細菌分裂機械の超解像イメージング

要約

我々は、細菌のFtsZ-リングの構造、組織、細胞分裂に不可欠な装置を検査する、超解像イメージング法を説明します。この方法は、光活​​性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）画像の定量分析に基づいており、他の細菌の細胞骨格タンパク質に適用することができます。

要約

細菌の細胞分裂がmidcell ^1,2で10以上必須タンパク質の協調アセンブリが必要です。このプロセスの中心には、分割計画^3,4においてFtsZタンパク質によるリング状の上部構造（Z-リング）の形成である。 Z-リングは、複数の一本鎖FtsZのプロトフィラメントで構成されており、Z-リングの内側プロトフィラメントの配置を理解する力発生器^5,6のように、Z-リングアセンブリとその機能のメカニズムへの洞察を提供します。この情報は、従来の蛍光顕微鏡と電子顕微鏡で起因する電流制限にとらえどころのない推移している。従来の蛍光顕微鏡は、光の回折限界（〜200 nm）に起因し、Z-リングの高解像度の画像を提供することができません。電子cryotomographicイメージングは小さなCに散在FtsZのプロトフィラメントが検出されましたcrescentusセル ⁷が、そのようなのようなより大きなセルに適用することは困難である大腸菌または B 枯草 。ここでは、定量的にEの構造組織を特徴づけるために超解像蛍光顕微鏡法、光活性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）のアプリケーションを記述する大腸菌 、Z-リング^8。

PALMイメージングは​​、高空間分解能（〜35 nm）と標的タンパク質の明確な識別を可能にするために、特定のラベルの両方を提供しています。我々は405nmの⁹時に起動したときに赤色蛍光（励起= 561 nm）に緑色蛍光（励起= 488 nm）から切り替える光活性化蛍光タンパク質mEos2とFtsZのラベルが付いた。やし実験中、シングルFtsZ-mEos2分子は確率的に活性化され、単一分子の対応する重心位置が<20 nmの精度で決定されます。 Z-リングの超解像は、すべての検出されたFtsZ-mEos2分子の重心位置を重ね合わせて再構築さ​​れます。 <Pクラス= "jove_content">この方法を用いて、我々は、Z-リングが〜100nmの固定幅を持っており、三次元的に互いに重ならFtsZのプロトフィラメントの緩い束で構成されていることがわかった。これらのデータは、Z-リング¹⁰の細胞周期依存性の変化のさらなる調査のための足がかりを提供し、関心のある他のタンパク質に適用することができます。

プロトコル

1。試料調製

1. ひずみJB281の単一コロニーをLB培地に接種[BW25113 / pJB042（P _ラック ：FtsZ-mEos2）]。 37℃で振とう機で一晩増殖℃、
2. M9 ⁺最少培地[M9塩、0.4％グルコース、2mMのMgSO _4を 、0.1 mMのCaCl _2、MEMアミノ酸やビタミン]に文化1:1,000希釈し、中期対数期（OD ₆₀₀ = 0.2から0.3）に成長室温（RT）でクロラムフェニコール（150μg/ ml）をプレゼンスインチ
3. 20μMのは、（注1を参照）2時間IPTGで文化を誘導する。
4. ペレットのマイクロ遠心（8,000 rpmで、1分）の文化とM9 ⁺等量の再懸濁する。繰り返し。第二再懸濁した後、2時間室温で成長を続けています。
5. 40分間室温でPBS中4％パラホルムアルデヒド液（pH = 7.4）で誘導した培養を修正しました。等容量のPBSでペレット培養再懸濁し、リピート。ライブセルイメージングする場合、等量の固定、ペレット培養、再懸濁しをスキップM9の^- [M9塩、0.4％グルコース、2mMのMgSO _4を 、0.1 mMのCaCl _2、MEMアミノ酸];繰り返し。
6. 再懸濁培養で1:10にゴールドビーズを希釈します。 （ステップ2.4​​を参照）準備イメージング室にサンプルをアプライ。

