Super-Resolution Imaging der Bakterien Abteilung Machinery

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine super-resolution imaging Methode, um die strukturelle Organisation des bakteriellen FtsZ-Ring, ein wesentlicher Vorrichtung zur Zellteilung zu untersuchen. Diese Methode basiert auf quantitativen Analysen von photoaktivierten Lokalisierungs-Mikroskopie (PALM) Bilder und kann auf andere bakterielle Proteine ​​des Zytoskeletts angewendet werden.

Zusammenfassung

Bakterielle Zellteilung erfordert die koordinierte Anordnung von mehr als zehn essentiellen Proteine ​​bei midcell ^1,2. Im Mittelpunkt dieses Verfahrens ist die Bildung eines ringähnlichen Suprastruktur (Z-Ring) durch die FtsZ Protein bei der Teilung Plan ^3,4. Der Z-Ring besteht aus mehreren einsträngige FtsZ Protofilamenten, und das Verständnis der Anordnung der Protofilamente innerhalb der Z-Ring wird einen Einblick in den Mechanismus der Z-Ring Montage und ihrer Funktion als Krafterzeuger ^5,6 geben. Diese Information ist bisher unklar in herkömmlichen Fluoreszenz-Mikroskopie und Elektronenmikroskopie aufgrund der aktuellen Einschränkungen. Konventionellen Fluoreszenzmikroskop ist nicht ein hochauflösendes Bild des Z-Ring aufgrund der Beugungsgrenze des Licht (~ 200 nm) bereitzustellen. Electron cryotomographic Bildgebung erkannt hat FtsZ Protofilamente in kleinen C. verstreut crescentus Zellen ^7, ist jedoch schwierig, zu größeren Zellen wie geltenE. coli oder B. subtilis. Hier haben wir die Anwendung eines Super-Resolution-Fluoreszenz-Mikroskopie-Methode zu beschreiben, Photoaktiviertes Localization Microscopy (PALM), quantitativ zu charakterisieren die strukturelle Organisation des E. coli Z-Ring ^8.

PALM Bildgebung bietet sowohl eine hohe räumliche Auflösung (~ 35 nm) und spezifische Kennzeichnung für die eindeutige Identifizierung von Zielproteinen zu ermöglichen. Wir markierten FtsZ mit dem photoaktivierbaren Fluoreszenzprotein mEos2, die von grünen Fluoreszenz (Anregung = 488 nm) nach rot schaltet Fluoreszenz (Anregung = 561 nm) bei Aktivierung bei 405 nm ^9. Während eines Experiments PALM werden einzelne FtsZ-mEos2 Moleküle stochastisch aktiviert und die entsprechenden Zentroidpositionen der einzelnen Moleküle sind mit <20 nm Genauigkeit bestimmt. Ein Super-Resolution-Bild der Z-Ring wird dann durch die Überlagerung der Zentroidpositionen aller erkannten FtsZ-mEos2 Moleküle rekonstruiert. <p class = "jove_content"> Unter Verwendung dieses Verfahrens wurde festgestellt, dass der Z-Ring einen festen Breite von ~ 100 nm aufweist und aus einem Bündel von losen FtsZ Protofilamenten, die miteinander überlappen, in drei Dimensionen besteht. Diese Daten liefern ein Sprungbrett für weitere Untersuchungen der Zellzyklus abhängigen Veränderungen der Z-Ring ¹⁰ und kann auf andere Proteine ​​von Interesse angewendet werden.

