, чернила был удален, и они были очищены до использования с ячейками. Печать шаблон был создан с помощью стандартного программного обеспечения рисунок, который затем управлять принтером с помощью простой команды печати. 3T3 фиброзновзрывы были выращены в слиянии, трипсином, а затем ресуспендировали в фосфатный буферный солевой раствор с растворимым флуоресцентно меченных г-актин мономеров. Клеточной суспензии пипеткой в ​​картридже и линии клеток были напечатаны на стекле микроскопа скользит крышкой. Живые клетки были обследованы с помощью флуоресцентной микроскопии и актин было найдено по всей цитоплазме. Включение флуоресцентных актина в клетке обеспечивает съемку короткого времени цитоскелета динамики и полезной для широкого круга применений. ^13-15

протокол

1. Преобразование HP DeskJet 500

Следует отметить, что этот метод должен работать со многими коммерчески струйных принтеров. Тем не менее, старые принтеры, как правило, работают лучше, поскольку они используют картриджи с большим диаметром сопла, которые не забивают, как легко. Кроме того, старые принтеры, как правило, используют механические датчики подачи бумаги, которые легко обойти. Принтеры с оптическими датчиками можно обмануть, но с помощью небольшой полоской бумаги на дальнем краю принтер во время каждого цикла, но это немного сложнее, чем механическая система "обмануть". В настоящее время коммерчески доступных принтеров, которые работают лучше иметь низкое разрешение (DPI).

Высшее разрешение принтера, как правило, забивают более легко. Решение HP Deskjet 500, 300 DPI. Есть много коммерчески доступных принтеров (HP Deskjet серии и др.), которые имеют разрешение 600 точек на дюйм. Этот тип принтера могут быть использованы только с небольшим увеличением в соплозасорение вопросы, которые могут быть решены использованием тщательной очистки (раздел 3).

1. Снимите верхнюю пластмассовом корпусе принтера, разбудив несколько пластиковых зажимов снизу базе принтера и медленно снять вершину.
2. Отвинтите кнопку / подсветка дисплея панели из верхней части принтера, в результате чего она подключена к материнской плате принтера.
3. Очистите внутренние детали принтера, особенно в тех областях, где картридж лежит и где происходит печать.
4. Найдите кабели подачи питания на механизмы подачи бумаги и отключите его от материнской платы.
   1. В HP DeskJet 500, они находятся как раз под лоток для бумаги на левой передней.
5. Найдите механизм обнаружения бумаги. Обход механизма, с помощью проставления строку или проволочную петлю, чтобы служить в качестве учебного пособия ручку тянуть.
   1. В HP DeskJet 500, механизм бумага обнаружения серый пластиковый рычаг, приведенной выше, и за печать / механизм подачи бумаги.
6. Создать сцене перед механизм подачи бумаги (где документ будет питаться от и хранение) для того, чтобы принести желаемого слайды печати на уровне чуть ниже головы картриджа.
   1. Для наших экспериментов, держатель пена доставку труб на 15 мл центрифугу было использовано несколько слайдов микроскопом выявляется на место в полиграфической области довести конечный уровень слайды на нужную высоту.
7. Для поддержания асептических условиях, принтер может быть помещен в стандартный шкаф биологической или настольный ламинарного потока капотом.
8. Важно отметить, что изменения продаже струйных принтеров, как правило, аннулировать гарантию производителя принтера.

2. Преобразование месте HP картриджей (HP 26 Черный картридж)

1. Извлеките картридж из упаковки, оставляя защитную пленку, закрывающую принтер контактов и печатающую головку на некоторое время.
2. Стабилизация телаиз картриджа (черный часть) либо с помощью зажима или тисков (просто крепко вцепившись в патрон вручную обычно работает хорошо), оставляя зеленый топ от любых препятствий.
3. Используя плоскогубцы или разводной ключ, возьмите зеленый верхней части картриджа и крутят туда и обратно несколько раз, пока он вырывается на свободу.
   1. Это не должно занять много сил, но и верхнюю больше не нужен, так что это нормально, если он нарушает, когда его удаления.
4. Используя отвертку, отделите кусок прозрачного пластика в настоящее время подвергается.
   1. Опять же, это не должно занять много сил, но это не понадобится, так что это нормально, если он ломает во время удаления.
5. Очистите все оставшиеся из резервуара.
6. Снимите пластиковую защитную пленку, закрывающую принтер контакты и печатающая головка.
7. Тщательно промойте резервуаров с водой.
   1. С помощью пипетки или шприца нажать воды по каналам.
   2. Вода, скорее всего, утечка из печатающей головки во времяэтот процесс, это приемлемо, и не наносить ущерб функциональности картриджа.
8. Когда вода не станет чистой, позволяют картридж для просушки.

