真菌の植民地、減数、およびカーネルのバイオアッセイを用いたマイコトキシンの生産の定量化

要約

種子感染菌による穀物の荒廃は、より良い植物 - 病原体相互作用を理解するための多数の研究努力を求めている。実験室の設定で種子菌の相互作用を研究するために、我々は真菌の繁殖、バイオマス、カーネルのバイオアッセイを用いたマイコトキシン汚染の定量化のための堅牢な方法を開発した。

要約

種子感染菌による穀物の腐敗は、人間と動物の健康に深刻なリスクに言及しないように、穀物生産の世界的な最大の経済課題の一つを引き起こします。穀物生産のうち、トウモロコシは穀物の整合性とマイコトキシン汚染種子における病原体によって誘発される損失のため、おそらく最も影響を受けた作物である。トウモロコシ生産者と食品および飼料のプロセッサに2つの最も普及していると問題のマイコトキシンは、それぞれアスペルギルスフラバスとフザリウムverticillioidesによって生成されたアフラトキシンやフモニシン、である。

分子植物-病原体相互作用における最近の研究では、真菌感染症とマイコトキシン汚染^1,2,3,4,5,6に対する植物の応答に関連付けられた特定のメカニズムを理解する上で約束を示している。多くのラボでは、植物 - 病原体相互作用を研究するためにカーネルのアッセイを使用しているので、異なる生物学的パラメータを定量化するための標準的な方法の必要性がそう、そこです。別の研究室からの結果はクロスと解釈することができます。種子の定量分析するための堅牢で再現性のある手段のために、私たちは真菌の増殖、バイオマス、マイコトキシン汚染を定量化するためにラボでのカーネル·アッセイおよび後続のメソッドを開発しました。四滅菌トウモロコシのカーネルは、菌の懸濁液（10 ^6）をガラスバイアルに接種し、所定の期間インキュベートする。サンプルバイアルは、その後、HPLCにより血球、エルゴステロールベースの​​高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）によるバイオマスの分析、AflaTest蛍光法を用いてアフラトキシンの定量化、およびフモニシンの定量化による分生子の列挙のために選択されています。

プロトコル

1。トウモロコシカーネルのバイオアッセイ

1. 二週間前までに、文化28でポテトデキストロース寒天（PDA）上での真菌病原体℃、
2. 彼らはバイオアッセイバイアルの底レベル、50mlファルコンチューブ内の場所を築くため、好ましくは、平坦化され、同様の大きさと形でカーネルを選択します。選択したカーネルは、類似した種子の年齢及び代謝物の組成を保証するために、同じ環境で同時に製造されている必要があります。
3. 表面は70％エタノールで5分間、滅菌水で1分間、6％次亜塩素酸ナトリウムで10分間室温でチューブを振とうしてカーネルを滅菌する。継続的な振とうしながら滅菌水で、毎回5分間、3回すすいでください。オートクレーブタオルで乾かしカーネル。
4. アスペルギルスフラバスの感染を容易にするために、0.5cmの深さに18 G針で胚側の ​​小さな傷を作成します。しかし、我々の経験では大きな傷がフザリウムverticillioides感染に必要とされる。番目のerefore、0.5ミリメートルの深さで胚側にカットするためにかみそりの刃を使用しています。
5. 胞子を解放し、オートクレーブチーズの少なくとも4つの層を介してフィルタリング重力によって菌糸を除去するオートクレーブ0.01パーセントのTween-20溶液の約5 mlの培養プレートを削って接種懸濁液を準備します。血球と胞子濃度を計算し、Aの10 ⁶胞子/ mlに調整フラバスまたは F verticillioides。病原体またはホストの他の種を使用している場合は、適切な感染接種の濃度を評価することは重要である。
6. 紙タオルや滅菌水100 mlの5枚が並んでプラスチック容器（29.2センチ×18.7センチメートルX 8.3センチメートル）内の湿度チャンバーを作成します。チャンバーは、水または気密と追加の水ではありませんペーパータオルの潤いを保つために、実験を通して追加する必要があります。
7. オートクレーブ20mlのガラス製シンチレーションバイアルに4カーネルを配置し、その質量を記録します。 、200μlの胞子懸濁液を接種するキャップ、懸濁液と均一にコートカーネルの渦。自由に湿度チャンバーへの空気の交換と場所を可能にするためにキャップを緩めます。