Protokoll

Ein. Probenvorbereitung

1. Beimpfen LB Medium mit einer Einzelkolonie des Stammes JB281 [BW25113 / pJB042 (P _Lac: FtsZ-mEos2)]. Über Nacht wachsen in einem Schüttler bei 37 ° C.
2. Verdünnen Sie die Kultur 1:1,000 in M9 ⁺ minimal media [M9 Salze, 0,4% Glucose, 2 mM MgSO _4, 0,1 mM CaCl _2, MEM Aminosäuren und Vitamine] und wachsen bis zur mittleren logarithmischen Phase (OD ₆₀₀ = 0,2-0,3) in Gegenwart von Chloramphenicol (150 ug / ml) bei Raumtemperatur (RT).
3. Erbrechen Kultur mit 20 uM IPTG für 2 Stunden (siehe Anmerkung Nr. 1).
4. Pellet Kultur in Mikrozentrifuge (8.000 UpM, 1 min) und Resuspension in einem gleichen Volumen von M9 ^+; wiederholen. Nach der zweiten Resuspension weiterhin Wachstum bei RT für 2 h.
5. Fix induzierten Kultur mit 4% Paraformaldehyd in PBS (pH = 7,4) bei RT für 40 min. Pelletkultur und resuspendieren in einem gleichen Volumen von PBS; wiederholen. Wenn Bildgebung lebender Zellen, überspringen Fixierung, Pellet Kultur und resuspendieren mit dem gleichen VolumenM9 ^- [M9 Salze, 0,4% Glucose, 2 mM MgSO _4, 0,1 mM CaCl _2, MEM Amino Acids]; wiederholen.
6. Verdünnen Goldperlen 1:10 mit resuspendierten Kultur. Bewerben Probe vorbereiteten Bildgebung Kammer (siehe Schritt 2,4).

[1] Hinweis: Die obige Induktion Protokoll (Schritte 1.1-1.3) hat für den Ausdruck System der Belastung JB281 optimiert. Detaillierte Induktionsbedingungen für andere Expressionssysteme oder Proteine ​​von Interesse zu variieren.

2. Versammlung der Imaging Chamber

1. Einen 3% (w / v) Agarose-Lösung in M9 ^-. Melt Agarose bei 70 ° C in einer Bank-Oberhitze Block für 40min. Laden geschmolzen Agarose bei 50 ° C für bis zu 5 Stunden.
2. Ein sauberes microaqueduct Folie in der oberen Hälfte der Abbildungskammer mit den Elektroden nach unten. Richten Sie die untere Dichtung auf der microaqueduct slide so die Durchblutung Kanäle abzudecken.
3. Anwenden ~ 50 ul der geschmolzenen Agarose zur Mitte des GlasesRutsche. Unmittelbar oben auf der Agarosegel Tröpfchen mit einem sauberen, trockenen Deckglas. Sollte das Gel bei Raumtemperatur für 30 min verfestigt.
   1. Um Deckgläser reinigen: arrangieren Deckgläser in einer keramischen Halter und beschallen für 20 min in rotierenden Bäder von Aceton, Ethanol und 1M KOH in Gläsern. Wiederholen Zyklus dreimal für insgesamt 9 sonications, gefolgt von einem einzelnen Beschallung in dH ₂ O. Bewahren Sie die gereinigten Deckgläser in frischem dH ₂ O. Vor dem Gebrauch trocken blasen Deckgläser mit gefilterter Luft.
4. Entfernen Sie vorsichtig das Deckglas, so dass Gel-Pad auf der microaqueduct Folie. Sofort im 1 ul Zellkulturprobe (siehe Schritt 1,6) an die Spitze des Gel-Polster. Warten für ca. 2 Min., wodurch Lösung durch das Gel-Pad absorbiert werden. Top-Gel-Pad mit einem neuen, sauberen, trockenen Deckglas. Montieren Sie den gesamten Imaging-Kammer nach den Anweisungen des Herstellers.