3. Очистка картриджа

1. В целях сохранения чистоты окружающей среды печати, картриджи должны быть очищены до и после использования.
   1. Это также помогает избежать при кристаллизации солей и других биологических материалов в картридж, который может привести к засорению.
2. Полностью погрузиться картридж в стакан полный деионизированной воды, и разрушать ультразвуком в течение 15 минут до и после печати.
3. После обработки ультразвуком, удалите картридж из воды, и вытряхнуть лишнюю воду.
4. Спрей 70% этанола в картридж, чтобы создать более асептических условиях.
   1. Убедитесь, что этиловый спирт высохнет, прежде чем добавлять раствор bioink печати.

4. Создание клеточной суспензии - "Биочернил "

1. Культуры клеток до момента прохода.
   1. Для 3T3 фибробласты: Семенной клеток на Т-75 колб примерно 1.3x10 ⁴ клеток / см ² в Dulbeccos изменения орлы среднего (DMEM) с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS). Культуры клеток в течение двух дней в инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% CO _2.
2. Сделать люминесцентные г-актин маточного раствора в концентрации 50 мкг / мл в фосфатный буферный раствор (PBS).
3. Прохождение клеток.
   1. Для 3T3 фибробласты: удаление информации из колбы и промыть два раза PBS. Крышка ячейки с 5 мл 0,25% трипсина + ЭДТА и инкубировать 5 мин.
   2. Добавьте 5 мл свежей среды и пипетировать клеточной суспензии в 15 мл коническую трубку центрифуг и центрифуг на 1000 оборотов в минуту в течение 5 мин. Аспирата провел среды.
4. Ресуспендируют клеток в PBS с люминесцентными г-актин фондовый решение для создания bioink.
   1. Bioink должна иметь конечной концентрации г-актин 10 мкг / мл и ячейки сотрудничестваncentration 1х10 ^{5 клеток} / мл. Эта концентрация была оптимизирована для ограничения количества клеток на падение и засорение печатающей головки ^8.
   2. Обратите внимание, что 250 мкл bioink печатает три крышки скользит с рисунком показано на рисунке 2.

5. Bioprinting

1. Включение и пусть принтер согреться.
2. Место желаемого печати поверхности (здесь мы используем 22 мм х 22 мм покровные) в центре сцены, подготовленный в шаге 1.6.
3. Создайте файл шаблона печати.
   1. Откройте Microsoft Word (или любого другого программного обеспечения рисунок), и нарисуйте желаемый узор.
   2. Выберите желаемую модель печати для мобильных печать готовых файлов.
4. Загрузите подготовленный картридж с желаемой клеточной суспензии.
   1. Внесите суспензии в маленькие круглые также в нижней части отсека картриджа. Используйте примерно 100-120 мкл. Печатный размер капли составляет около 130пиколитра ^8.
5. Распечатать файл с HP DeskJet 500 принтеров.
   1. Для достижения наилучших результатов печати меньших моделей несколько раз (5), путем изменения количества копий желаемого в программе обработки текстов.
6. Принтер разогреть снова, то картридж будет двигаться к "готовым позиции".
7. Когда картридж перемещается в позицию готовности (чуть слева от чернил капельного значительно ниже и остается там), подтяните на механизм подачи проволоки бумагу и печать должны начаться.
   1. За несколько копий печати, механизм подачи бумаги должны быть выпущены после каждого цикла или страница. Картридж будет вернуться к "готовым" позиции, и механизм подачи бумаги, проволоки должен быть поднят снова.
8. Принтер будет печатать на покровное размещены в центре печати этап в шаге 5.2 (см. Рисунок 2).