注：これらのメソッドに記載されている以外の種子や真菌の場合、必要な接種量が異なる場合があり、実験的に導出する必要があります。

8. °Cで7日間で28または所望されるまで12-h-light/12-h-dark日長下のカーネルをインキュベートします。

2。分生子の列挙

1. 感染期間の後、1分間徹底的に感染したカーネルと渦を含むシンチレーションバイアルにオートクレーブ0.01パーセントのTween-20の5ミリリットルを追加します。
2. ワイドボアピペットチップを使用して、すぐに0.01パーセントのTween-20（または感染症に応じて、必要に応じて希釈する）の1.8 mlを含む2.0ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに胞子懸濁液の2つの独立した200μlのアリコートを転送することにより希釈する。
3. 血球⁴に二回、各200μlのアリコートを列挙すると治療の間の分生子のレベルを比較します。

3。アフラトキシンの定量

1. 80％メタノールと0.05グラムのNaCl、1分間高速でカバーとブレンド20mlで1サンプルから50ミリリットルブレンダーカップにカーネルを追加します。
2. きれいな回収容器を介して溝濾紙を配置し、フィルタに抽出液を注ぐ。
3. きれいな容器にろ液10 mlを20 mlの蒸留H ₂ Oを追加して、よく混ぜる。
4. クリーンカップに1.5μmのガラスマイクロファイバーフィルタを通してフィルタサンプル。
5. アフラトキシン検査の列にフィルタ抽出液を1 mlを適用すると、圧縮空気を使用して、空になるまで1〜2滴/秒の速度でカラムを通して濾過し抽出物を強制します。
6. 蒸留H ₂ O 1 mlで2回カラムを洗浄し、ドロップ/秒の空気が伝わってくるまでは1-2にカラムを通過します。
7. ドロップ/ガラスキュベットに採取二流1-2に1ミリリットル100％HPLCグレードのメタノールで溶出するカラム。
8. 加える1溶出液にアフラトキシン試験Developerのmlとよく混ぜる。場所は、キャリブレーション蛍光光度計キュベットに、60秒で読む。

注：Aflatest FGISプロトコルを使用する場合、蛍光光度計からの測定は100ミリリットルで抽出したサンプルの最初の50グラムに基づいて計算されます。あなたは水試料の希釈を考慮した場合は、1ミリリットルは、サンプルの0.166グラムを表す列に適用されます。したがって、プロトコルを変更するとき、あなたのアカウントにサンプルサイズの違いや初期抽出液を取る必要があります。たとえば、カーネルの2グラムを20mlの80％メタノールで抽出されています。これは0.1グラム/ mlである。このサンプルの1 mlを2 mlの水と混合されたときに、液体のサンプルの割合は、現在0.033グラム/ mlである。このサンプルでは100 ppbの蛍光光度計の読みを与える場合は、実際の濃度は、ppbの=（0.166グラムXは100 ppb）/ 0.1グラム）、または166 ppbである0.166のサンプルの割合に基づいています。別のアフラトキシン、定量のためにカチオン方法は、参考文献7を参照してください。