3. Image Acquisition

1. Schalten Sie das Mikroskop, Kamera und Laser. Öffnen MetaMorph weichenware (Molecular Devices).
2. Zeigen entsprechender Anregung / Emission Filter in der Bildgebung Pfad (Abbildung 1).
3. Set Laserleistungen und Akquisition Einstellungen entsprechend an.
   1. 488-nm-Laser = 15 mW (siehe Hinweis Nr. 2)
   2. 561-nm-Laser = 75 mW
   3. 405-nm-Laser = 2 mW ± Graufilter (Siehe Anmerkung # 3)
4. Sperren Bildgebung Kammer in der Bühne über den ergänzenden Tischadapters.
5. Eine geeignete Bildgebung Region (100x100 Pixel), die homogen von allen drei Laser beleuchtet wird.
6. Identifizieren eines Probenbereichs, der beide Zellen und Bezugsmarkierungen (Goldkügelchen) in enger Nachbarschaft aber nicht überlappenden enthält.
7. Fokus auf der Oberfläche von Zellen am nächsten zu dem Deckglas. Erwerben Sie ein Hellfeld-Bild mit 50 ms Integrationszeit und den Fokus 0,5 um in die Probe (Abbildung 3Ai).
8. Erwerben Ensemble grüne Fluoreszenz Bild mit Anregung aus dem 488-n m-Laser mit einer 50 ms Integrationszeit (Abbildung 3Aii).
9. Erwerben Sie Streaming-Video in roten Kanal mit kontinuierlicher Beleuchtung von 405-nm-und 561-nm-Laser. Für fixierten Zellen wird ein 50 ms Frame-Rate für eine Gesamtmenge von 20.000 Frames (~ 17 min insgesamt) mit dem 405-nm Laserleistung hochgefahren um ca. 10% alle 1.000 Frames (siehe Anmerkung Nr. 4) verwendet. Für lebende Zellen ist ein 10 ms Frame-Rate für insgesamt 3000 Frames (~ 30 s gesamt) bei einem konstanten 405-nm Laserleistung verwendet.
10. Verschieben des Fokus wieder auf die untere Oberfläche der Zellen und andere erwerben Hellfeld Bild wie in Stufe 3.7.

[2] Bemerkung: Die integrierte Intensität der grünen Fluoreszenz einer Zelle ist direkt proportional zu der Gesamtzahl der-FtsZ mEos2 Moleküle in der Zelle exprimiert wird. Die 488-nm Anregungsleistung und Ensemble Fluoreszenz Akquisition Einstellungen konstant gehalten werden für alle Zellen, so dass die relative FtsZ-mEos2 Expressionsniveaus in verschiedenen Zellen verglichen werden können.

nhalt "> [3]. Hinweis: Die fixierten Zellen werden mit dem Neutral Density (ND)-Filter (Abbildung 1, Optical Component # 5) an Ort und Stelle abgebildet, um eine langsame Aktivierung Rate, so dass jedes einzelne Molekül genau identifiziert werden können erreichen die ND-Filter entfernt wird, wenn Echtzeit-Bildgebung Zellen, um die Aktivierung zu erhöhen, unter Beibehaltung einer geringen Wahrscheinlichkeit von zwei Molekülen, die gleichzeitig in einem beugungsbegrenzten Bereich aktiviert. Je schneller sich die an lebenden Zellen benötigt wird, um die gesamte Messzeit zu verringern, wodurch "Einfrieren" die Z-Ring in der Zeit und die Begrenzung der Wirkung von Lichtschäden an der Zelle.

[4] Bemerkung: Die Zahlen von Rahmen akquiriert wurden für unser System optimiert und sind abhängig von der speziellen zellularen Struktur, Etikettieren Dichte, Aktivierungsrate und ob Absaugen der gesamte Pool von Fluorophoren für die Analyse wichtig. In lebenden Zellen, ist es wichtig, eine ausreichende Anzahl von Lokalisierungen in einer so kurzen Frist von ti zu erhaltenmir als möglich zu vermeiden, die Unschärfe des Bildes aufgrund einer Bewegung der Zellstruktur.