[1]注：上記の誘導プロトコール（ステップ1.1から1.3までは）株JB281の発現系に最適化されています。詳細な誘導条件は、関心のある他の発現系またはタンパク質によって異なる場合があります。

2。イメージング会議所の組立

1. M9の3％（w / v）のアガロース溶液を作る^{- 。} 40分間ベンチトップヒートブロックで70℃アガロース°Cを溶かす。ストアは、最大5時間までを50℃でアガロースを溶かし。
2. 下向きに電極を有するイメージング室の上半分にきれいmicroaqueductスライドを配置します。灌流チャンネルを覆うようにmicroaqueductスライド上下部ガスケットの位置を合わせます。
3. ガラスの中央に溶けたアガロースの〜50μlをスライド。清潔で乾燥したカバースリップと直ちにトップアガロースゲル滴。ゲルは室温で30分間凝固させる。
   1. カバーガラスをきれいにするには：セラミックホルダーでカバーガラスを手配し、アセトン、エタノール、ガラスジャーに1M KOHの浴場を回転させることで20分間超音波洗浄します。のdH _{2 O}に単一の超音波処理し、続いて9 sonicationsの合計のため、サイクルを3回繰り返す新鮮なのdH _{2 O}で洗浄カバースリップを保管使用前に、ろ過された空気と乾いたカバーガラスを吹く。
4. 慎重microaqueductスライドにゲルパッドを残して、カバースリップを削除します。直ちにゲルパッドの上部に細胞培養サンプルを1μl（ステップ1.6を​​参照）を追加します。溶液がゲルパッドで吸収されるように、約2分間待ちます。新しい、きれいな乾いたカバースリップを持つトップゲルパッド。製造元の指示に従って、全体のイメージングチャンバーを組み立てます。

3。画像収集

1. 顕微鏡、カメラとレーザーの電源をオンにします。 MetaMorphソフトを開く陶器（Molecular Devices社）。
2. イメージングパスの適切な励起/発光フィルタ（ 図1）を配置します。
3. それに応じてレーザーパワーおよび取得の設定を行います。
   1. 488 nmのレーザー= 15 MW（注2を参照）
   2. 561 nmのレーザー= 75 mWの
   3. 405 nmのレーザー= 2 mWで±減光フィルター （注3を参照）
4. 補完的なステージアダプタを介してステージにイメージング室をロックします。
5. 均一にすべての3つのレーザーで照らされている適切な撮像領域（100×100ピクセル）を指定します。
6. 近接セルと基準マーカー（ゴールドビーズ）の両方が含まれていますが、重複しないサンプル領域を識別します。
7. カバーガラスに最も近い細胞の表面に焦点を当てています。 50ミリ秒の積分時間で1明視野画像を取得します（ 図3AI）のサンプルに焦点を0.5μmに移動します。
8. 488-nから励起によるアンサンブル緑色蛍光画像を取得メートルレーザーは、50ミリ秒の積分時間（ 図3Aii）を使用。
9. 405 nmおよび561 nmのレーザーからの連続的な照明と赤のチャンネルでストリーミングビデオを取得します。固定した細胞では、50ミリ秒のフレームレートは1,000フレーム〜10％上昇させ405 nmのレーザーパワーで20,000フレーム（〜17分の合計）の合計（注＃4を参照）のために使用されます。生きている細胞は、10ミリ秒のフレームレートを一定に405 nmのレーザーパワーで3000フレーム（約30秒合計）の合計のために使用されます。
10. 細胞の下面にフォーカスを移動し、ステップ3.7のような別の明視野画像を取得する。