4。フモニシンB1（FB1）の分析

1. 菌はトウモロコシの穀粒の上に成長されている場合、撹拌せずに室温でアセトニトリル/水（50/50、v / v）を10 mlの一晩サンプルを抽出します。その後、脱イオン水（6 ml）で抽出（2 ml）を混合し、C-18固相抽出に直接（8 ml）にこのミックスを適用します。
2. 水2ml、続いてアセトニトリル2mlで洗浄し、サンプル、前提条件C-18固相抽出カラムをロードする前に。
3. サンプルをロードした後、カラムをアセトニトリル/水2ミリリットル（15/85、v / v）を、続いて水2mlで洗浄する。 HPLC分析（FB1を含む）のサンプルは、アセトニトリル/水2ml（70/30、v / v）で溶出させる。
4. 0.1ミリリットルホウ酸緩衝液（0.05Mホウacid/0.05 Mホウ酸ナトリウム[50/50、V / V]は、pH 8.5）および0.1を含むバイアルにカラム溶出液の0.1 mlを転送することにより、O-フタルアルデヒド（OPA）でFB1を誘導体化ミリリットルOPA（アセトンで0.1 mg / mlの0.5％itrile - メルカプトエタノール）。
5. acetonitrile/0.01 Mホウ酸（40/60、v / v）を0.5 mlを加えることによって10分後に反応を停止します。
6. 分析ZORBAX ODSカラム（4.6 150ミリメートル）と、可変波長Shimatzu RF-10Axl蛍光検出器（励起335 nmで/発光440 nm）を装備島津HPLC LC-20ATシステム上でFB1を分析します。
7. 線形グラデーションを使用し（溶媒：アセトニトリルMリン酸ナトリウム（40/60）は、pH 3.3;溶媒B：アセトニトリル/ 0.1 Mリン酸ナトリウム（60/40）は、pH 3.3）されており、勾配プログラムは次のとおりです。 100パーセントで5分間、10分間、100％Bの100％Bへ。
8. HPLCでFB1の基準を分析し、ピーク面積の測定は、標準曲線を生成するために使用されています。その後、FB1標準曲線とピーク面積を比較することによって、サンプル中のFB1のレベルを定量化する。

5。エルゴステロールの分析

1. 文化7〜14日のためにトウモロコシの穀粒に菌。
2. メタ：インキュベーション期間の後、クロロホルム10mlを加え各バイアルにanol（2:1、v / v）で。一度追加された、よくサンプルを振ると、その後24時間室温で暗所でバイアルをインキュベートします。
3. 24時間後、サンプルを遠心し、上清を収集し、0.45 umのナイロン膜を通してそれをフィルタリングします。
4. 4.6 U ODS-C18カラム（200Å、250±4.6 mm）と282 nmでモニターするように設定島津SPD-20A UV / VIS検出器を備えた島津HPLC LC-20ATシステムに直接サンプルを注入します。
5. 移動相として1.5 mL / minの流量でメタノール（100％）を使用します。 HPLCグレードのエルゴステロールから生成された標準曲線と試料のピーク面積を比較することにより、サンプル中のエルゴステロールの定量化を決定します。

6。代表的な結果

二から三日間の湿度チャンバー内接種およびインキュベーションの後、真菌の増殖は、カーネルに表示を開始する必要があります。七日間の後処理、処理された植物で植物の成長がはっきりと見えるはずです、薬用電子モックコントロール（ 図1B、上）感染していないことがあります。長い潜伏期間は、より豊富な栄養成長（ 図1B、下）を助長しています。条件の下で、本明細書に記載します（ 図2G）、A. フラバス 、野生型NRRLそれぞれ8、6、8日、植民地化で、アフラトキシンの蓄積、及び分生子の生産の3357表示された最大値（ 図2、AC）。しかし、マイコトキシン汚染と分生子はエルゴステロールの単位当たりで比較した場合には、最大レベルは（ 図2、DE）はそれぞれ、4および6日目に観察された。 図2Fは、これらの菌のバイオマスに依存した最大値の観測をまとめたものです。興味深いことに、4-6日後接種の間に、カーネルは時間経過（ 図2H、下）上のサンプルからのトータルRNAで見られるように、核酸の分解を受けています。

我々自身を含むいくつかの研究は、examinを持っているED F. verticilliodiesは、トウモロコシのカーネル^{2,8,9,10,11,12}に感染して正常時ポイント観測用として7月13日日使用されます。メソッドを使用して、ここに3,500-8,000 ng / gでカーネル^4,13と5,000-10,000 ng / gのカーネル^14,13からエルゴステロールレベルの範囲からフモニシンレベルの範囲を説明しました。 図3は、フモニシン（上）とエルゴステロール（下の代表的なピークを示しています。 ）HPLCクロマトグラムから。エルゴステロールの測定は、吸光度スペクトル^15を介して行うことができます。