4. PALM Bild Construction

1. Bestimmen Schwerpunkt Position jedes festgestellte Lichtpunkt.
   1. Laden Sie das Bild Stapel in Matlab (MathWorks, Inc).
   2. Beschneiden Bildstapels auf einen Bereich um eine Zelle, die alle Fiducial Kügelchen ausschließt.
   3. Wählen einer Intensität Schwelle für Spotdetektion über dem Hintergrund Ebene, aber unterhalb der durchschnittlichen Spotintensität ist. Wir berücksichtigen für die Variation in Hintergrundpegel während eines Experiments durch Berechnung des laufenden Durchschnitts der maximalen Intensität unter Verwendung eines Frame-Fensters 150. Die Intensität Schwellwert für jeden Rahmen wird dann interpoliert aus den laufenden Durchschnittswerte.
   4. Subtrahieren Sie die jeweilige Schwelle von jedem Rahmen. Prospective Spots als drei benachbarte Pixel mit Intensitäten oberhalb der Schwelle identifiziert.
   5. Den Fluoreszenzintensität jedem Interessenten vor Ort zu einem zweidimensionalen Gaussian Funktion [Gleichung # 1] unter Verwendung eines nichtlinearen Least-Squares-Algorithmus (Abbildung 2). Die Lokalisierung Präzision jedes Spots wird anhand der Gesamtzahl der detektierten Photonen [Gleichung Nr. 2]. Jede schlecht fit Spot mit einer Lokalisierung Genauigkeit größer als 20 nm (fixierten Zellen) bzw. 45 nm (lebende Zellen) wird verworfen (siehe Anmerkung Nr. 5). Jeder Spot mit einer Intensität größer als das Zweifache der mittleren Intensität, möglicherweise aufgrund überlappender Emittern, wird ebenfalls verworfen.
   6. Für fixierten Zellen zu entfernen wiederholte Beobachtungen des gleichen Moleküls durch Nichtbeachtung jede Stelle, deren Schwerpunkt Position ist innerhalb von 45 nm einer anderen Stelle, die sie von 6 Frames oder weniger voraus. Für lebende Zellen, werden alle Stellen erhalten.
2. Kalibrieren Probe Drift mit Bezugspunktmarkiereinrichtungsanordnung Bewegung.
   1. Crop aus einem 10x10 Pixel Bereich um eine Bezugspunktmarkiereinrichtungsanordnung.
   2. Subtrahieren Sie die jeweilige Schwelle in 4.1.3 aus jedem Rahmen bestimmt.
   3. Den Intensitätsprofil in jedemRahmen über kleinsten Quadrate Anpassungsalgorithmus Annahme einer zweidimensionalen gaußschen Form.
   4. Berechnen Verschiebung zwischen Zentroidpositionen relativ zu dem Rahmen 1.
3. Korrigieren des Schwerpunktes Position jedes einzigartigen Molekül in 4,1 mit der entsprechenden Probe in 4,2 Drift berechnet identifiziert. Vergleichen Sie die Hellfeld Bilder in 3,7 und 3,10 erworben. Wenn Zellen beobachtet werden, um relativ zu den Bezugsmarkierungen bewegen, werden die Daten verworfen.
4. Überlagern alle korrigierten Zentroidpositionen auf einem einzigen Bild von 15x15 nm Pixeln. Plotten jedes einzigartigen Molekül als Einheit-, zwei-dimensionalen Gauß-Profil an der Schwerpunktposition mit einer Standardabweichung gleich der Lokalisierungsgenauigkeit [Gleichung # 2] zentriert. Dies führt zu einer Wahrscheinlichkeitsdichte Karte, wo die Intensität eines Pixels proportional ist zur Wahrscheinlichkeit des Findens eines Moleküls in diesem Pixel (Abbildung 3Aiv).
5. Vergleicht PALM Bilder Ensemble Bildern.
   1. Replot das centroID Positionen wie in 4.4, aber in einer Ebene mit 150x150 Pixel nm und einer Standardabweichung von höchstens 250 nm aufweisen. Dies erzeugt ein Bild, das einen PALM beugungsbegrenzte Abbildung, die verwendet werden, um an den beugungsbegrenzten, Ensemble Bild in 3,8 (Abbildung 3Aiii) erworben werden kann Vergleichen nachahmt.
   2. Um zu bestätigen, dass die detektierten Moleküle repräsentativ für die gesamte Bevölkerung sind, vergleichen Sie das rekonstruierte Ensemble Bild (Abbildung 3Aiii, Schritt 4.5.1) mit dem experimentellen Ensembles Fluoreszenz Bild (Abbildung 3Aii, Schritt 3,8), um zu bestätigen, dass beide Bilder Strukturen ähnlicher Gestalt zeigen , Orientierung und relative Intensität.

[5] Hinweis: Die mindestens erforderliche Lokalisierung Präzision wurde empirisch für jede bildgebenden Verfahren durch Auftragen der Genauigkeiten aller Moleküle für eine bestimmte Probe und die Auswahl eines geeigneten Cutoff bestimmt.