[2]注：セルの緑色蛍光の積分強度は、細胞内で発現FtsZ-mEos2分子の総数に正比例します。 488 nmの励起パワーとアンサンブル蛍光買収の設定が異なるセル内の相対FtsZ-mEos2発現レベルを比較することができるように、すべての細胞のための一定に保たれるべきです。

ontent "> [3]注：固定セルは、個々の分子を正確に識別することができるように遅い活性化率を達成するために所定の位置にニュートラルデンシティ（ND）フィルター（ 図1、光コンポーネント＃5）で撮像する。回折限界の領域で同時にアクティブにされて2分子の低確率を維持しながら、イメージング、細胞が活性化率を高めるために生きるときにNDフィルターが除去された。速い速度は、ライブセルイメージングに適用総取得時間を短縮するために必要とされる、それによって時間にZ-リングを "凍結"とセルに光損傷の効果を制限する。

[4]注：取得したフレームの数が当社のシステムに最適化されており、特定の細胞構造に依存していた、密度のラベリング活性化率と蛍光団のプール全体を排気するかどうかは、分析のために重要である。生きた細胞では、TIのように短期間でローカライズ十分な数を得ることが重要である私はできるだけ細胞構造の動きによる画像のブレを防ぐことができます。

4。 PALM画像構築

1. 検出された各スポットの重心位置を決定します。
   1. MATLAB（MathWorks社、株式会社）に画像スタックをロードします。
   2. すべての基準ビーズを除いた1セルの周囲の領域に画像スタックをトリミング。
   3. バックグラウンドレベルを超えるが、平均スポット強度を下回っているスポットの検出のために強度のしきい値を選択します。我々は、150フレームウィンドウを使用して最大強度の平均値を算出することで、実験を通じてバックグラウンドレベルの変動を考慮する。各フレームの強度のしきい値は、実行中の平均値から補間されます。
   4. 各フレームからそれぞれのしきい値を減算します。将来のスポットがしきい値以上の強度を持つ3つの隣接するピクセルとして識別されます。
   5. 二次元Gaussiaにそれぞれの将来のスポットの蛍光強度を合わせるn個の関数[式＃1]非線形最小二乗アルゴリズム（ 図2）を使って 。各スポットのローカライズ精度が検出された光子の総数[式＃2]を使用して計算されます。 20nmの（固定された細胞）または45ナノメートル（生きた細胞）を超えるローカリゼーション精度で任意の悪いフィットスポットは（ノート＃5を参照）は破棄されます。重複エミッタが原因の可能性平均強度の2倍以上の強度を持つ任意のスポットが、また廃棄されます。
   6. 固定した細胞は、その重心位置の45 nm以内で任意の場所を無視して同じ分子の繰り返し観測を削除 6フレーム以下でそれに先行した他のスポットの。生きている細胞は、全てのスポットは保持されます。
2. 基準マーカの動きを使用して、サンプル·ドリフトをキャリブレーションします。
   1. 基準マーカの周りに10×10画素領域外作物。
   2. 各フレームから4.1.3で求めたそれぞれのしきい値を減算します。
   3. それぞれの強度プロファイルに適合最小二乗フィッティングアルゴリズムを介してフレームには2次元ガウス形を仮定。
   4. フレーム1に対して相対的に重心位置のずれを計算します。
3. 4.2で計算された適切な試料ドリフトを4.1で識別された各ユニークな分子の重心位置を修正してください。 3.7と3.10で取得明視野画像を比較してください。細胞は基準マーカーに対して相対的に移動することが観察されている場合、データは放り出されます。
4. 15x15 nmの画素で構成される単一のイメージ上のすべての補正された重心位置を重ね合わせる。ローカライズの精度[式＃2]に等しい標準偏差が重心位置を中心と単位面積、2次元ガウスプロファイルとしてそれぞれユニークな分子をプロットします。画素の強度は、そのピクセルに分子を見つける可能性（ 図3Aiv）に比例した確率密度マップ、この結果。
5. アンサンブル画像にPALM画像を比較。
   1. それから再セントロ4.4のようですが、150×150 nmの画素と250nmに等しい標準偏差を持つ平面上のID位置。これは回折限界、3.8（ 図3Aiii）で取得アンサンブル画像と比較するために使用することができ、回折限界像を模倣PALM画像を生成する。
   2. 検出された分子は、全人口の代表的なものであることを確認するには、両方のイメージが同じような形状の構造を示していることを確認するために実験的なアンサンブル蛍光画像（ 図3Aii、ステップ3.8）を用いて再構成されたアンサンブル画像（ 図3Aiii、ステップ4.5.1）を比較、向きや相対強度。