図1：真菌バイオマス、減数し、マイコトキシンの生産とカーネルのバイオアッセイから、栄養成長のための代表的な結果の定量化のためのフローチャート。トウモロコシのカーネルで菌類の病原性を評価するために使用する基本的な生物学的パラメータの定量化のために説明した方法を概説A）フローチャート。 B）代表者カーネルのバイオアッセイの結果。トップ、A.フラバス （NRRL3357）B73遺伝的背景のトウモロコシのカーネルでは栄養成長。種子は7日後に接種を受けた10 ⁶胞子/ mLと写真の200μlで接種した。底部、F. B73背景13日感染後に接種したカーネルをverticillioides。カーネルは10 ⁶胞子/ mlを200μlを接種した。

図2：アスペルギルスフラバスカーネルバイオアッセイ時間コース。 B73カーネルは10 ⁶胞子/ ml アスペルギルスフラバス分生子懸濁液200μlを接種し、2〜8日（G）インキュベートした。 （;平均値±SE、N = 3-4）のすべての値は、4カーネルの乾燥重量の平均値から決定した。 A）植民地（エルゴステロールに基づいて）、（B）アフラトキシン、および（C）分生子は、上記の方法を用いて定量した。 E）アフラトキシン及び（F）分生子が表示されます。hのエルゴステロールを介して測定された菌類のバイオマスの関数として。 F）エルゴステロール、アフラトキシンの蓄積、および真菌バイオマスの関数としての分生子の最大値 - それぞれの量の最大値は100％に設定されて観察した。 （H）時間コースからの全RNAのレーン当たり1μgの。

図3。フモニシンB1（上）とフザリウムverticillioides（M3125）に感染したカーネルから分離されたエルゴステロール（下）の代表的な高性能液体クロマトグラフィ（HPLC）のクロマトグラム。

ディスカッション

ここで説明する方法は広範囲にテストされ、真菌のコロニー形成、減数し、マイコトキシンの生産のための定量的な結果の生成に堅牢であることが証明されています。また、これらのメソッドはmycotoxigenic菌類（例えば、ピーナッツ、小麦、綿花、ピスタチオなど）による汚染の影響を受けやすい他の植物種の種子に適用する必要があります。有能な植物 - 病原体相互作用分析のために、そ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ＃
ポテトデキストロース寒天	フィッシャーScientifc	S71659A
Tween-20を	フィッシャーScientifc	BP337-100
プラスチック製の培養容器	Sterilite	1713LAB06
ブレンダー	Vicam	20200
24センチメートル溝付き濾紙	Vicam	31240
1.5μmのガラスマイクロファイバー	Vicam	31955
アフラトキシン試験カラム	Vicam	G1024
Afrlaテスト開発者	Vicam	32010
メタノール	Vicam	35016
アセトニトリル	フィッシャーScientifc	AC14952-0025
エタノール	フィッシャー科学者TIFC	AC39769-0025
C-18固相抽出カラム（準備9月​​SPE C18カラム）	フィッシャーScientifc	60108-304
O-フタルアルデヒド（OPA）	シグマケミカル社	79760〜5グラム
ホウ酸	フィッシャーScientifc	BP168-500
ホウ酸ナトリウム	フィッシャーScientifc	RDCS0330500
メルカプトエタノール	フィッシャーScientifc	45-000-231
島津HPLC LC-20AT（ポンプ）	島津科学機器株式会社	LC-20AT
ZORBAX ODSカラム（4.6x150mm）	アジレント·テクノロジー	443905-902
Shimatzu RF-10Axl蛍光検出器	島津科学機器株式会社	RF-10AXL
リン酸ナトリウム	フィッシャーScientifc	AC38987-0010
FB1の基準	シグマケミカル社	F1147-1mgの
クロロホルム	VWR	MK444410
0.45 umのナイロンメンブレン（HPLC）で13​​ mmのシリンジフィルター	ポールライフサイエンス	4426
エルゴステロール	Sigma-Aldrich社	45480-50G-F
シンチレーションバイアル	VWR	66021-602
塩化ナトリウム	Vicam	G1124