5. PALM Image Analysis

1. Mess-Z-Ring Width und Durchmesser.
   1. Drehen Sie den PALM Bild, um so vertikal Orientierung der langen Achse der Zelle (Abb. 4A).
   2. Crop aus dem zellulären Bereich, der die Z-Ring.
   3. Berechnen des kumulativen Intensität durch Projizieren eines Intensitätsprofil entlang der Zelle Längsachse.
   4. Montieren des Intensitätsprofils einer Gaußschen Verteilung. Die Ringbreite ist als die volle Breite halbes Maximum (FWHM) der angepassten Gaußverteilung (4B) definiert.
   5. Projizieren Sie das kumulative Intensitätsprofil 5.1.2 entlang der Zelle kurzen Achse. Der Ringdurchmesser ist als die volle Länge des Intensitätsprofils (4C) definiert.
2. Plotten FtsZ Dichte (siehe Anmerkung 6).
   1. Replot die Zentroidpositionen wie in (4.4), aber ohne das Gauss-Profil, so dass jede einmalige Molekül einen Wert von 1 gegeben wird und übertragen auf ein einzelnes Pixel entsprechend seiner Schwerpunktsposition. Auf diese Weise kann die Intensität von jedemPixel repräsentiert die Gesamtzahl der Moleküle in diesem Pixel detektiert. Die Dichte PALM Bild kann auch visualisiert werden als Kontur-Plot (Abbildung 5E).
3. Bestimmung der räumlichen Auflösung.
   1. Theoretisch-erreichbare räumliche Auflösung: Erstellen Sie eine repräsentative PSF für die gesamte Stichprobe mit dem durchschnittlichen ermittelt Lokalisierungsgenauigkeit aller erkannten Moleküle und die Berechnung der FWHM (Gleichung # 3).
   2. Experimentell erreicht räumliche Auflösung: Berechnung der durchschnittlichen Verschiebung zwischen repeat Beobachtungen desselben Moleküls.

[6] Bemerkung: Wir verwendeten Totalreflexion PALM (TIR-PALM, Abbildung 1 und 5), um die Aktivierung und Erregung, um eine dünne Schicht (~ 200 nm) oberhalb der Zelle / Glas-Grenzfläche zu beschränken. so dass nur FtsZ Moleküle mit der Membran am nächsten zu dem Deckglas assoziiert erkannt werden.

Ergebnisse

Veranschaulicht in 3Aiv ist eine zweidimensionale, Superauflösung Rendering der Z-Ring aus der PALM Bildgebungsverfahren oben beschrieben erzeugt. Im Folgenden fassen wir qualitative und quantitative Informationen, die von ihnen gewonnen werden können.

Qualitativ beobachteten wir, dass die Z-Ring ein unregelmäßiger Struktur, die mehrere Konfigurationen (einzelnes Band oder schraubenförmigen Lichtbogens), die nicht in herkömmlichen unterscheidbar Fluoreszenzbilder (verg...

Diskussion

PALM Bilder enthalten Informationen über Molekül Zählungen und Positionen innerhalb einer Zelle, so dass detaillierte Analyse der Verteilung und Anordnung der Target-Protein-Moleküle, die nur schwer mit anderen Mitteln erreichen. Nachfolgend skizzieren wir Vorsichtsmaßnahmen getroffen, um eine genaue quantitative Informationen zu extrahieren und gleichzeitig die biologische Relevanz der PALM Bilder werden sollte. Wir auch die Informationen, die am besten erhalten werden kann mit live vs fixierten Zellen. Schließli...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenz / Material	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
50 x MEM Amino Acids	Sigma	M5550
100 x MEM Vitamine	Sigma	M6895
IPTG	Mediatech	46-102-RF
16% Paraformaldehyd	Electron Micrsocopy Sciences	15.710-S
SeaPlaque GTG Agarose	Lonzo	50111
50 nm Gold Perlen	Microspheres-Nanospheres	790113-010
FCS2 Imaging Chamber	Bioptechs
Stufe Adapter	ASI	I-3017
Inverses Mikroskop	Olymp	IX71
1,45 NA, 60x Objective	Olymp
IXON EMCCD Kamera	Andor Technology	DU897E
488-nm Sapphire Laser	Kohärent
561-nm Sapphire Laser	Kohärent
405-nm CUBE Laser	Kohärent