の飼育とインジェクション<em&gt;たばこスズメガ</em細菌毒性を評価するための&gt;幼虫

要約

ここで説明する方法は、血体腔に昆虫病原細菌の直接注入を利用たばこスズメガ昆虫の幼虫。 M sexta市販されており、よく研究された昆虫です。したがって、この方法は、1つまたは両方のパートナーの視点からホスト細菌の相互作用を分析する簡単な方法を表しています。

要約

一般的にタバコイモムシとして知られているたばこスズメガは 、タバコやトマトなど、ナス科の植物を食べ、重要な農業害虫と見なされます。 Mの感受性昆虫病原性細菌種の多様^1-5、ならびに昆虫の免疫系^6から8に関して入手可能な情報の富、および保留中のゲノム配列^9〜sextaの幼虫は宿主-微生物相互作用を研究に使用するための優れたモデル生物作る発病時。さらに、M. sextaの幼虫は他の感受性の昆虫種に実験室での相対的に操作し、維持するために比較的大きいと簡単です。それらの大きなサイズも、感染に対する宿主応答の解析のための効率的な組織/体液抽出が容易になります。

ここで紹介する方法は、Mの血体腔内細菌の直接注入（血液空洞）を記述するsextaの幼虫。このアプローチ単に注射後に昆虫の死までの時間を監視することによって、様々な細菌種、株、または変異体の毒性の特性を分析し、比較するために使用できます。このメソッドは、通常、昆虫へのエントリを取得するための手段として、線虫ベクトルと関連付けるXenorhabdusとPhotorhabdus種の病原性を研究するために開発されました。昆虫病原性線虫は、通常、天然の消化器や呼吸器の開口部を介して幼虫に感染し、昆虫の体液（血液）、その後すぐに¹⁰にその共生細菌の内容物を放出する。ここで説明した注入法は、このように昆虫に細菌や線虫の影響を脱共役、線虫のベクトルの必要を回避します。この方法は、ニッキング¹¹と経口毒性アッセイ^12を含むentomopathogenesisを分析するための他の既存の方法を使用しては不可能である種菌内感染性物質の正確な列挙型（細胞やタンパク質）を可能にここで説明したように直接注入法の有用性は、昆虫死亡率を監視することにより、細菌の病原性を解析することである。しかし、この方法は簡単にMに感染の影響を研究に使用するために拡張することができますsexta免疫システム。昆虫は体液性および細胞性応答の両方を介して感染に応答します。体液性応答は細菌関連パターンの認識や各種抗菌ペプチドのその後の生産^7を含み、これらのペプチドをコードする遺伝子の発現をRNA抽出と定量PCR ^13を介して直接感染後に監視することができます。感染に対する細胞応答は根粒形成、カプセル化、および血球⁶による感染性病原体の食作用を伴う13,14により可視化することができます。

プロトコル

1。虫卵の殺菌と飼育

1. 900-1,000 mlのH _{2 O}で提供寒天の最初のオートクレーブ15グラムで食事を準備します直後によく研究室ブレンダーで166グラムの小麦胚芽食とブレンドしたオートクレーブ、ミックス。 4でアルミ箔にダイエットを転送し、冷却するための皿（または皿）に注ぎ、しっかりとラップし、℃で保存
2. 到着時には、Mを殺菌する時々かき混ぜながら90ミリメートルろ紙ガラスフィルターホルダー及び真空フラスコ装置では、2〜3分間0.6％漂白剤溶液の250mlでsextaの卵。
3. 洗浄あたり250ミリリットル滅菌蒸留H ₂ Oで3-4回漂白剤溶液を排出し、卵を洗うために真空をオンにします。
4. ペトリ皿のふたに入れ新鮮な90ミリメートルろ紙に卵を移し、それらを一緒に彼らはもはや棒になるまで乾燥させます（約20〜30分）。
5. 各コンテナに約40個の卵を置いて、昆虫食とプラスチック容器の底に卵を移す（ 図1A）。卵は湿気によって真菌汚染を防ぐために食事から分離されています。 8時間暗の光周期：16時間明、26で卵℃を維持する。卵が孵化する前に、黄白色に明るくなります。
6. 孵化が完了したら、慎重に底のダイエット（ 図1B）を使用して新しい容器にそれぞれ約25幼虫を移す。その壊れやすい初期の発達段階の間にそれらを傷つけることを避けるためにピンセットを使用して、長い黒のホーンによって各幼虫をピックアップすることが重要です。上記のように2日間インキュベートする。幼虫の死は、この段階では珍しいですが、いくつか死んでいるか、可能性が高く、発達発育を妨げられた幼虫が観察されることがあります。このような昆虫は、さらなる研究から除外され、凍結によって犠牲にされるべきである。
7. 共食い行動を回避するために、食品の小さな断片（ 図1C）を使用して個々の容器に幼虫を移し、上記のようにインキュベートする。昆虫の開発を監視し、食品を交換し、洗浄糞は、OUコンテナのトン隔日彼らは第三幼虫の脱皮を（通常は孵化後6-9日）を受けるまで。これは昆虫の体（ 図1D）に沿って各腹脚とストライプの増加目立つ上に黒いフック状crochetsの外観が特徴、 ^第 4齢幼虫の段階である。幼虫は大きさにかなりばらつきがあるが、典型的には、 ^第 4齢期に入ったときに0.15〜0.4グラムの重量を量ることができる。同様の大きさの幼虫が注射のために選択されるべきである。