6. Представитель результаты

Представитель результаты всего процесса преобразования стандартными, готовых HP Deskjet 500, стандартные картриджи HP 26 серии будет создан принтер с возможностью печати клетки решения для многих видов анализа, как описано выше. Завершено принтер после преобразования показан на рисунке 3, с печатью этап разместить скольжения микроскопа крышкой на. Принтер может быть полезно при анализе во многих областях, включая, но не ограничиваясь ими: один механике клетки, тканевой инженерии, генной трансфекции, биосенсор micropatterning и прямой терапии клетки ^{1-10, 16-22.}

В этом примере HP DeskJet 500 принтеров и картриджей HP 26 серии чернила были модифицированы для bioprinting. С помощью этой установки принтера с bioink, состоящий из подвески фибробластов в г-актин мономера решение, клетки были напечатаны на покровные стекла микроскопа. На рисунке 1 показано представитель разрешением ULTS печатных фибробластов, которые показывают, включены флуоресцентных мономеров актина. Результаты были получены в контролируемых асептических условиях, в которых клетки были напечатаны в настраиваемых шаблонов.

Шаблон, используемый в данном примере был создан в Microsoft Word (рис. 2). Эта модель создана непрерывная линия решение для печати по большинству предметное стекло микроскопа. На рисунке 4 показана прямая линия, в которой bioink и клетках, взаимно хранение. Следует отметить, что сразу после печати, есть увеличение фоновой флуоресценции, потому что решение bioink, в котором клетки приостановлено, содержит избыток свободных флуоресцентных мономеров актина. На этом фоне флуоресценция значительно уменьшается после добавления питательных сред на клетки (рис. 1), которая омывает избыток мономера от подложки.

ad/3681/3681fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Представитель изображения 3T3 фибробласты через 3 часа после печати с использованием модифицированного струйного принтера. Внутри клетки показывают, включены флуоресцентно помеченный мономеров актина. Масштаб барах составляют 50 мкм.

Рисунок 2. Дизайн используется для печати bioink.

Рисунок 3. Принтер после перехода с этапа пенополистирола. Оранжевый провод в середине обходит рычаг датчика подачи бумаги.

Рисунок 4. Представитель образ 3T3 фибробласты напечатан в локализованной зоне печати. Микроскопии изображение, снятое через 5 минут после печати на 20x увеличением.

/ Files/ftp_upload/3681/3681fig5.jpg "/>
Рисунок 5. Флуоресценции изображение (40-кратном увеличении), взятых через 3 часа после печати показывает фибробластов с интернализованной флуоресцентных мономеров актина. Шкала бар составляет 50 мкм.

Рисунок 6. Флуоресцентная микроскопия (20x увеличение) клетки потребовалось 15 минут после печати. На рисунке показано, как г-актин (зеленый) и ядра (синий). Слева направо: г-актина с Alexa Fluor 488, ядро ​​с DAPI, и наложение обоих.

Рисунок 7. Флуоресцентная микроскопия с изображением двух фибробластов в линию картины через 3 часа после печати. Изображение слева показывает флуоресцентно меченых мономеров актина в клетках. Изображение справа является наложение флуоресцентного канала с фоновым изображением, чтобы показать, что хотятам могут быть некоторые обломки на слайде (в левом нижнем углу), она не светиться. Масштаб барах составляют 50 мкм, если размер не указан в правом является управление группой непечатные клетки инкубировали в течение 3 часов с флуоресцентной помеченный мономеров. Этот элемент управления, чтобы показать, что мономеры, не могли проникнуть в мембрану клетки без мембран пермеабилизации по мобильному печати.

Обсуждение

Процесс преобразования стандартного настольного принтера для струйной bioprinting не особенно сложно. Самым сложным шагом является определение, как обойти механизм подачи бумаги, который зависит от марки и модели используемого принтера. Тем не менее, это относительно просто, когда датчик подачи бумаги является механическим, как описано здесь. Для моделей с оптическими датчиками корма, другие методы, возможно, должны быть использованы, чтобы обмануть принтер, думая, что используется бумага, например, можно провести небольшой кусочек бумаги через принтер, пока он печатает на предметное стекло микроскопа. Обход механизма подачи бумаги, вероятно, будет самым сложным шагом в применении этих процедур для различных моделей принтеров.

При построении этапе провести покровные для печати, важно обеспечить правильное положение и высоту. Этап должен предусматривать покровное быть помещены в середине области печати. Кроме того, он должен плТуз покровное на должном высоте, чтобы зазор для картриджей перейти слайд, не нарушая его. Точная высота этапе будет зависеть от модели принтера.