[5]注意：最低限必要なローカリゼーションの精度が指定されているサンプルのためにすべての分子の精度をプロットして、適切なカットオフを選択することにより、各撮像法について経験的に決定した。

5。 PALM画像解析

1. Z-リングWidtを測定hと直径。
   1. なるように垂直に配向し、細胞の長軸方向（ 図4A）にPALM画像を回転させます。
   2. Z-リングを含む細胞外領域の作物。
   3. 細胞の長軸に沿った強度分布を投影することによって累積強度を計算します。
   4. ガウス分布に強度プロファイルに適合。リング幅はフィットガウス分布（ 図4B）の半値全幅（FWHM）として定義されています。
   5. セルの短軸に沿って5.1.2の累積強度プロファイルを投影。リング径は強度プロファイルの全長（ 図4C）として定義されています。
2. （注＃6を参照）FtsZ密度をプロットする。
   1. （4.4）のように重心位置を再プロットが、それぞれのユニークな分子が1の値を与えられ、その重心位置に対応する単一の画素に割り当てられるようガウシアンプロファイルなし。このように、各々の強度のピクセルは、そのピクセルで検出分子の総数を表します。密度PALM画像も等高線図（ 図5E）として可視化することができる。
3. 空間分解能を決定する。
   1. 理論的に達成可能な空間分解能：検出されたすべての分子の平均決定ローカリゼーション精度を使用して、すべてのサンプルで代表PSFを作成し、半値幅（式第3）を計算します。
   2. 実験的に達成された空間分解能：同じ分子の繰り返し観測間の平均変位を計算します。

[6]注：我々は、細胞/ガラス界面上記の薄層（〜200 nm）の活性化と励起を制限するために、内部全反射パーム（TIR-PALM、 図1および図5）を用いた。カバースリップに近い膜に関連付けられている唯一のFtsZ分子が検出されるようにします。

結果

図3Aivに示すが、上述のPALMイメージング法から生成Z-リングの二次元、超解像レンダリングです。以下では、私たちがそれらから得られる定性的および定量的な情報を要約したものです。

定性的には、我々は、Z-リング（ 図3A-DIIと iv を比較）従来の蛍光画像では区別できないので、複数の構成（シングルバンドまたはヘ...

ディスカッション

PALMのイメージは、他の手段によって達成することは困難である標的タンパク質分子の分布および配置の詳細な分析を可能にする、セル内の分子数と位置に関する情報が含まれています。以下では、PALM画像の生物学的関連性を維持しながら、正確な定量的情報を抽出するために取られるべきである注意事項を概説しています。我々はまた、最高のライブ対固定された細胞を用いて得ることが?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬/材料の名称	会社	カタログ番号	注釈
50×MEMアミノ酸	シグマ	M5550
100×MEMビタミン	シグマ	M6895
IPTG	メディアテック	46から102-RF
16％パラホルムアルデヒド	電子Micrsocopyサイエンス	15710-S
SeaPlaque GTGアガロース	Lonzo	50111
50nmのゴールドビーズ	ミクロス-ナノスフェア	790113-010
FCS2イメージング商工会議所	Bioptechs
ステージアダプター	ASI	I-3017
倒立顕微鏡	オリンポス	IX71
1.45 NAは、60倍対物	オリンポス
IXON EMCCDカメラ	アンドール·テクノロジー	DU897E
488 nmのサファイアレーザー	コヒーレント
561 nmのサファイアレーザー	コヒーレント
405 nmのCUBEのレーザー	コヒーレント