2。注射用細菌の調製

1. テストしたい成長期に標準的な手順に従って、テストする細菌株（s）を育てる。
2. 各菌株のペレットを500μlの室温で13,000 rpmで遠心機で2分間回転させて試験する。
3. 1ミリリットル滅菌1Xリンに再懸濁した細胞は、上記のように、再び緩衝生理食塩水（PBS）とペレット。
4. 0.5ミリリットル滅菌1×PBSおよびMEAで細胞を再懸濁懸濁液の光学密度（OD）を確認してください。必要であれば、同じODにすべての懸濁液を希釈します。必要に応じて滅菌増殖培地はまた、1X PBSの代わりにセルの再懸濁および希釈に使用することができる。

3。 ^第 4齢幼虫の注入

1. 各希釈のための新鮮なピペットチップ（ 図2A）を使用して滅菌1X PBSで96ウェルマイクロタイタープレートの6ウェルの最初の菌株の連続10倍希釈液を準備します。各ウェル中の細胞懸濁液の最終容量は注入（昆虫あたり10μl）を加えたプレートに20μlの接種（ステップ3.2および3.7を参照）に必要な量を超えている必要があります。
2. 適切な増殖培地を含むペトリプレートの上部に沿ってスポット10μlを各5段階希釈（10 ^{-6 10〜-2）}用。スポットが中心（ 図2B）に広がるように、板を傾けてください。
3. 氷の上の容器における昆虫食と糞便や場所の昆虫を削除約5分。
4. 滅菌H ₂ O（ 図2C）の1管に続いて70から100パーセントのエタノールの2管で3回ずつ洗浄することによって注射針を消毒する。液体の体積は水没針に十分でなければならない。
5. 血球計数器を用いて顕微鏡下で希釈細胞懸濁液を定量する。接種希望に応じて、適切なマイクロタイターウェル（ 図2D）から10μlを描く。
6. 綿棒は、昆虫の95％エタノールで表面、および腹部prolegsの一つ後ろに角度（45°未満）で昆虫に10mlの細胞懸濁液を注入します。穿刺腸をしないように注意するとちょうど表皮層（ 図2E）の下に内容を注入します。体液の一部喪失（透明、緑、青の液体）が正常であるが、注射部位から出現する粒子状物質と黄色の液体が腸内穿刺の指標である。この問題が発生した場合は、昆虫を犠牲にして再新しい幼虫を得るそれを置く。
7. 最初の注射グループ内の残りの各昆虫のためのステップ3.6を繰り返します。針の滅菌は、汚染が発生しない限り、細菌の同じ希釈率とひずみを注入し、各昆虫の間で必要ではありません。あるいは、繰り返しディスペンサーはサンプル間の注入量でより一貫性のために使用することができる。
8. 細菌の最初の株でそれぞれ昆虫を注入した後、今回はプレートの中央に細胞懸濁液をスポッティングし、それらの底部（ 図2F）に向かって流れさせる、ステップ3.2を繰り返します。適切な温度でプレートをインキュベートし、接種を列挙するためにコロニーをカウントします。この第二のめっき工程では、これが第一及び第二のめっきの間に異種のコロニー数をもたらすような試料は、注入工程中に汚染されていないことを確認するために使用されます。
9. 繰り返し実験における細菌の各株の3.8を通じて3.1を繰り返します。最後に、マスターを使用して滅菌した1×PBSで3月5日虫を注入陰性対照群としてのILE針。 8時間暗の光周期：16時間明、26℃で昆虫をインキュベートする。
10. 注入後の時間をかけて昆虫の生存を監視します。昆虫死が刺激されると随意運動の欠如として特徴付けられる。昆虫はしばしば死亡前に感染中の食欲不振、下痢（水様、黄色の排泄物）、および/または水の損失を（ "発汗"）を示すが、これらの特性は、同様に注目に値するかもしれません。

結果

昆虫死亡率アッセイの代表例を図3に示します。この実験では、昆虫は野生型（ATCC19061）または中間対数期（株当たりn = 6虫）まで成長Xenorhabdus nematophilaの弱毒変異株（LRP ^13）のいずれかの約50コロニー形成単位（CFU）を注射した。昆虫は約72時間観察し、各時点でまだ生きて注入された昆虫のパーセントを記録した。このケースでは、弱毒株は、昆虫殺害でク...

ディスカッション

Mの直接注入ここで説明するように昆虫病原細菌とsextaの幼虫は、細菌の病原性を解析するためのシンプルで効果的な手段として機能します。この方法はまた、別の実験対象および/または条件に合わせて高度に適応可能である。細菌は、注射前に、種々の方法で調製する​​ことができる。 Xの場合にはnematophila、中間対数期に栄養豊富なルリア-ベルターニ（LB）培?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬	会社	カタログ番号	注釈
90ミリメートルろ紙	ワットマン	1001 090
ガラスフィルターホルダー	ミリポア	XX1004700
たばこスズメガ卵	カロライナ生物サプライ	143880
マイマイガダイエット+寒天	MPバイオメディカル	0296029301
5.5オンスプラスチック容器と蓋	ソロカップカンパニー	URC55-0090 PL4-0090
1オンスプラスチック容器と蓋	DARTコンテナ株式会社	100PC 100PCL25
1X PBS			137mMのNaCl、2.7mMのKCl、8mMののNa 2 HPO 4、1.46 mMのKH 2 PO 4、pH7.4の
注射器	ハミルトン	80208	30ゲージ、0.375 "長さ、ポイントスタイル2