Для того, чтобы печатные клетки не переплетаются, слайды были помещены в инкубатор сразу после печати примерно на 30 минут, чтобы для сотовых вложения дополнительных средств массовой информации, прежде чем рост клеток был добавлен. Поскольку клетки были напечатаны в решение, которое включает в себя большое количество PBS клетки не высыхают и остаются жизнеспособными. Клетки были обследованы с помощью флуоресцентной микроскопии для визуализации распределения помеченных г-актин мономеров внутри клетки (рис. 1, 5-7). При печати с 3T3 фибробласты, 5 показан репрезентативный результат, с актином вызывает большую часть клетки светятся, но демонстрации линий повышенной яркости. Включение флуоресцентно отмеченных г-актина в цитоскелета являетсяполезны для изучения динамики цитоскелета и клеточных механике. ^12-15 ограничением этого метода является то, что она применима только для молекул и белков, которые имеют диаметр меньше, чем примерно 10 нм.

Для того, чтобы клетки были фактически обрабатывается преобразованы принтер, DAPI (1:5000 в PBS) был добавлен в bioink вместо половины объема чистого PBS. Флуоресцентные пятна DAPI связывается с аминокислотой богаты часть ДНК находится в ядре. Поэтому DAPI является полезным пятно в флуоресцентной визуализации ядер печатных элементов. На рисунке 6 показан представитель образ ячейки отображается как Alexa Fluor 488 (актин) и DAPI (ядро) флуоресценции с наложением изображения и другое. На рисунке 7 также показывает, как клетки высветится раз г-актин мономеров были включены в то время как не-биологический материал, который был сдан на хранение в пример не будет светиться из-за absencе г-актин мономеров.

Одним из важных моментов для bioprinting является водных сред, используемых для bioink. Было установлено, что с использованием стандартных средств массовой информации рост клеток с сывороткой дали противоречивые результаты. Это, скорее всего из-за засорения печатающей головки на сывороточных белков. Использование ФСБ увеличили последовательность печатных шаблонов, а число клеток на хранение. Одним из недостатков использования PBS том, что клетки не должны оставаться в суспензии в течение длительных периодов времени. Тем не менее, фибробласты, в этих примерах были в состоянии терпеть bioink условиях, по крайней мере час без изменения жизнеспособности клеток. Это согласуется с нескольких до выводов, которые сообщают, что клетки с помощью печатного механизма тепловой струйной было показано, что высокий уровень жизнеспособности. ^2-8

Это изменение настройки принтера можно использовать для приложений, отличных от клетки печати. ^​​16-22 Матрица белков, таких как коллаген или fibroneХТИН, могут быть легко распечатаны на подложки с этой техникой, которая может быть полезна для сотовых кучность стрельбы. Так, например, коллагена типа я напечатал в соответствие модели приведет соответствие коллагена субстраты, которые можно использовать для экстракорпорального исследования клеточных культур. ¹⁷ В дополнение к матрице белков, другие молекулы, в том числе факторов роста, могут быть надежно локализованы на подложки для клеточных исследований и потенциального терапевтического применения ^18.

Основным недостатком дизайна описанных выше шагов, что этот принтер не способен печатать на более чем одном измерении. Это ограничивает потенциал для использования в узорной приложений, таких как печать эшафот. Для обеспечения 3D печать, специализированные этапе необходимо использовать. Этап должен иметь дополнительные корректировки высоты слой за слоем отложение bioink.

Bioprinting показала свою перспективность в качестве эффективного и экономически эффективным методом тканевой инженерии, Генной трансфекции micropatterning и изготовление микрочипов ^{1-12, 16-22} будущих приложений этого типа устройств являются многочисленными, в том числе:. Создание под контролем и узорные сотовой микросреды, включение макромолекул в цитоплазме клетки, а также осаждение клеток на строительные леса и структур, которые не встречаются в природе и эффективно.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
HP DeskJet 500	Hewlett-Packard	C2106A	Снято от производителя. Приобретенные отремонтированы декабря Trader.
HP 26 Картридж с черными чернилами	Hewlett-Packard	51626A
Актина из мышц кролика, Alexa Fluor 488 сопряжены, 200 мкг	Invitrogen	A12373
Фосфатного буфера (PBS)	MP Biomedicals	ICN1860454
Dulbeccos изменения орлы среднего (DMEM)	Thermo Scientific	SH3002201
Эмбриональной телячьей сыворотки	Sigma-Aldrich	F4135
Амфотерицин	Sigma-Aldrich	A2942	Используется на 0,5% в средствах массовой информации культуре клеток
Пенициллин, стрептомицин	Sigma-Aldrich	P4333	Используется на 0,5% в средствах массовой информации культуре клеток
Однонаправленный поток чистой поверхности	Envirco	VLF 797	Дополнительный корпус для поддержания принтер асептической